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Vps4A对肝癌细胞SMMC-7721的Wnt途径的影响 被引量:1
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作者 韩庆芳 闵军 +2 位作者 韦金星 谢吉艳 吕丽虹 《岭南现代临床外科》 2016年第2期195-198,共4页
目的探讨Vps4A对肝癌细胞SMMC-7721中Wnt途径的影响。方法构建过表达Vps4A的SMMC-7721细胞稳定株,通过RT-q PCR的方法检测19个WNT基因的转录水平的变化,进一步通过Western blot及检测相关下游基因Notch2的变化进行确定。结果在SMMC-7721... 目的探讨Vps4A对肝癌细胞SMMC-7721中Wnt途径的影响。方法构建过表达Vps4A的SMMC-7721细胞稳定株,通过RT-q PCR的方法检测19个WNT基因的转录水平的变化,进一步通过Western blot及检测相关下游基因Notch2的变化进行确定。结果在SMMC-7721中,经典Wnt亚型Wnt10a和Wnt10b的m RNA水平较高,而在过表达Vps4A之后,其蛋白及m RNA水平均显著下降。同时,在过表达Vps4A细胞株中,与经典Wnt通路相关的下游靶基因Notch2在转录及表达水平同样明显下调。结论Vps4A选择性抑制肝癌细胞SMMC-7721的经典Wnt/Notch2途径。 展开更多
关键词 vps4a 肝癌 WNT NOTCH2
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下调VPS4A表达对食管鳞癌恶性生物学行为影响的实验研究
2
作者 徐冰 陈婷婷 +2 位作者 陈慧 孙新臣 成红艳 《临床肿瘤学杂志》 CAS 2021年第10期865-870,共6页
目的探讨VPS4A对食管鳞癌进展及放射敏感性的影响。方法转染靶向VPS4A的短发夹RNA(shRNA)慢病毒干扰载体至人食管鳞癌细胞Kyse150和Eca109,构建食管鳞癌细胞VPS4A低表达模型,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blotting验证转染效率... 目的探讨VPS4A对食管鳞癌进展及放射敏感性的影响。方法转染靶向VPS4A的短发夹RNA(shRNA)慢病毒干扰载体至人食管鳞癌细胞Kyse150和Eca109,构建食管鳞癌细胞VPS4A低表达模型,采用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blotting验证转染效率。将食管鳞癌分为对照组(NC组)和干扰组(shVPS4A),并且联合辐照,通过平板克隆形成试验检测各组细胞增殖情况;通过流式细胞术以及transwell实验检测VPS4A表达对细胞凋亡和侵袭迁移能力的影响;裸鼠皮下瘤模型用于实验结果的体内验证。结果与NC组比较,shVPS4A组VPS4A基因和蛋白表达水平明显下降(P<0.05);shVPS4A组在0、2、4、6、8 Gy剂量点的克隆集落数目均少于NC组,差异有统计学意义(P<0.05);对照组Eca109细胞0 Gy和8 Gy凋亡率为(4.00±0.17)%、(13.60±0.53)%,而下调VPS4A表达后0 Gy和8 Gy凋亡率为(8.03±0.17)%、(18.84±0.58)%;对照组Kyse150细胞0 Gy和8 Gy凋亡率为(3.95±0.13)%、(14.82±0.32)%,而下调VPS4A表达后0 Gy和8 Gy凋亡率分别为(7.81±0.29)%、(18.94±0.34)%。shVPS4A组Eca109细胞和Kyse150细胞迁移、侵袭细胞数均低于NC组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,shVPS4A组E-cadherin表达升高,N-cadherin和Vimentin表达降低。裸鼠体内成瘤实验结果显示shVPS4A组瘤体质量明显小于NC组。结论下调VPS4A表达可以提高食管鳞癌细胞的辐射敏感性,促进细胞凋亡以及抑制其侵袭迁移能力,VPS4A有潜力成为食管癌治疗新靶标。 展开更多
关键词 食管鳞癌 vps4a 放射敏感性 凋亡 侵袭 迁移
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猪轮状病毒VP4单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定
3
作者 赵佳莉 卞贤宇 +9 位作者 宋家鹏 王晨 汤学超 李运川 周金柱 朱雪蛟 陶然 董海龙 张雪寒 李彬 《中国农业科学》 北大核心 2026年第1期220-232,共13页
【背景】猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)是导致新生仔猪及幼龄仔猪病毒性腹泻的关键病原体之一,其感染可引发宿主严重的胃肠道功能紊乱,临床表现为脱水、腹泻甚至死亡,对全球养猪业造成巨大经济损失。VP4蛋白是PoRV病毒粒子表面关... 【背景】猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)是导致新生仔猪及幼龄仔猪病毒性腹泻的关键病原体之一,其感染可引发宿主严重的胃肠道功能紊乱,临床表现为脱水、腹泻甚至死亡,对全球养猪业造成巨大经济损失。VP4蛋白是PoRV病毒粒子表面关键的结构蛋白之一。VP4蛋白经胰蛋白酶水解后可生成VP8和VP5两个功能亚基,它们在病毒感染宿主细胞的初始阶段发挥核心作用,介导病毒吸附宿主细胞受体和随后的膜穿透过程。同时,VP4蛋白也是激发宿主免疫反应的重要靶抗原。然而,目前针对PoRV VP4蛋白的特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)研究相对匮乏,限制了相关诊断方法和新型疫苗的研发。【目的】制备针对PoRV VP4蛋白的mAb,在此基础上,对这些单克隆抗体进行全面的生物学特性分析,包括反应性、抗原表位类型(构象依赖型或线性)、亚型鉴定以及关键的中和活性评估,精确鉴定VP4蛋白上具有重要功能意义的抗原表位区域,为PoRV感染的精准诊断和新型疫苗设计提供支撑。【方法】以纯化的VP4*P23重组蛋白免疫BALB/c小鼠,运用脾细胞融合技术筛选杂交瘤细胞株,通过Western blot、间接免疫荧光(IFA)、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)鉴定单克隆抗体反应性,采用间接ELISA评估单抗对构象的敏感性。最后构建VP5蛋白的不同截短体鉴定靶向的抗原表位区域,通过体外中和实验评估VP5单抗的中和能力。【结果】成功获得26株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IgM等多种亚型,其中轻链类型以κ链为主。在获得的26株单抗中,有15株被证实能够与天然的PoRV病毒粒子发生特异性反应(通过IFA和IPMA检测)。间接ELISA检测显示,mAb11、14、15、23为构象不敏感型单抗,mAb16、17、18、19、21、24、25、26为构象敏感型单抗,值得注意的是,mAb1、2、22这3株单抗在抗原变性后反应性反而增强。Western blot分析进一步聚焦于识别线性表位的单抗(mAb11,14,15),结果显示它们均能特异性识别VP5蛋白上约300—360位氨基酸区域内的线性表位,可能针对同一抗原表位。然而,体外中和试验评估表明这3株单抗对PoRV毒株无中和作用。【结论】成功制备多株靶向PoRV VP4蛋白的单克隆抗体,并鉴定了它们与天然病毒结合的能力。通过系统的表征,不仅明确了单抗的亚型分布和轻链类型,更重要的是对单抗的抗原识别特性进行了深入解析:成功区分了构象敏感型与构象不敏感型单抗,并精确定位了mAb11、14、15识别的线性抗原表位区域。研究成果为PoRV诊断试剂优化、亚单位疫苗研发提供了关键抗体资源,为深入研究VP4蛋白的免疫学功能及抗病毒机制奠定了基础。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 VP4蛋白 单克隆抗体 抗原表位 诊断
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猪A群轮状病毒VP4单克隆抗体的制备和初步鉴定 被引量:1
4
作者 毛玎懿 孙波涛 +6 位作者 戴琦 李文良 李梅珍 陈艳 赵冰倩 陈婧 周斌 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第6期77-82,共6页
旨在制备一种特异性强、灵敏度高的猪A群轮状病毒(porcine rotavirus A,PoRVA)VP4单克隆抗体。本研究通过PCR扩增PoRVA分离株VP4基因的完整片段(2463 bp),构建原核表达载体pET-28a-VP4表达蛋白后制备单克隆抗体并进行鉴定。结果:重组蛋... 旨在制备一种特异性强、灵敏度高的猪A群轮状病毒(porcine rotavirus A,PoRVA)VP4单克隆抗体。本研究通过PCR扩增PoRVA分离株VP4基因的完整片段(2463 bp),构建原核表达载体pET-28a-VP4表达蛋白后制备单克隆抗体并进行鉴定。结果:重组蛋白大小在98 kDa左右,为不可溶蛋白,存在于包涵体中;经验证,猪轮状病毒阳性血清能够识别该重组蛋白,蛋白条带单一且清晰,具备良好的抗原性;蛋白纯化后,经小鼠免疫流程以及细胞融合筛选,3轮亚克隆后最终获得1株能稳定分泌抗VP4蛋白的阳性杂交瘤细胞株4B10,其轻链类型为Kappa型,重链亚型为IgG1,制备的小鼠腹水效价可达1∶3000000;在此基础上制备的单克隆抗体能特异性识别PoRV Pig/NJ/2012,具有良好反应性,可用于靶抗原的直接检测。综上,本研究制备的单克隆抗体特异性强、灵敏度高,为后续蛋白功能及病毒致病机制的研究提供了生物材料。 展开更多
关键词 猪A群轮状病毒 单克隆抗体 VP4蛋白
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猪萨佩罗病毒VP4蛋白多克隆抗体制备及功能验证
5
作者 钟祖昌 李本强 +6 位作者 陶洁 程靖华 石迎 刘佩红 唐攀 焦嘉杰 刘惠莉 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第4期78-84,共7页
为深入揭示猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)致病机制,以毒株SHCM2019为研究对象,原核表达VP_(4)蛋白并制备多克隆抗体。根据VP_(4)氨基酸序列进行PSV遗传进化分析,然后将VP_(4)基因与原核表达载体连接,经诱导表达得到可溶性VP_(4... 为深入揭示猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)致病机制,以毒株SHCM2019为研究对象,原核表达VP_(4)蛋白并制备多克隆抗体。根据VP_(4)氨基酸序列进行PSV遗传进化分析,然后将VP_(4)基因与原核表达载体连接,经诱导表达得到可溶性VP_(4)蛋白。纯化后的VP_(4)蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blot、间接免疫荧光试验(IFA)验证其反应性。ELISA结果显示,多克隆抗体效价达1∶128000;Western blot和IFA结果表明,其能特异性识别和结合PSV,说明重组VP_(4)蛋白具有较好的免疫原性和反应原性。本研究成功表达了VP_(4)蛋白并制备了多克隆抗体,为VP_(4)蛋白功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 猪萨佩罗病毒 VP4蛋白 原核表达 多克隆抗体
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一起猪轮状病毒感染的实验室诊断及VP4、VP7基因序列分析
6
作者 周锋涛 刘洋 +2 位作者 张振 刘淑华 李莲瑞 《湖南畜牧兽医》 2025年第6期27-30,共4页
为探究新疆阿克苏地区某一规模化猪场引发仔猪腹泻的病原体,采集病死仔猪肠道内容物,进行细菌分离鉴定,并采用荧光定量RT-PCR技术对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)进行病原检测。结果显示,样本中PoRV... 为探究新疆阿克苏地区某一规模化猪场引发仔猪腹泻的病原体,采集病死仔猪肠道内容物,进行细菌分离鉴定,并采用荧光定量RT-PCR技术对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)进行病原检测。结果显示,样本中PoRV检测呈阳性,提示该猪场仔猪腹泻的病原体为猪轮状病毒。设计并合成针对PoRV毒株VP4、VP7基因的特异性引物,进行RT-PCR扩增实验,并对扩增产物进行测序及同源性分析。结果表明,该毒株VP4基因序列与P[6]型参考株的核苷酸同源性为82.0%~92.3%,而VP7基因序列与G4型参考株的核苷酸同源性达到93.1%。据此判定,引发此次疫情的病原体为G4 P[6]基因型猪轮状病毒。研究为后续有效预防和控制疫情提供了重要依据。 展开更多
关键词 规模化猪场 仔猪腹泻 轮状病毒 VP4 VP7
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Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4兔源单克隆抗体的制备和鉴定
7
作者 孔维光 袁新婕 +2 位作者 丁广义 张环宇 徐镇 《渔业研究》 2025年第5期609-619,共11页
【目的】Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)严重危害中国草鱼(Ctenoparyngodonidel-lus)养殖业的健康发展。本研究基于单个B细胞抗体制备技术平台,结合哺乳动物表达系统,旨在制备靶向GCRV-ⅡVP4蛋白的基因工程抗体。【方法】通过构建GCRV-Ⅱ... 【目的】Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)严重危害中国草鱼(Ctenoparyngodonidel-lus)养殖业的健康发展。本研究基于单个B细胞抗体制备技术平台,结合哺乳动物表达系统,旨在制备靶向GCRV-ⅡVP4蛋白的基因工程抗体。【方法】通过构建GCRV-ⅡVP4基因表达载体,在真核表达系统中制备重组VP4蛋白;将纯化后的重组蛋白作为免疫原多次免疫新西兰白兔,分离出脾脏单个抗原特异性记忆B细胞;随后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增抗体可变区、恒定区基因片段,构建重组表达载体并转染HEK293F细胞进行单克隆抗体表达。最终通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光分析(IF)评估抗体的抗原结合特性。【结果】通过对分离培养的单个B细胞上清液进行筛选,利用ELISA筛选出对VP4蛋白具有较好结合能力的三种B细胞克隆(1D5、1F9、1H1),并结合IF实验验证了其能结合病毒感染组织中的VP4抗原。进一步通过抗体重组表达获得了三株抗VP4重组单克隆抗体(1D5、1F9、1H1),其ELISA效价均达1∶128000。Westernblot分析结果显示,1D5、1F9和1H1单克隆抗体能特异性识别GCRV-YX246感染的脑细胞中65.4kDa的蛋白质条带,该分子量大小与病毒VP4蛋白理论分子量一致。IF实验结果也进一步证实1D5、1F9和1H1可特异性识别GCRV-YX246毒株感染的草鱼头肾组织切片中的病毒抗原。【结论】本研究成功制备并筛选出抗GCRV-ⅡVP4重组单克隆抗体,为GCRV-Ⅱ病毒快速诊断试剂盒的研发和VP4蛋白功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒 VP4蛋白 单个B细胞技术 单克隆抗体制备
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厦门地区A组轮状病毒VP4基因序列特征
8
作者 林建成 高立斌 +3 位作者 詹伟武 吴海明 陈曦 徐锦 《检验医学》 2025年第12期1209-1215,共7页
目的 了解厦门地区P型A组轮状病毒VP4基因序列和遗传变异特征,及其与国内外VP4基因的差异。方法 收集2021年1—12月厦门市儿童医院100例<10岁腹泻患儿轮状病毒检测阳性的粪便样本。采用巢式聚合酶链反应(PCR)进行A组轮状病毒G基因型... 目的 了解厦门地区P型A组轮状病毒VP4基因序列和遗传变异特征,及其与国内外VP4基因的差异。方法 收集2021年1—12月厦门市儿童医院100例<10岁腹泻患儿轮状病毒检测阳性的粪便样本。采用巢式聚合酶链反应(PCR)进行A组轮状病毒G基因型和P基因型分型。用一代测序技术进行A组轮状病毒VP4基因全长序列测序,用DNA Star、MEGA等生物学软件对测序后获得的基因序列进行系统进化分析和氨基酸序列比对。结果 100例腹泻患儿粪便样本G基因型主要流行株为G9型(88株),P基因型主要流行株为P[8]型(87株),G/P组合基因型主要流行株是G9P[8]型(80株)。进化树分析结果显示,厦门地方株(Amoy)与国内外其他地方株在进化树内的关联性存在不同程度的差异。氨基酸比对分析结果显示,厦门地方株(Amoy)与国内外不同地方株的氨基酸一级结构存在不同程度的变异。结论 A组轮状病毒VP4基因全长可显示毒株在中国具有快速适应和变异的能力。建议对轮状病毒的遗传变异进行持续监测。 展开更多
关键词 A组轮状病毒 VP4 基因序列 遗传变异
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1994~1997年广州地区轮状病毒VP7、VP4型感染的流行病学与临床特征 被引量:14
9
作者 潘瑞芳 区文玑 +5 位作者 何婉儿 梁文青 何娟 常汝虚 钱渊 张又 《实用儿科临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期178-179,共2页
目的 了解我国南方婴幼儿轮状病毒VP7、VP4型感染性腹泻的流行及临床特征。方法 对 1994年 11月~ 1997年 10月连续 3 6个月收集 10 99例病毒性腹泻患儿粪便标本行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)检测 ,阳性者行VP7、VP4型别鉴定、临床分... 目的 了解我国南方婴幼儿轮状病毒VP7、VP4型感染性腹泻的流行及临床特征。方法 对 1994年 11月~ 1997年 10月连续 3 6个月收集 10 99例病毒性腹泻患儿粪便标本行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)检测 ,阳性者行VP7、VP4型别鉴定、临床分析。结果  10 99例粪便标本进行PAGE检测 ,检出轮状病毒 50 1例 ,阳性率45.6%。定型为VP7型 2 71例 ,VP7G1型 2 3 3例 ,占总数 86% ;其次为G2、G3型 ,未发现G4型。定型为VP4193例 ,VP41A型 160例 ,占总数 83 % ;其次为 1B及 2型 ,未发现 3型。高发季节为 11月至次年 2月 ,1岁内VP41A型的发病率比VP7G1型多 ,前者为 73 % ,后者为 57%。 2岁时发病率相似 ,分别为 93 .1%和 90 .1%。VP7G1型高热较其他型高 2 7% ,而VP41A型低热比例最高 (占 91% ) ,VP41A、1B绝大部分 (98%、96% ) ,伴轻度脱水。而VP7G1型中度脱水多见。VP41A型大便在 10次 /d以上。电解质紊乱情况VP7较VP4型较重。结论 1994~ 1997年广州地区轮状病毒型别集中在VP7G1及VP4A1型 ,流行季节为 11月至次年 2月 ,但病例终年不断。临床表现方面VP7G1型比VP41A型感染重 ,治疗效果理想 。 展开更多
关键词 轮状病毒 VP7型 VP4型 感染性腹泻 流行病学调查 临床特征 电泳检测 婴幼儿 1994~1997年 广州地区
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G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征 被引量:9
10
作者 李丹地 段招军 +10 位作者 章青 刘娜 谢华萍 崔淑贤 靳淼 杨学梅 郑丽舒 黄灿平 匡治州 王忠山 方肇寅 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期195-201,共7页
最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚... 最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。 展开更多
关键词 人类轮状病毒 VP4 VP6 NSP4 重组
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轮状病毒VP4、VP7基因的克隆与核苷酸序列分析 被引量:9
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作者 王鹏雁 陈创夫 +3 位作者 余兴龙 徐兴然 涂长春 张高轩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期99-103,共5页
用反转录聚合酶链式反应 (RT_PCR)技术 ,从轮状病毒感染的细胞中扩增 816bp、916bp的VP4、VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM_T上 ,转化至受体菌DH5α中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定 ,证明重组质粒... 用反转录聚合酶链式反应 (RT_PCR)技术 ,从轮状病毒感染的细胞中扩增 816bp、916bp的VP4、VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM_T上 ,转化至受体菌DH5α中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定 ,证明重组质粒pT_V4、PT_V7中含有轮状病毒的VP4、VP7基因片段。经核苷酸序列分析 ,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4。 展开更多
关键词 核苷酸序列分析 轮状病毒 基因克隆 VP4 VP7
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草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量:12
12
作者 曾伟伟 王庆 +2 位作者 王英英 石存斌 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期450-456,共7页
为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆和筛选,获得3... 为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗VP4重组蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2C2、2F3和5E5。抗体经亚型鉴定均为IgG1,轻链为κ链;间接ELISA试验证明,3株杂交瘤细胞分泌的MAb可特异性识别GCRV-HZ08,与GSRV,ISKNV,IHNV均无交叉反应。选择2C2作为腹水生产细胞株,免疫小鼠后腹水ELISA效价为1∶720 000;IFA和Western-blotting结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够特异性识别GCRV-HZ08病毒粒子。本实验制备的MAb具有良好的生物学特性,为GCRV流行株血清学检测方法的建立及VP4蛋白相关功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 VP4蛋白 单克隆抗体
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表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒对新生小鼠的被动免疫保护作用 被引量:8
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作者 刘馨 张光明 +2 位作者 李鸿钊 谢天宏 孙茂盛 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2007年第1期33-36,共4页
目的探讨表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒(Ad5/VP4)对新生小鼠的被动免疫保护作用。方法在293细胞上扩增表达猴轮状病毒SA11株VP4抗原的重组腺病毒并纯化。将轮状病毒抗体阴性的小鼠交配后的雌性小鼠,分别通过肌肉注射、滴鼻和口服免... 目的探讨表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒(Ad5/VP4)对新生小鼠的被动免疫保护作用。方法在293细胞上扩增表达猴轮状病毒SA11株VP4抗原的重组腺病毒并纯化。将轮状病毒抗体阴性的小鼠交配后的雌性小鼠,分别通过肌肉注射、滴鼻和口服免疫纯化后的重组腺病毒,生产后第7天和第8天,用轮状病毒SA11(1·0×106PFU)口服攻击乳鼠2次,观察出现腹泻症状的乳鼠的比例,并用ELISA检测母鼠的血清以及乳鼠胃囊乳块中的轮状病毒特异性抗体。同时以含有部分E1区基因的腺病毒5型载体(Ad5)作为对照。结果经3种不同途径免疫母鼠后,在血清和乳汁中均能检测到轮状病毒VP4特异性抗体。经滴鼻免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为100%(11/11);经肌肉注射免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为30%(3/10);经口服免疫的母鼠喂养的乳鼠,经轮状病毒攻击后保护率为80%(8/10)。对照组的小鼠全部出现了腹泻症状。结论表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒经滴鼻免疫母鼠后,能在乳汁中产生特异性的IgA和IgG抗体,并能保护新生小鼠对抗轮状病毒的攻击,保护率达100%。 展开更多
关键词 轮状病毒 VP4抗原 重组腺病毒 被动免疫保护
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G9型人A组轮状病毒LL52696与LL52727株的主要基因及其编码蛋白特征的分析 被引量:7
14
作者 李丹地 崔淑娴 +8 位作者 章青 靳淼 虞结梅 张栋梁 徐子乾 唐景裕 王忠山 方肇寅 段招军 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期144-147,共4页
Two Rotavirus G9P[8] strains (LL52696 and LL52727) were recognized during a sentinel-based survey in Lulong, China. Phylogenetic analysis of the VP7 gene showed that both strains isolated constituted a divergent genet... Two Rotavirus G9P[8] strains (LL52696 and LL52727) were recognized during a sentinel-based survey in Lulong, China. Phylogenetic analysis of the VP7 gene showed that both strains isolated constituted a divergent genetic cluster distinct from the other G9 strains isolated in China. Analysis of VP4, VP6, and NSP4 genes revealed that these strains were closely related to Lulong strains. We hold that two strains were reassortant between G9 and Lulong predominant strains. 展开更多
关键词 人A组轮状病毒 G9P[8] VP7 VP4 VP6 NSP4
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成都地区婴幼儿腹泻轮状病毒的基因分型研究 被引量:8
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作者 廖虹瑜 张梦妍 +3 位作者 陈喜凯 陈智瑾 樊学军 裴晓方 《四川大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期511-514,共4页
目的了解成都市婴幼儿轮状病毒的基因分型特点,以及流行优势毒株VP4基因核酸序列变异情况。方法收集2010年3月华西第二医院75份门诊婴幼儿腹泻标本,RT-PCR检测轮状病毒并进行G、P基因分型。据检测结果确定流行优势株,对两株优势株VP4基... 目的了解成都市婴幼儿轮状病毒的基因分型特点,以及流行优势毒株VP4基因核酸序列变异情况。方法收集2010年3月华西第二医院75份门诊婴幼儿腹泻标本,RT-PCR检测轮状病毒并进行G、P基因分型。据检测结果确定流行优势株,对两株优势株VP4基因进行T-A克隆和测序比对。结果 A组轮状病毒检出率为17.3%(13/75),其中G1型7株,G3型2株,4株未分型;P基因分型结果为P[8]型6株,P[4]型2株,P[10]型、P[6]型、P[9]型各1株,2株未分型;G/P组合结果以G1P[8]型为主,共5株;G1P[4]型,G3P[6]型各1株。VP4测序结果显示,两株优势株均为P[8]基因型,且毒株之间具有高度同源性(97%),与标准株之间同源性也达90%以上。结论 A组轮状病毒是成都地区2010年春季婴幼儿腹泻的重要病原之一,其血清型主要为G1型,流行优势株G/P组合为G1P[8]型。 展开更多
关键词 A组轮状病毒 RT-PCR G1P[8] VP4
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草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 被引量:7
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作者 曾伟伟 王庆 +5 位作者 张乐生 刘宝芹 刘永奎 石存斌 曾令兵 吴淑勤 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第12期1482-1485,共4页
目的原核表达、纯化草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)HZ08株VP4蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用PCR法扩增GCRV HZ08株S6基因部分节段,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a-S6,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPT... 目的原核表达、纯化草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)HZ08株VP4蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用PCR法扩增GCRV HZ08株S6基因部分节段,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a-S6,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定其效价,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为51 000,表达量占菌体总蛋白的73%,主要以包涵体形式表达,反应原性良好;制备的多克隆抗体效价约为1∶8 000,且具有较高的特异性。结论成功制备了GCRV HZ08株VP4蛋白高效价多克隆抗体,为VP4蛋白功能的深入研究、抗原表位分析、草鱼出血病诊断方法的建立及相关基因工程疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 呼肠孤病毒 草鱼 VP4蛋白 多克隆抗体
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口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性 被引量:7
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作者 王晓虎 靳玉珠 +4 位作者 范秀波 刘晔 张守峰 丁壮 扈荣良 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第2期168-171,175,共5页
目的构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVVP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的... 目的构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVVP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达。将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验。结果VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确。各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0。结论口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 VP4基因 核酸疫苗 免疫原性
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大熊猫轮状病毒CH-1株外衣壳蛋白VP4基因的克隆与生物信息学分析 被引量:6
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作者 雷燕 颜其贵 +7 位作者 张志和 王成东 陈世界 王旭 左兰 程喻 任玉鹏 郭玲 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期575-581,共7页
利用MA-104细胞培养增殖大熊猫轮状病毒CH-1株,提取总RNA,运用RT-PCR扩增外衣壳蛋白VP4基因,将其与pMD19-T simple vector连接并转化DH5α,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获... 利用MA-104细胞培养增殖大熊猫轮状病毒CH-1株,提取总RNA,运用RT-PCR扩增外衣壳蛋白VP4基因,将其与pMD19-T simple vector连接并转化DH5α,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得大熊猫轮状病毒VP4蛋白基因,长2 362bp,包含一个2 331bp的开放阅读框,编码776个氨基酸,测序结果在GenBank中的登录号为HQ641296。生物信息学分析表明,VP4蛋白基因编码产物分子质量为86 768.8u,理论等电点为5.56,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为28.64,脂肪指数为82.53,总平均亲水性为-0.265,最大疏水性为2.244,最小疏水性为-2.911;无信号肽序列;跨膜结构分析显示VP4蛋白无跨膜区,位于病毒膜外区;在VP4序列中的抗原决定簇主要位于VP4的N-末端和C-末端。预测其可能包含8个N-糖基化作用位点,15个蛋白激酶C磷酸化作用位点、15个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、12个N-豆蔻酰化位点。系统进化分析显示,大熊猫轮状病毒的VP4基因与猪轮状病毒的VP4基因的进化距离最近。本试验成功获得大熊猫轮状病毒VP4基因,为以后研究此基因的生物学功能、建立该病毒的检测方法以及研制新型大熊猫轮状病毒基因疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 大熊猫 轮状病毒 VP4基因 克隆 生物信息学分析
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重叠PCR法合成轮状病毒抗原基因VP4 被引量:8
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作者 冉丹霞 王荣荣 +2 位作者 郝亚宁 宋方洲 马永平 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期118-119,124,共3页
用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了... 用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了重叠延伸PCR法是获得目的基因的有效方法。 展开更多
关键词 轮状病毒 VP4基因 合成 重叠延伸PCR
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肠道病毒71型北京分离株VP4基因序列及蛋白抗原性分析 被引量:5
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作者 李玉运 朱汝南 +5 位作者 钱渊 邓洁 孙宇 王芳 赵林清 刘立颖 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期207-214,共8页
为探讨肠道病毒71型(EV71)VP4基因序列与手足口病(HFMD)不同临床类型之间的关系,分析重组蛋白EV71 VP4的抗原性,并初步探讨其与柯萨奇病毒A16(CA16)重组蛋白VP4是否存在交叉反应性,对2007~2009年从北京患HFMD儿童标本分离到的10株... 为探讨肠道病毒71型(EV71)VP4基因序列与手足口病(HFMD)不同临床类型之间的关系,分析重组蛋白EV71 VP4的抗原性,并初步探讨其与柯萨奇病毒A16(CA16)重组蛋白VP4是否存在交叉反应性,对2007~2009年从北京患HFMD儿童标本分离到的10株EV71的VP4基因进行克隆测序,运用生物学软件对测序结果进行比较分析,并选择其中1株与1株同期分离的CA16的VP4分别进行原核表达;用表达产物对189份正常体检的成人及来首都儿科研究所就医的非HFMD患儿血清中的IgG进行Western Blot检测,并分析14份确诊为EV71感染和12份CA16感染患者急性期血清中的IgM抗体。分析表明这10株EV71 VP4基因核苷酸同源性为94.20%~100.00%,所推导的氨基酸序列则完全相同,从重症与轻症患儿分离的毒株之间VP4的核苷酸序列未见一致性的差异,基于EV71 VP4基因核苷酸序列的进化树分析表明2007~2009年北京地区所流行的毒株均属于C4亚型;本研究中EV71和CA16的VP4核苷酸序列的同源性为69.60%,所推导的氨基酸序列的同源性为78.60%,在运用Western Blot检测189份血清中的VP4特异性IgG时,EV71 VP4的血清阳性率为38.10%,说明其具有良好的抗原性,CA16 VP4的血清阳性率为58.20%,两者差别具有显著统计学意义(2χ=15.30,P〈0.01),提示EV71 VP4与CA16 VP4没有交叉反应性;在用表达的VP4检测已确诊为相应病毒的特异性IgM时,两者皆为阴性,提示感染后机体对VP1和VP4产生不同的反应。 展开更多
关键词 肠道病毒 EV71 CA16 VP4 手足口病
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