目的:探究毛花苷C对肝癌Huh-7细胞自噬的影响,及可能的作用机制。方法:用梯度浓度的毛花苷C处理Huh-7细胞24 h后,采用CCK-8法检测毛花苷C对Huh-7细胞的IC_(50)值,并进一步通过CCK-8法和细胞克隆形成实验分析毛花苷C梯度浓度干预在Huh-7...目的:探究毛花苷C对肝癌Huh-7细胞自噬的影响,及可能的作用机制。方法:用梯度浓度的毛花苷C处理Huh-7细胞24 h后,采用CCK-8法检测毛花苷C对Huh-7细胞的IC_(50)值,并进一步通过CCK-8法和细胞克隆形成实验分析毛花苷C梯度浓度干预在Huh-7细胞增殖及克隆形成中的作用;采用蛋白质印迹法检测Huh-7细胞中自噬标志物微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、Beclin1、液泡分选蛋白15(vacuolar protein sorting 15,VPS15)、VPS34和自噬相关蛋白3(autophagy-related protein 3,ATG3)蛋白的表达水平,并观察LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的变化情况;通过激光共聚焦显微镜观察毛花苷C对Huh-7细胞自吞噬小体形成的影响,并采用人工智能图像分析技术确认毛花苷C对Huh-7细胞自吞噬小体形成的影响;最后通过免疫共沉淀实验探究毛花苷C对Beclin1与VPS34以及VPS15相互作用的影响。结果:24 h时毛花苷C对Huh-7细胞的IC_(50)值为(0.49±0.07)μg/m L。CCK-8法和克隆形成实验检测结果提示,毛花苷C对Huh-7细胞的生长具有明显的抑制作用,且呈一定的浓度依赖性(P均<0.01)。蛋白质印迹法检测结果表明,随着毛花苷C浓度的提高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也随之明显提高(P<0.01),同时Beclin1蛋白的表达水平被上调(P<0.05),而p62蛋白的表达水平被明显下调(P<0.01)。激光共聚焦显微镜下的观察结果显示,毛花苷C能够明显诱导Huh-7细胞自吞噬小体形成(P<0.01)。人工智能图像分析结果确认了毛花苷C的这一效应(P均<0.01)。免疫共沉淀实验结果证实,毛花苷C能够促进Beclin1与VPS34、VPS15相互结合(P均<0.01)。结论:毛花苷C明显抑制肝癌细胞Huh-7的增殖并诱导其发生自噬,其作用机制可能与毛花苷C上调Beclin1蛋白的表达水平并促进Beclin1与VPS34、VPS15相互结合密切相关。展开更多
文摘目的:探究毛花苷C对肝癌Huh-7细胞自噬的影响,及可能的作用机制。方法:用梯度浓度的毛花苷C处理Huh-7细胞24 h后,采用CCK-8法检测毛花苷C对Huh-7细胞的IC_(50)值,并进一步通过CCK-8法和细胞克隆形成实验分析毛花苷C梯度浓度干预在Huh-7细胞增殖及克隆形成中的作用;采用蛋白质印迹法检测Huh-7细胞中自噬标志物微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、Beclin1、液泡分选蛋白15(vacuolar protein sorting 15,VPS15)、VPS34和自噬相关蛋白3(autophagy-related protein 3,ATG3)蛋白的表达水平,并观察LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的变化情况;通过激光共聚焦显微镜观察毛花苷C对Huh-7细胞自吞噬小体形成的影响,并采用人工智能图像分析技术确认毛花苷C对Huh-7细胞自吞噬小体形成的影响;最后通过免疫共沉淀实验探究毛花苷C对Beclin1与VPS34以及VPS15相互作用的影响。结果:24 h时毛花苷C对Huh-7细胞的IC_(50)值为(0.49±0.07)μg/m L。CCK-8法和克隆形成实验检测结果提示,毛花苷C对Huh-7细胞的生长具有明显的抑制作用,且呈一定的浓度依赖性(P均<0.01)。蛋白质印迹法检测结果表明,随着毛花苷C浓度的提高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也随之明显提高(P<0.01),同时Beclin1蛋白的表达水平被上调(P<0.05),而p62蛋白的表达水平被明显下调(P<0.01)。激光共聚焦显微镜下的观察结果显示,毛花苷C能够明显诱导Huh-7细胞自吞噬小体形成(P<0.01)。人工智能图像分析结果确认了毛花苷C的这一效应(P均<0.01)。免疫共沉淀实验结果证实,毛花苷C能够促进Beclin1与VPS34、VPS15相互结合(P均<0.01)。结论:毛花苷C明显抑制肝癌细胞Huh-7的增殖并诱导其发生自噬,其作用机制可能与毛花苷C上调Beclin1蛋白的表达水平并促进Beclin1与VPS34、VPS15相互结合密切相关。
