目的本研究旨在构建适用于毕赤酵母的高效表达载体,建立高效可行的鼠疫杆菌功能基因酵母表达策略,用于鼠疫杆菌功能蛋白的表达及后续研究。方法以F1抗原编码基因caf1为示范目标,基于密码子偏好进行序列优化,在5'与3'端分别引入...目的本研究旨在构建适用于毕赤酵母的高效表达载体,建立高效可行的鼠疫杆菌功能基因酵母表达策略,用于鼠疫杆菌功能蛋白的表达及后续研究。方法以F1抗原编码基因caf1为示范目标,基于密码子偏好进行序列优化,在5'与3'端分别引入BglⅡ与EcoRⅠ限制性位点,克隆入酵母表达载体。在大肠杆菌扩增并经双酶切与测序确认后,转化毕赤酵母SMD1168菌株,采用甲醇诱导表达;收集上清后以Ni-NTA亲和层析纯化并通过SDS-PAGE与ELISA检测表达产物。结果构建的重组质粒经双酶切可见约0.5 kb插入片段,测序未见突变或移码。诱导约72 h后在上清中检测到与F1抗原相符的约35 k Da蛋白条带;ELISA检测呈阳性反应,His标签抗体可识别纯化产物。结论本研究完成了以caf1为代表的功能基因在毕赤酵母中的表达验证,证实该策略具备可复制性与可扩展性,可用于后续鼠疫功能蛋白的分泌表达与工艺优化研究。展开更多
文摘目的本研究旨在构建适用于毕赤酵母的高效表达载体,建立高效可行的鼠疫杆菌功能基因酵母表达策略,用于鼠疫杆菌功能蛋白的表达及后续研究。方法以F1抗原编码基因caf1为示范目标,基于密码子偏好进行序列优化,在5'与3'端分别引入BglⅡ与EcoRⅠ限制性位点,克隆入酵母表达载体。在大肠杆菌扩增并经双酶切与测序确认后,转化毕赤酵母SMD1168菌株,采用甲醇诱导表达;收集上清后以Ni-NTA亲和层析纯化并通过SDS-PAGE与ELISA检测表达产物。结果构建的重组质粒经双酶切可见约0.5 kb插入片段,测序未见突变或移码。诱导约72 h后在上清中检测到与F1抗原相符的约35 k Da蛋白条带;ELISA检测呈阳性反应,His标签抗体可识别纯化产物。结论本研究完成了以caf1为代表的功能基因在毕赤酵母中的表达验证,证实该策略具备可复制性与可扩展性,可用于后续鼠疫功能蛋白的分泌表达与工艺优化研究。