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BRD4和ZNF76协同调控非洲猪瘟病毒p30表达促进病毒复制的机制研究
1
作者 陈迎恩 赵亚茹 +6 位作者 陈奕康 孙华林 张忠辉 杨吉飞 关贵全 殷宏 牛庆丽 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第10期1279-1290,共12页
本研究旨在解析宿主蛋白BRD4与ZNF76的相互作用对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)复制的协同调控作用。通过免疫沉淀联合质谱分析(IP-MS),鉴定出宿主BRD4蛋白通过其溴结构域(BD1/2)与宿主转录相关因子ZNF76存在相互作用... 本研究旨在解析宿主蛋白BRD4与ZNF76的相互作用对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)复制的协同调控作用。通过免疫沉淀联合质谱分析(IP-MS),鉴定出宿主BRD4蛋白通过其溴结构域(BD1/2)与宿主转录相关因子ZNF76存在相互作用。免疫荧光(IF)试验表明BRD4与ZNF76在细胞核内存在共定位现象。ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)时,ZNF76的m RNA和蛋白水平表达随ASFV感染时间延长及病毒感染复数增加呈现显著上调趋势,过表达试验则进一步证实ZNF76显著促进病毒复制。机制研究揭示BRD4和ZNF76复合物能结合ASFV早期关键蛋白p30,并通过协同作用增强其表达。本研究首次揭示了ZNF76作为促病毒复制因子的功能,明确了BRD4-ZNF76相互作用通过调控病毒蛋白表达促进ASFV复制的机制,为深入理解ASFV劫持宿主因子促进自身复制的分子基础及开发基于宿主靶点的抗病毒策略提供了重要理论支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 BRD4 ZNF76 协同调控 p30 相互作用
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非洲猪瘟病毒p30抗体竞争化学发光法的建立
2
作者 温升辉 邵军军 +5 位作者 高闪电 彭德财 常惠芸 丁嘉烽 刘伟 师铭咸 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第1期1-7,共7页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起猪的一种急性、热性、高致死性疾病。鉴于当前尚缺乏商业化的疫苗,并且近年来ASFV不断演变,中等毒力基因Ⅱ型毒株的涌现以及基因Ⅰ型弱毒... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起猪的一种急性、热性、高致死性疾病。鉴于当前尚缺乏商业化的疫苗,并且近年来ASFV不断演变,中等毒力基因Ⅱ型毒株的涌现以及基因Ⅰ型弱毒株的传入,导致猪仅出现了持续性和慢性感染的状况。因此,对ASFV的特异性抗体检测变得势在必行。本研究利用p30单克隆抗体建立了一种检测ASFV p30抗体的竞争化学发光法——p30-cCLIA。通过检测背景清晰的阴阳性血清,确定该方法的Cut-off值为50%时,诊断敏感性(Dsn)和诊断特异性(Dsp)均为100%。在最佳反应条件下筛选出适用于p30单抗16-5E7E8-HRP的酶标稳定剂。此外,本研究建立的p30-cCLIA方法的灵敏度比商品化阻断ELISA试剂盒更高(1∶2048 vs 1∶512),并具有良好的重复性。通过检测其他病毒感染猪阳性血清,结果表明与这些血清无交叉反应性。该方法的建立为ASF早期诊断提供了有力工具。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 p30抗体 抗体检测 化学发光法
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非洲猪瘟病毒p30蛋白在乳酸菌工程菌株中的表达及动物免疫
3
作者 陈萌萌 赵洪哲 +7 位作者 刘春羽 陈克伟 王亚新 孟海 王昊 张赫 温永俊 王凤雪 《动物医学进展》 北大核心 2025年第5期1-8,共8页
为了探究表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的重组乳酸杆菌口服免疫防控非洲猪瘟效果,以载体pPG612.1为骨架,构建重组质粒,将其电转到乳酸菌XM-38感受态细胞中,抗性筛选获得含有pPG612.1-p30表达质粒的重组乳酸... 为了探究表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的重组乳酸杆菌口服免疫防控非洲猪瘟效果,以载体pPG612.1为骨架,构建重组质粒,将其电转到乳酸菌XM-38感受态细胞中,抗性筛选获得含有pPG612.1-p30表达质粒的重组乳酸菌,木糖诱导其表达,通过Western blot和间接免疫荧光,鉴定融合表达蛋白的免疫反应性及膜表达定位;进一步用重组菌灌喂ASFV抗体阴性的健康仔猪,采集猪血清进行ELISA和Western blot检测p30抗体。结果表明,成功构建了融合表达ASFV p30蛋白的乳酸杆菌,命名为XM38-pPG612.1-p30;重组表达蛋白分子质量约59 ku,与p30单抗有良好结合活性;表达的ASFV p30能锚定在乳酸菌XM-38细胞表面;动物免疫试验表明重组菌XM38-pPG612.1-p30可刺激猪产生抗ASFV p30的抗体,为ASFV新型疫苗的研发提供了思路。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 p30蛋白 免疫原性 乳酸菌 细胞共定位
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非洲猪瘟病毒p30蛋白与CRM197的融合表达及对小鼠的免疫原性评价 被引量：1
4
作者 张琦 董宁宁 +9 位作者 谈晓梅 石正旺 李娜 朱雯琪 汤傲星 李传锋 朱杰 刘光清 苏艳 孟春春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5230-5237,共8页
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高传染性和致死性的传染病,对猪养殖业造成了巨大的影响。安全有效的疫苗和有效治疗药物的缺乏给非洲猪瘟防控带来了巨大的挑战。作者尝试设计一种融合蛋白以改善非洲猪瘟病毒p30的免疫原性。... 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高传染性和致死性的传染病,对猪养殖业造成了巨大的影响。安全有效的疫苗和有效治疗药物的缺乏给非洲猪瘟防控带来了巨大的挑战。作者尝试设计一种融合蛋白以改善非洲猪瘟病毒p30的免疫原性。白喉毒素的无毒突变体CRM197已被成功地用作多糖-蛋白结合疫苗的载体蛋白,以增强多糖的免疫原性。本研究构建p30与CRM197催化结构域(A片段)的融合表达质粒,纯化后的重组蛋白和单独p30分别使用小鼠评价了其免疫原性。结果显示:通过原核表达与亲和层析纯化得到融合蛋白p30-CRM197(A)免疫小鼠后,较单独表达的p30其可以在更短的时间内激发起高水平针对p30的特异性IgG,并且在初次免疫后56 d后还能维持较高水平的淋巴细胞免疫活力。本研究结果表明,CRM197的A片段作为载体蛋白显著增强原核表达p30蛋白的免疫原性,其可作为非洲猪瘟亚单位疫苗的候选分子内佐剂。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 CRM197 p30 免疫原性
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非洲猪瘟病毒p30蛋白氨基酸序列分段表达及反应原性分析
5
作者 周俊明 倪艳秀 +5 位作者 范宝超 祝昊丹 朱雪蛟 王丹丹 胡屹屹 李彬 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第10期1875-1881,共7页
为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,... 为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,经IPTG诱导、Ni柱纯化、透析后,获得p30蛋白氨基酸序列中8~101 aa片段(P-1#)、58~101 aa片段(P-2#)、101~158 aa片段(P-3#)、8~194 aa片段(P-4#),用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析p30蛋白氨基酸序列中不同片段与p30蛋白免疫兔血清和ASFV阳性猪血清的反应原性。结果显示,上述片段均获得诱导表达及纯化,表达形式有可溶性表达(P-1#、P-3#)和包涵体表达(P-2#、P-4#)。各片段以1.0 mg/L包被时,p30免疫兔血清与p30蛋白氨基酸序列中4种片段均能发生免疫反应,ASFV阳性猪血清与P-4#、P-1#反应较佳,与P-3#反应中等,与P-2#反应最弱。综上,p30蛋白氨基酸序列中不同片段反应原性的差异为认识p30抗原优势区域提供了数据,这将有助于非洲猪瘟血清学诊断抗原的科学筛选。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 氨基酸序列片段 反应原性
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非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：2
6
作者 刘悦 魏天 +11 位作者 张春雨 张建峰 王成宇 张芳毓 朱日宁 鞠安琪 王思月 曲磊 张守峰 扈荣良 梁静 王永志 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期12-19,28,共9页
为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体间接ELISA检测方法,利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白,并以表达的蛋白作为包被抗原,对间接ELISA各反应条件进行优化... 为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体间接ELISA检测方法,利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白,并以表达的蛋白作为包被抗原,对间接ELISA各反应条件进行优化。依据ASFV SY-18株的CP204L(p30)基因序列,按照本氏烟草密码子的偏好性,对p30基因(231~536 bp)的核苷酸序列进行优化、人工合成及克隆,通过In-Fusion连接技术将扩增的p30基因插入到PVY基因组的P1和HC-Pro基因之间,构建PVY-p30重组病毒质粒,以摩擦的方式将质粒接种本氏烟草叶片,14 d后,通过RT-PCR和Western blot分析目的基因的转录和重组蛋白的表达情况,并利用Ni-NTA-琼脂糖亲和层析柱纯化本氏烟草中表达的p30重组蛋白,Western blot分析p30重组蛋白的纯化效果和反应原性,将纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,构建的PVY-p30重组病毒能够系统性侵染本氏烟草;p30重组蛋白能够在本氏烟草叶片中表达,且具有良好的反应原性;纯化的p30重组蛋白效果较好,能够被p30蛋白单克隆抗体识别。建立的ELISA检测方法最佳反应条件为抗原质量浓度0.5 mg/L,37℃包被1 h;待检血清1∶400倍稀释,37℃孵育0.5 h;HRP标记二抗37℃孵育0.5 h;TMB室温避光显色10 min;阴阳性临界值为0.461。当ASFV阳性血清稀释度为1∶2560时,仍检测为阳性,具有较高的敏感性;该方法与其他常见病阳性血清不发生交叉反应,能够特异性地检测ASFV抗体;重复性试验显示批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%;该方法与ASFV商品化检测试剂盒相比,总体符合率为85.0%。结果表明,本研究构建的PVY-p30重组病毒载体能介导p30重组蛋白在本氏烟草中表达,以植物表达的p30重组蛋白为抗原建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法可用于疾病的临床检测及疫情监测,同时为可饲疫苗的研发提供了基础材料。 展开更多
关键词 间接ELISA 非洲猪瘟病毒 马铃薯Y病毒 植物生物反应器 p30蛋白
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非洲猪瘟病毒p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法的建立
7
作者 何佳依 邹艳丽 +11 位作者 王燕 刘珊 苗雨润 任炜杰 王振忠 白昀 陈欢 贾红 郑龙三 吴晓东 冯志新 钱莺娟 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期1443-1450,共8页
为建立一种可靠、快速的血清学检测方法,以非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原,建立了一种双抗原间接ELISA方法,用于检测ASFV抗体。结果表明,该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪... 为建立一种可靠、快速的血清学检测方法,以非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原,建立了一种双抗原间接ELISA方法,用于检测ASFV抗体。结果表明,该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒和猪瘟病毒等常见猪源病原阳性血清无交叉反应;对ASFV阳性血清的敏感性能达到1∶12800;批内变异系数为7.95%,批间变异系数为9.18%,均小于10%。利用该方法与ID.vet商品化ELISA试剂盒分别检测130份临床猪血清,其阳性符合率为92.19%,阴性符合率为86.36%,总符合率为89.23%。综上所述,成功建立了ASFV p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法,为检测猪血清中ASFV特异性抗体提供了新的技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 pK205R蛋白 间接ELISA
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非洲猪瘟病毒p30生物信息学分析及多克隆抗体的制备
8
作者 陈春龙 张丽荣 孔令保 《生物灾害科学》 2024年第4期524-535,共12页
【目的】目前国内流行的变异非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)表现出毒力低,传染性强,隐蔽性强的特点,非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床表现不明显,早期诊断难度大,快速灵敏的早期诊断试剂盒对于非洲猪瘟防控至关重... 【目的】目前国内流行的变异非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)表现出毒力低,传染性强,隐蔽性强的特点,非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床表现不明显,早期诊断难度大,快速灵敏的早期诊断试剂盒对于非洲猪瘟防控至关重要,而p30的研究及其多克隆抗体的制备可以为早期诊断试剂盒的开发提供重要的理论依据。【方法】根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离的非洲猪瘟毒株Pig/Heilongjiang/HRB1/2020(GenBank:MW656282)提供的p30的氨基酸序列,利用生物信息学软件对该序列的理化性质,亲/疏水性,跨膜区,信号肽及二三级结构进行分析预测,由生物公司优化密码子并合成重组质粒pET-28a-p30。将p30克隆到pET-32a(+)原核表达载体中,将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,对异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导温度及诱导时间进行优化,用纯化所得的p30蛋白对小鼠进行3次免疫,获取多克隆抗体并检测效价。【结果】由生物信息学分析结果得出p30蛋白含194个氨基酸,分子式为C_(1001)H_(1575)N_(259)O_(308)S_(7),p30蛋白为亲水性蛋白,不含跨膜区,无信号肽,二三级结构中含大量的α-螺旋。蛋白表达结果显示,当诱导时间为6 h,IPTG终浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为34℃时,p30重组蛋白表达量达到最佳,浓度高达0.9 mg/mL以上,1 L菌液可产53 mg重组蛋白。通过间接ELISA测得小鼠血清抗体效价高达1:10000000。Western Blotting结果显示,制备的p30蛋白具有较好的特异性。【结论】经过表达优化p30蛋白产量得到明显提高,并获得效价较高的多克隆抗体,且具有很好的特异性。对研发针对p30更加灵敏的诊断试剂盒提供了重要的理论依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白 生物信息学分析 原核表达 多克隆抗体
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肺炎支原体黏附蛋白P30研究进展
9
作者 张汝 左颖颖 +1 位作者 李水红 雷爱华 《中南医学科学杂志》 CAS 2024年第3期488-491,共4页
肺炎支原体(Mp)是导致儿童、青少年及老年人上、下呼吸道感染的主要病原体,可导致肺炎、肺内外并发症及呼吸系统后遗症等。Mp黏附蛋白P30与P1蛋白一样在感染宿主细胞中发挥重要作用。本文从P30蛋白的结构和亚型、功能、血清学诊断及疫... 肺炎支原体(Mp)是导致儿童、青少年及老年人上、下呼吸道感染的主要病原体,可导致肺炎、肺内外并发症及呼吸系统后遗症等。Mp黏附蛋白P30与P1蛋白一样在感染宿主细胞中发挥重要作用。本文从P30蛋白的结构和亚型、功能、血清学诊断及疫苗开发等方面介绍P30蛋白的最新研究进展,为Mp感染的诊断及防治研究提供参考。 展开更多
关键词 肺炎支原体 黏附蛋白p30 功能 诊断 疫苗
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非洲猪瘟病毒p30蛋白在293T细胞中的瞬时表达
10
作者 刘郁夫 林晓慧 +3 位作者 黎洁泳 官逸瑶 刘俐 冯美莹 《肇庆学院学报》 2024年第5期84-89,共6页
为真核表达非洲猪瘟病毒p30蛋白,探究其对炎症反应相关基因表达的影响.实验根据NCBI上的p30基因序列合成基因,将其克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,再将重组质粒转染到293T细胞中,培养24 h后通过荧光显微镜观察质粒的转染情况,以wester... 为真核表达非洲猪瘟病毒p30蛋白,探究其对炎症反应相关基因表达的影响.实验根据NCBI上的p30基因序列合成基因,将其克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,再将重组质粒转染到293T细胞中,培养24 h后通过荧光显微镜观察质粒的转染情况,以western blots试验检测目的蛋白的表达情况,最后再利用RTqPCR检测过表达p30蛋白的293T细胞中NF-κB信号通路和炎症反应相关基因的mRNA转录情况.结果显示,293T细胞转染重组质粒24 h后,约80%的细胞可显示绿色荧光,并且western blots检测到一条可与Flag标签抗体特异性反应的条带,大小与预期相符.RT-qPCR试验表明,过表达ASFV p30蛋白的293T细胞中,炎性反应相关细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平得到显著上调,上调倍数为对照组的2.988~3.605倍.试验可为ASFV抗原抗体检测技术的研发提供前期基础,为ASFV分子致病机制研究提供参考. 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30 293T细胞 炎性细胞因子
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刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文) 被引量：9
11
作者 张佃波 魏庆宽 +7 位作者 宰德富 崔勇 李瑾 高红刚 柏雪莲 赵立江 韩广东 刘克义 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期538-543,共6页
目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PC... 目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 p30和ROP2基因 融合蛋白 WESTERN blot.
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基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立 被引量：11
12
作者 孙燕燕 赵亚茹 +9 位作者 李昕 杨吉飞 牛庆丽 林密 王兆贵 刘猛 关贵全 殷宏 蒋韬 刘志杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期939-945,共7页
为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控... 为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 抗体检测 金纳米颗粒 免疫层析法
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弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果 被引量：14
13
作者 龚娅 陈晓光 冯明钊 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期282-286,共5页
目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜... 目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,包括信号肽及疏水尾 )pcDNA3 P30Mb ,分泌型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,不包括疏水尾 )pcDNA3 P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,但不包括信号肽 )pcDNA3 P30In。将以上 3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠 ,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体。　结果　成功构建了弓形虫P30基因 3种表达形式的重组质粒 ,经双酶切鉴定及DNA序列测定 ,3种重组质粒中的插入片段确为P30的编码基因 ,且读码框架正确 ;抗体测定显示 :3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体 ,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异。　结论　用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫 ,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体 ;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠 ,但 4wk后 3组间差异无显著性。 展开更多
关键词 弓形虫 p30 核酸免疫 重组质粒 免疫效果
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弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠的细胞免疫反应及抗体生成的动态过程 被引量：8
14
作者 李文姝 陆惠民 +2 位作者 张惠琴 夏超明 黄伟达 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第2期82-84,共3页
目的　观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫效果和抗体IgG的动态发生过程。方法　口服免疫BALB/c小鼠 ,一个月后 ,取鼠脾细胞作ConA刺激淋转试验 (MTT法 )及T细胞亚群的测定 ;不同免疫时间段内 ,收集实验鼠血清 ,ELIS... 目的　观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫效果和抗体IgG的动态发生过程。方法　口服免疫BALB/c小鼠 ,一个月后 ,取鼠脾细胞作ConA刺激淋转试验 (MTT法 )及T细胞亚群的测定 ;不同免疫时间段内 ,收集实验鼠血清 ,ELISA法检测抗体水平的变化。结果　P30乳酸球菌口服免疫组脾淋巴细胞ConA刺激后增殖能力比两对照组显著提高 ,CD+ 4 和CD+ 8的百分数均明显升高 ;第 12周 (即最后一次免疫结束一个月 ) ,P30乳酸球菌口服免疫组检测到特异性抗体IgG。结论　P30乳酸球菌口服疫苗有效地激发了小鼠细胞免疫反应 ,特异性抗体IgG在免疫结束一个月后生成明显。 展开更多
关键词 弓形虫 p30乳酸球菌口服疫苗 诱导 小鼠 细胞免疫反应 抗体生成 动态过程
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弓形虫表面抗原P22、P30复合基因在原核细胞中表达的研究 被引量：7
15
作者 古钦民 王伟 +4 位作者 卞继峰 丛华 胡海燕 何深一 李瑛 《山东大学学报（医学版）》 CAS 2002年第2期123-124,127,共3页
目的 :对含有P2 2、P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达 ,进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性。方法 :用IPTG对工程菌进行诱导表达 ,表达产物行SDS PAGE蛋白凝胶电泳及Western Blot免疫印记检测。结果 :蛋白电泳结果显示 ,阳... 目的 :对含有P2 2、P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达 ,进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性。方法 :用IPTG对工程菌进行诱导表达 ,表达产物行SDS PAGE蛋白凝胶电泳及Western Blot免疫印记检测。结果 :蛋白电泳结果显示 ,阳性重组菌比阴性菌在 6 6 .5KDa位置上明显多一条带 ,此条带可与P30抗体结合并使免疫印记显示阳性结果。结论 :含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体经诱导表达出融合蛋白 ,其内的组分蛋白P30具有与其相应抗体结合的能力。 展开更多
关键词 弓形虫 基因 p30 基因 P22 基因表达
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弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导的细胞免疫应答 被引量：16
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作者 周永安 陈观今 +2 位作者 郭虹 郑焕钦 吕芳丽 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1999年第3期11-13,共3页
目的用pcDNA_3－P30真核表达质粒直接免疫小鼠，观察所诱导的小鼠细胞免疫应答。方法大量制备量级质粒pcDNA_3－P30，经肌肉注射BALB／c小鼠，每隔3周接种1次，一共免疫3次。用MTT方法对脾脏的NK杀伤细胞率和淋巴细胞的转化率进行测定... 目的用pcDNA_3－P30真核表达质粒直接免疫小鼠，观察所诱导的小鼠细胞免疫应答。方法大量制备量级质粒pcDNA_3－P30，经肌肉注射BALB／c小鼠，每隔3周接种1次，一共免疫3次。用MTT方法对脾脏的NK杀伤细胞率和淋巴细胞的转化率进行测定，采用免疫荧光法对CD4+、CD8+细胞进行测定。结果实验组NK细胞杀伤率为：70．0％±3．64，对照组及空白对照组分别为48．5％±6．06和470％±5．93，实验组NK细胞活性比对照组明显增高（P＜0．05）；ConA刺激小鼠淋巴细胞转化实验，实验组与对照组及空白对用级差异无显著性（P＞0．05）;对T淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋进行动态分析，可见随着感染时间的延长，CD8＋的数量逐渐上升，CD4＋／CD8＋的比率逐渐下降，实验组与对照组及空白对照有明显差异（P＜0．05）。结论重组质粒pcDNA3-p30免疫BALB／c小鼠可诱导一定的细胞免疫。 展开更多
关键词 弓形虫 DNA疫苗 p30基因 细胞免疫应答
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绵羊肺炎支原体Y98 P30基因的克隆、表达及免疫试验 被引量：8
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作者 赵红艳 刘文青 +3 位作者 车腾飞 卢金华 宋静岚 赵宝华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期397-400,405,共5页
根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白P30基因序列设计引物,通过PCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白P30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOP30基因与Mhp P30基因核苷酸序列同源性为... 根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白P30基因序列设计引物,通过PCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白P30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOP30基因与Mhp P30基因核苷酸序列同源性为79%。抗原表位及跨膜结构预测的结果表明,MO P30基因与Mhp P30基因的抗原表位及跨膜结构均具有高度的一致性。该片段中含1个TGA编码Trp,而不是终止密码子。将P30基因与原核表达载体pET-28a连接构建pET-28a-P30表达质粒,转化受体菌Rossta得到重组菌株Rossta(pET-28a-P30)。经诱导后SDS-PAGE表明有30 000左右的目的条带出现;Western blot表明Rossta(pET-28a-P30)表达的30 000蛋白主要以包涵体的形式存在;小鼠免疫试验表明Rossta(pET-28a-P30)原核表达的蛋白对小鼠具有一定的保护作用。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体Y98 p30基因 基因表达 免疫动物
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弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达 被引量：12
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作者 杨秋林 陆惠民 +1 位作者 闵太善 黄伟达 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第4期27-29,共3页
目的　在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ... 目的　在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ,并以SDS -PAGE和Westernblotting进行鉴定。 结果　 1、在我们比较的 783个碱基中 ,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同 ;2、得到一分子量为 5 4kDa的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 38%。结论　 1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异 ;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达。 展开更多
关键词 弓形虫 p30 PCR 基因表达 克隆
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非洲猪瘟病毒p30-54融合蛋白基因的构建、表达及其多克隆抗体制备 被引量：7
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作者 李杰 张星星 +6 位作者 郭晶 孟庆玲 乔军 张国武 王晓婷 李妍 才学鹏 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第9期126-130,共5页
为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片... 为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30-54融合蛋白 大肠杆菌表达系统 多克隆抗体 反应原性
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绵羊肺炎支原体P30-HSP70C融合蛋白的表达及免疫原性研究 被引量：5
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作者 刘文青 胡明丽 +1 位作者 孙红岩 赵宝华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期894-897,共4页
为增强绵羊肺炎支原体标准株Y98的外膜抗原P30的免疫原性,本研究构建p30-hsp70C融合基因的原核重组表达载体,并转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和western blot结果表明,P30-HSP70C融合蛋白约40%以可溶性形式表达。将r P30... 为增强绵羊肺炎支原体标准株Y98的外膜抗原P30的免疫原性,本研究构建p30-hsp70C融合基因的原核重组表达载体,并转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和western blot结果表明,P30-HSP70C融合蛋白约40%以可溶性形式表达。将r P30和r P30-HSP70C以100μg/只剂量分别免疫小鼠,免疫两次。间接ELISA试验表明,免疫的小鼠血清中两种蛋白的抗体效价分别为1∶8 000和1∶128 000。此外,两种蛋白免疫的小鼠血清中均检测出特异性的P30抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,r P30和r P30-HSP70C的免疫保护率分别为50%和80%。这些结果表明P30和HSP70C的融合表达可以显著增强P30蛋白的免疫保护效果。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 p30 HSP70C 克隆 表达 免疫原性
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