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类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)的构建及其在基因组定点修饰中的应用 被引量：5
1
作者 周金伟 王灵慧 +2 位作者 申义君 余树民 曹随忠 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1672-1680,共9页
类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)是一种新发现的基因组定点修饰工具。TALENs由TALE蛋白及II型核酸内切酶Fok I组成,其中TALE由多个重复的氨基酸序列构成,对DNA序列的识别达到一个... 类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)是一种新发现的基因组定点修饰工具。TALENs由TALE蛋白及II型核酸内切酶Fok I组成,其中TALE由多个重复的氨基酸序列构成,对DNA序列的识别达到一个重复单元结合一个碱基的程度,它在结合Fok I内切酶后就形成了具有DNA定点修饰功能的TALENs。该文主要介绍TALENs的构建及其在基因组定点修饰中的应用。 展开更多
关键词 类转录激活因子效应物(TALE) talens 基因敲除 基因组定点修饰 talens构建
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类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术 被引量：52
2
作者 沈延 肖安 +3 位作者 黄鹏 王唯晔 朱作言 张博 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期395-409,共15页
人工构建的序列特异性核酸内切酶能够识别并切割特定的DNA靶序列,造成双链断裂,从而引起基因组结构的定点改变。人工核酸内切酶技术使得研究人员有可能对任意物种的基因组进行定点修饰,开启了反向遗传学研究的新天地。类转录激活因子效... 人工构建的序列特异性核酸内切酶能够识别并切割特定的DNA靶序列,造成双链断裂,从而引起基因组结构的定点改变。人工核酸内切酶技术使得研究人员有可能对任意物种的基因组进行定点修饰,开启了反向遗传学研究的新天地。类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)自2010年底开始成功应用于基因打靶,很快成为一种比锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)更容易设计、特异性更高和毒性更低的人工核酸内切酶。文章综述了TALEN技术的研究进展及应用前景,重点介绍TALEN的结构、作用机制与构建方法和利用TALEN进行基因组定点修饰的策略,以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因,特别是在斑马鱼中的应用,为开展这一领域的研究工作提供参考。 展开更多
关键词 类转录激活因子效应物(TALE) 类转录激活因子效应物核酸酶(talen) 人工核酸内切酶(EEN) 基因组编辑 基因组定点修饰
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ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas基因组靶向编辑技术及其在植物中的应用 被引量：16
3
作者 廖鹏飞 聂旺 +3 位作者 余雅心 童普国 李绍波 朱友林 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期442-451,共10页
锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)和RNA介导的CRISPR-Cas系统是当今三种主要的基因组靶向编辑技术,ZFNs和TALENs由特异性的DNA结合蛋白... 锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)和RNA介导的CRISPR-Cas系统是当今三种主要的基因组靶向编辑技术,ZFNs和TALENs由特异性的DNA结合蛋白融合一个非特异性的核酸酶FokⅠ组成,DNA结合蛋白特异识别并结合靶DNA序列,然后在FokⅠ的作用下引起靶位点的DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs);而CRISPR-Cas系统,则是由小分子向导RNA通过碱基互补配对与靶基因组序列结合,而引导Cas核酸酶切割靶位点而引起DSBs。DSBs通过真核细胞DNA修复机制(非同源末端连接和同源重组)进行修复,从而实现基因组靶向编辑。本综述着重介绍这三种技术的基本结构及其基因组靶向编辑的原理和特点,对三种技术在植物中的应用进展进行介绍并对其进一步的发展提出了展望。 展开更多
关键词 基因组靶向编辑技术 ZFNs talens CRISPR/Cas 基因打靶 DNA双链断裂(DSBs)
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利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除Myostatin基因 被引量：8
4
作者 杨翠翠 佟慧丽 +4 位作者 马兴红 杜巍 刘丹 杨宇 严云勤 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期685-690,共6页
肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节骨骼肌的生长和发育,牛MSTN基因突变会出现"双肌"特征。文章利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎儿成纤维细胞的MSTN基因,获得敲除MSTN基因的细胞系,为制备M... 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节骨骼肌的生长和发育,牛MSTN基因突变会出现"双肌"特征。文章利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎儿成纤维细胞的MSTN基因,获得敲除MSTN基因的细胞系,为制备MSTN基因敲除牛提供材料。构建一对MSTN基因的TALENs真核表达载体,分别采用PEI转染试剂和电穿孔法进行牛胎儿成纤维细胞的转染,测序结果表明TALEN技术可用于敲除牛MSTN基因,利用T7核酸内切酶1(T7E1)检测其突变效率,结果显示电穿孔转染的敲除效率为20.4%。通过有限稀释法,共获得10个MSTN基因敲除的细胞克隆(包括MSTN-/-和MSTN+/-),其靶位点敲除的碱基数分别是1～20不等,部分会出现移码突变。出现移码突变的细胞系可用于MSTN基因敲除的转基因肉牛的制备。 展开更多
关键词 talens 牛 MYOSTATIN 敲除 转染
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TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程 被引量：21
5
作者 沈延 黄鹏 张博 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期533-544,共12页
类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要... 类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA双链断裂,从而诱导该靶序列产生indel突变,目前已成功地应用于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。文章介绍TALEN靶点的选择与确认,采用"单元组装法"构建人工TALEN的原理与步骤,以及通过显微注射TALEN mRNA诱导并筛选斑马鱼突变体的实验流程与经验。这些方法理论上也适用于对其他物种进行基因打靶。 展开更多
关键词 类转录激活因子效应物核酸酶(talen) 斑马鱼 基因组定点突变 基因打靶 反向遗传学技术
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TALEN介导的MYH9基因沉默及对细胞周期与凋亡的影响 被引量：8
6
作者 朱显军 邓海军 +6 位作者 叶耿泰 沈智勇 李风萍 郭伟洪 杨庆斌 刘浩 李国新 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期375-380,共6页
目的利用TALEN技术敲除人胃癌细胞系MGC803细胞株MYH9基因,观察MYH9基因沉默后细胞周期及凋亡改变。方法根据斯丹赛Fast TALETMTALEN试剂盒说明书,设计并构建靶向MYH9基因的TALEN质粒对。通过质粒转染、DNA测序、RT-PCR和Western blot... 目的利用TALEN技术敲除人胃癌细胞系MGC803细胞株MYH9基因,观察MYH9基因沉默后细胞周期及凋亡改变。方法根据斯丹赛Fast TALETMTALEN试剂盒说明书,设计并构建靶向MYH9基因的TALEN质粒对。通过质粒转染、DNA测序、RT-PCR和Western blot等检测质粒活性,成功挑取MYH9基因敲低单克隆株,并对构建好的细胞株进行周期和凋亡检测。结果成功挑选的MGC803单克隆细胞株未检测到MYH9基因完全敲除;MYH9基因敲低后,MGC803细胞周期受阻于G2/M期(P<0.05),早期凋亡增加(P<0.05)。结论利用TALEN技术成功构建MGC803细胞MYH9基因敲低单克隆株,该模型有助于后期深入探讨胃癌MYH9基因功能。 展开更多
关键词 talen技术 MYH9 细胞周期 细胞凋亡
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TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化 被引量：3
7
作者 严爱芬 刘婉霞 +3 位作者 刘芳 刘靖 张雅洁 唐冬生 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2554-2559,共6页
本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光... 本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。 展开更多
关键词 转染 优化 talen HEK-293T
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TALENs介导的Nanog基因表达下调对宫颈癌HeLa细胞恶性行为的影响 被引量：3
8
作者 于爱清 李成林 +1 位作者 杨毅 严世荣 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期23-27,共5页
目的研究Nanog表达下调对宫颈癌HeLa细胞恶性行为的影响。方法通过基因编辑工具转录激活样效应器核酸酶(TALENs)介导Nanog下调表达,基因测序分析Nanog的突变情况;挑取单个细胞培养以筛选出Nanog明显下调表达的单克隆HeLa细胞;RT-PCR检测... 目的研究Nanog表达下调对宫颈癌HeLa细胞恶性行为的影响。方法通过基因编辑工具转录激活样效应器核酸酶(TALENs)介导Nanog下调表达,基因测序分析Nanog的突变情况;挑取单个细胞培养以筛选出Nanog明显下调表达的单克隆HeLa细胞;RT-PCR检测mRNA表达水平;Western blot检测蛋白表达水平;HeLa细胞的集落形成能力、侵袭性及耐药性分别通过集落形成实验、Transwell侵袭实验及药物敏感性实验检测。结果 TALENs成功介导Nanog基因突变并导致其下调表达,Nanog突变的单克隆HeLa细胞Nanog mRNA和蛋白表达水平较野生型HeLa细胞均下调表达(P<0.05)。Nanog突变单克隆HeLa细胞相对于野生型HeLa细胞表现出明显减弱的侵袭、集落形成及化疗药物抵抗能力(P<0.05)。结论 Nanog突变减弱HeLa细胞的恶性行为,下调或沉默Nanog表达有望成为一种新型的治疗宫颈癌策略。 展开更多
关键词 talens NANOG HELA细胞 宫颈癌
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ZFN,TALEN和CRISPR/Cas9在小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的效率比较 被引量：2
9
作者 刘小凤 刘蔚 +4 位作者 聂宇 丛佩清 刘小红 陈瑶生 何祖勇 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期137-144,共8页
哺乳动物黑色素的合成依赖于酪氨酸的氧化作用,而酪氨酸酶(Tyr)是催化酪氨酸氧化反应的关键酶,当外源Tyr基因整合进白毛色小鼠基因组中,会使它获得黑色素合成的能力,表现出与原来不同的毛色表型。为方便、快捷地获得Tyr基因整合的小鼠,... 哺乳动物黑色素的合成依赖于酪氨酸的氧化作用,而酪氨酸酶(Tyr)是催化酪氨酸氧化反应的关键酶,当外源Tyr基因整合进白毛色小鼠基因组中,会使它获得黑色素合成的能力,表现出与原来不同的毛色表型。为方便、快捷地获得Tyr基因整合的小鼠,构建了一个无启动子的pTyr-2A-DsRed同源重组质粒供体,选择Rosa26的第一个内含子作为外源基因整合的靶位点,设计了切割位点几乎一致的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统。通过流式对比分析C 2C 12细胞中红色荧光蛋白DsRed的表达水平,比较了3种基因组编辑工具介导的外源基因定点整合效率,结果发现CRISPR/Cas9的效率最高,在此基础上,利用CRISPR/Cas9将供体整合到小鼠胚胎干细胞中,筛选单细胞克隆进行囊胚腔注射和胚胎移植,获得一只存活的嵌合体小鼠,表现出白毛中夹杂黑毛的表型,表明整合到小鼠Rosa26的Tyr基因可以正常表达。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 talen ZFN Rosa26 定点整合
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SD大鼠超排及TALEN质粒显微注射构建基因敲除大鼠 被引量：4
10
作者 卞洲艳 杨政 +3 位作者 徐蔓 张洁钰 廖海含 唐其柱 《海南医学》 CAS 2013年第21期3121-3125,共5页
目的 应用TALEN技术构建基因敲除大鼠,并探讨SD大鼠超数排卵、显微注射浓度、胚胎移植方式对构建大鼠出生率、阳性率的影响.方法 将SD雌鼠超数排卵后,取受精卵显微注射由TALEN质粒体外转录成的mRNA,注射后存活的受精卵输卵管移植,观察... 目的 应用TALEN技术构建基因敲除大鼠,并探讨SD大鼠超数排卵、显微注射浓度、胚胎移植方式对构建大鼠出生率、阳性率的影响.方法 将SD雌鼠超数排卵后,取受精卵显微注射由TALEN质粒体外转录成的mRNA,注射后存活的受精卵输卵管移植,观察大鼠的出生率,并测序判定出生大鼠的基因敲除阳性率.结果 4～5周和5～6周的雌鼠超数排卵见栓率[（74±9）％vs（77±6％）％]、取卵数量[（25±2）枚vs （23±2）枚]以及卵的受精率[（85±2）％vs（93±2）％]差异均无统计学意义（P＞0.05）;结扎公鼠和受体雌鼠在8～10周时见栓率最高[（23.02±5.26％）％],使用12周后见栓率明显下降[（11.66±2.40）％];单侧和双侧输卵管移植大鼠出生率差异无统计学意义（37.88％ vs 36.49％）,但单侧移植大鼠存活率高于双侧移植（37.88％ vs 20.27％,P＜0.05）,且单细胞移植大鼠出生率显著高于双细胞移植.质粒注射浓度在20 ng/μl组大鼠基因敲除阳性率最高（7.5％）.结论 应用TALEN技术成功构建基因敲除大鼠,显微注射质粒浓度20 ng/μl时大鼠出生率不受影响且基因敲除阳性率最高. 展开更多
关键词 SPRAGUE-DAWLEY大鼠 talen 显微注射 敲除
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TALENs:一种新的基因定点修饰技术 被引量：10
11
作者 张金脉 任兆瑞 《生命科学》 CSCD 2013年第1期126-132,共7页
转录激活因子样效应蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN),由TALE(transcription activator-like effector)结构域和Fok I核酸内切酶结构域人工融合而成,它是近几年发展起来的一种可对基因组定点改造的新... 转录激活因子样效应蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN),由TALE(transcription activator-like effector)结构域和Fok I核酸内切酶结构域人工融合而成,它是近几年发展起来的一种可对基因组定点改造的新技术。TALEN能够特异识别一段DNA序列,并能够对双链DNA进行切割,TALEN造成DNA断裂后可以启动细胞对DNA的修复,从而实现特定位点的基因操作如基因敲除、基因敲进、基因修复等。相比ZFNs,TALENs的获得更为容易、效果更为明显,它在理论上真正实现了对任意序列进行基因操作的可能。综述了TALEN技术的研究发展过程、结构与作用机制、构建TALEN的方法,以及目前这一技术的应用等。 展开更多
关键词 talen 基因定点修饰技术 作用机制 构建方法
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TALENs:植物基因组定点剪辑的分子剪 被引量：4
12
作者 赵开军 杨兵 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第14期2787-2792,共6页
随着高通量DNA测序技术的发展,获取生物全基因组序列已不再困难。结构基因组学和功能基因组学的巨大进展,使人类全面解码生物基因组的梦想正在逐步实现。接下来的问题是:如何按照人们的意愿对生物基因组进行定点改造?科学家早在1988年... 随着高通量DNA测序技术的发展,获取生物全基因组序列已不再困难。结构基因组学和功能基因组学的巨大进展,使人类全面解码生物基因组的梦想正在逐步实现。接下来的问题是:如何按照人们的意愿对生物基因组进行定点改造?科学家早在1988年就开始探索植物基因组的定点改造技术,但进展十分缓慢。2009年,关于黄单胞菌效应子蛋白TAL effector与寄主靶基因DNA特异性识别分子密码的破解,使植物基因组定点改造呈现出新的曙光,目前已研发出可以对生物基因组进行定点剪辑的新技术——TALENs(TAL effector nucleases)。由于TAL effector识别DNA碱基的模式具有高度的专一性,而且可以简便地组装出特异性结合任意DNA序列的模块化蛋白,因此,TALENs成为目前最有发展前景的基因组修饰技术。本文综述了TALENs研发的背景、结构、工作原理和技术特点,重点介绍了利用TALENs定点改造植物基因组的一般策略和技术方案,最后对TALENs定点改造植物基因组的应用前景进行了讨论。 展开更多
关键词 talens 基因组定点剪辑 TAL效应子 植物遗传改良
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利用TALENs技术制备瘦素基因敲除的大鼠 被引量：2
13
作者 关菲菲 张旭 +3 位作者 陈炜 董伟 高凯 张连峰 《中国比较医学杂志》 CAS 2013年第8期38-43,F0003,共7页
目的瘦素(leptin)是一种调节机体摄食和能量代谢的细胞因子,也参与神经细胞发育、免疫、糖脂代谢等,由于大鼠在代谢和神经研究等方面的优点,研制leptin基因敲除大鼠(leptin-/-),为这几方面的深入研究提供模型。方法利用类转录激活因子... 目的瘦素(leptin)是一种调节机体摄食和能量代谢的细胞因子,也参与神经细胞发育、免疫、糖脂代谢等,由于大鼠在代谢和神经研究等方面的优点,研制leptin基因敲除大鼠(leptin-/-),为这几方面的深入研究提供模型。方法利用类转录激活因子效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术,制备leptin-/-大鼠。利用称量方法测定不同时间点的体重变化,利用磁共振成像观测大鼠脂肪积累及分布,利用病理学方法观察胰腺的病理变化,并进行血生化、腹腔糖耐受实验及葡萄糖刺激下的血清胰岛素含量测定。结果获得一个在leptin基因编码区418～425位有8个碱基缺失的首建鼠,由于产生了TGA终止密码子,使该蛋白C末端缺失了28个氨基酸。Leptin-/-大鼠从5周龄开始出现显著的体重增加,到4月龄时体重比野生SD大鼠(leptin+/+)增加了52%。2月龄MRI结果显示leptin-/-大鼠与leptin+/+大鼠相比,在腹腔和皮下均有更多的脂肪积累,同时病理观察也发现leptin-/-大鼠胰腺中胰岛细胞显著增生。4月龄时,leptin-/-大鼠的血清中甘油三酯和胆固醇含量分别是leptin+/+大鼠的8.4倍和1.8倍,同时出现了明显的糖耐受受损和高胰岛素血症。结论利用TALENs技术成功建立了瘦素基因敲除大鼠,并表现出明显的肥胖、高胰岛素血、高脂血和糖代谢异常。结果表明:该敲除大鼠可作为代谢、神经、免疫等研究的潜在模型。 展开更多
关键词 talens技术 瘦素 基因敲除大鼠 肥胖 脂质代谢 糖代谢
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利用TALEN技术高效制备TXNIP基因敲除小鼠模型 被引量：1
14
作者 张欢欢 刘楚新 +4 位作者 马月 肖丽萍 李飞达 应华忠 刘欢 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2015年第6期9-13,共5页
目的利用显微注射技术注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA获得TXNIP敲除小鼠。方法在线设计Txnip敲除位点,构建TALEN载体并在细胞水平验证剪切活性,体外转录TALENs成mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL/6J小鼠受精卵,对F0代小鼠进行DNA水平... 目的利用显微注射技术注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA获得TXNIP敲除小鼠。方法在线设计Txnip敲除位点,构建TALEN载体并在细胞水平验证剪切活性,体外转录TALENs成mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL/6J小鼠受精卵,对F0代小鼠进行DNA水平鉴定获得TXNIP敲除小鼠。结果在Txnip第一外显子上设计了TALEN识别剪切位点,并在细胞水平验证具有剪切活性,注射mRNA到受精卵获得了4只敲除小鼠,其中2只Txnip发生移码突变,成功制备了TXNIP敲除小鼠。结论通过注射TALENs mRNA可以高效制备TXNIP敲除小鼠。 展开更多
关键词 talen 显微注射 TXNIP 基因敲除 模型 小鼠
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TALEN敲除蒙古牛肌肉生长抑制素基因的细胞系建立 被引量：1
15
作者 马云龙 张立 +3 位作者 苏小虎 张纬 张焱如 周欢敏 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2016年第15期67-70,共4页
本研究拟通过TALEN敲除蒙古牛肌肉生长抑制素基因,构建无标记敲除细胞系,为后续研究做准备。通过组织块法建立成纤维原代细胞系,核转法转染TALEN质粒对,单细胞接种建立单细胞株,测序鉴定阳性细胞株。共培养87个单细胞株,测序分析1个细... 本研究拟通过TALEN敲除蒙古牛肌肉生长抑制素基因,构建无标记敲除细胞系,为后续研究做准备。通过组织块法建立成纤维原代细胞系,核转法转染TALEN质粒对,单细胞接种建立单细胞株,测序鉴定阳性细胞株。共培养87个单细胞株,测序分析1个细胞株发生了双敲除突变,效率为1.1%。本试验得到了1个肌抑素双突变细胞株,可以作为供体细胞进行核移植生产无标记肌抑素基因敲除蒙古牛,为蒙古牛的改良奠定了一定研究基础。 展开更多
关键词 肌抑素 talen 无标记细胞系 蒙古牛
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应用TALENs技术定向敲除烟草eIF4E-6基因 被引量：2
16
作者 宋琳娜 杨鹏九 +6 位作者 万秀清 乔婵 潘洪杏 郭振楠 刘侠 郭兆奎 李若 《安徽农业科学》 CAS 2017年第4期142-146,共5页
[目的]利用TALENs技术定向敲除烟草eIF4E-6基因,为提高优质烤烟品种K326的马铃薯Y病毒(PVY)抗性提供材料。[方法]构建特异靶向烟草eIF4E-基因的TALENs载体,并由农杆菌介导转化K326烟草,用PCR和克隆测序方法筛选目的基因被成功编辑的T_0... [目的]利用TALENs技术定向敲除烟草eIF4E-6基因,为提高优质烤烟品种K326的马铃薯Y病毒(PVY)抗性提供材料。[方法]构建特异靶向烟草eIF4E-基因的TALENs载体,并由农杆菌介导转化K326烟草,用PCR和克隆测序方法筛选目的基因被成功编辑的T_0代转基因烟株。[结果]构建了2个特异靶向eIF4E-6基因的TALENs载体T_3和T_4。2个载体各获得了约40和50株阳性转化的K326 T_0代烟株。T_3载体获得1株目的基因靶位点发生大片段碱基缺失的杂合突变型T_0代单株、3株靶位点发生碱基替换的杂合突变型T_0代单株。T_4载体获得5株靶位点发生碱基替换的杂合突变型T_0代单株。[结论]利用TALENs技术获得的eIF4E-6基因杂合突变型K326 T_0代单株为后续获得纯合基因敲除的K326烟草,并最终获得PVY病毒抗性改良的K326烟草材料奠定了基础。 展开更多
关键词 烟草 PVY K326 eIF4E-6基因 talens
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基于比较转录组的水稻苗期耐冷相关基因BGIOSGA032296 TALEN基因组编辑技术构建 被引量：2
17
作者 沈春修 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2017年第3期13-20,共8页
为了挖掘水稻苗期耐冷基因,基于比较转录组分析,参考公共数据库中的基因序列信息设计靶位点,对冷胁迫条件下东乡野生稻苗期下调表达耐冷相关基因BGIOSGA032296进行TALEN基因组编辑技术构建,克隆酶切鉴定和序列比对结果表明,BGIOSGA03229... 为了挖掘水稻苗期耐冷基因,基于比较转录组分析,参考公共数据库中的基因序列信息设计靶位点,对冷胁迫条件下东乡野生稻苗期下调表达耐冷相关基因BGIOSGA032296进行TALEN基因组编辑技术构建,克隆酶切鉴定和序列比对结果表明,BGIOSGA032296 TALEN敲除植物表达载体1301TALEN-032296构建成功,利用农杆菌介导法将TALEN敲除植物表达载体1301TALEN-032296转入水稻受体品种TP309,获得了17株转基因水稻植株,经潮霉素抗性标记基因和Fok I基因特异引物PCR检测,表明获得的转基因植株皆为携带1301TALEN-032296的阳性植株。该研究为水稻BGIOSGA032296基因后续耐冷表型鉴定奠定了前期基础。 展开更多
关键词 比较转录组 东乡野生稻 talen基因组编辑技术
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TALEN表达载体构建技术研究进展 被引量：1
18
作者 杨潇 《西华大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第4期58-64,共7页
转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALEN)是最新出现的基因组定点修饰技术之一。该技术在应用过程中为保证靶点序列的特异性,编码转录激活因子样效应物(TALE)结构域的序列一般较长,这使得TALEN表达载体的构建成为该技术的一个关键步骤和应... 转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALEN)是最新出现的基因组定点修饰技术之一。该技术在应用过程中为保证靶点序列的特异性,编码转录激活因子样效应物(TALE)结构域的序列一般较长,这使得TALEN表达载体的构建成为该技术的一个关键步骤和应用中的主要瓶颈,为此发展了多种TALEN表达载体构建方法。本文主要对其中常见的Golden Gate法、REAL法、单元组装法、FLASH法、ICA法、LIC法等方法及其研究进展进行了总结。随着TALEN表达载体构建方法的进一步丰富和普及,该技术必将在生物基因功能研究、农作物和家畜性状改良、人类遗传疾病治疗方面展现出广阔的应用前景。 展开更多
关键词 转录激活因子样效应蛋白核酸酶 talen表达载体 构建技术
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利用TALENs技术建立基因定点修饰的猪Oct-4-EGFP细胞系
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作者 刘畅 冯冲 +4 位作者 宋志强 李西睿 王宁 储明星 潘登科 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第11期1-6,共6页
本研究旨在建立一个用于干细胞示踪的报告体系,将EGFP cDNA及两侧带有LoxP位点的neo抗性基因插入五指山小型猪内源性Oct-4基因的终止密码子处,以Oct-4基因完整的5′调控区启动EGFP的表达,为猪干细胞研究提供有价值的工具。试验定制了针... 本研究旨在建立一个用于干细胞示踪的报告体系,将EGFP cDNA及两侧带有LoxP位点的neo抗性基因插入五指山小型猪内源性Oct-4基因的终止密码子处,以Oct-4基因完整的5′调控区启动EGFP的表达,为猪干细胞研究提供有价值的工具。试验定制了针对猪Oct-4终止密码子的TALENs,与打靶载体共转染猪耳成纤维细胞,药物筛选得到抗性克隆点514个,经过PCR鉴定,共获得杂合阳性克隆点36个,打靶效率分别为5.6%和13.0%。本研究成功获得了Oct-4-EGFP转基因细胞系,并证明了TALENs技术可以明显提高同源重组效率。 展开更多
关键词 Oct-4-EGFP talens 同源重组 猪 干细胞 多能性
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水稻叶绿体TALEN载体的构建及在大肠杆菌中的表达
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作者 方真 李丁 +2 位作者 沈春修 夏玉梅 曹孟良 《杂交水稻》 CSCD 北大核心 2015年第2期63-68,共6页
将类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)打靶技术运用到水稻叶绿体转化体系中,有可能提高外源基因在水稻叶绿体基因组中的整合效率。根据叶绿体表达载体上的同源重组序列,构建了水稻叶绿... 将类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)打靶技术运用到水稻叶绿体转化体系中,有可能提高外源基因在水稻叶绿体基因组中的整合效率。根据叶绿体表达载体上的同源重组序列,构建了水稻叶绿体TALEN载体,经分子检测和DNA测序分析证明载体构建成功;将该载体转化大肠杆菌,载体上携带的EGFP、hpt和Fok基因在大肠杆菌中得到成功表达,说明构建的水稻叶绿体TALEN载体能够在原核系统中有效表达。 展开更多
关键词 talen载体 水稻叶绿体 表达
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