猪丹毒杆菌SpaA优势表位的串联表达及其免疫效果分析

1

作者 李建 张一帜 +7 位作者 李俊平 王秀丽 刘元杰 李旭妮 王甲 彭国瑞 张媛 刘燕 《中国兽药杂志》 2024年第3期10-15,共6页

构建串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗,对其免疫原性进行研究。将猪丹毒杆菌表面保护抗原A优势表位串联表达,提取并经亲和层析纯化获得重组蛋白,制备亚单位疫苗,分别免疫小鼠和猪,21日后攻毒。成功制备串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单... 构建串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗,对其免疫原性进行研究。将猪丹毒杆菌表面保护抗原A优势表位串联表达,提取并经亲和层析纯化获得重组蛋白,制备亚单位疫苗,分别免疫小鼠和猪,21日后攻毒。成功制备串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗,2μg重组蛋白可为小鼠抵抗1000MLD强毒攻击提供100%保护,100μg重组蛋白可为猪抵抗1MLD强毒攻击提供100%保护,可为猪抵抗2MLD强毒攻击提供67%保护。串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 串联 spaa 优势表位 猪丹毒 疫苗 免疫原性 攻毒保护

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表达红斑丹毒丝菌SpaA和CbpB蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建及其在小鼠上的免疫原性评价 被引量：2

2

作者 程中林 黄浩 +3 位作者 曹思艺 石华辉 高继业 李继祥 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期4521-4532,共12页

为了构建表达红斑丹毒丝菌SpaA和CbpB蛋白的口服重组枯草芽孢杆菌活载体候选疫苗菌株,经融合PCR及无缝克隆构建了重组整合质粒pDG1730-CBJA,使用自然法转化枯草芽孢杆菌KC菌株,通过壮观霉素抗性平板筛选、淀粉降解实验及PCR检测获得重组... 为了构建表达红斑丹毒丝菌SpaA和CbpB蛋白的口服重组枯草芽孢杆菌活载体候选疫苗菌株,经融合PCR及无缝克隆构建了重组整合质粒pDG1730-CBJA,使用自然法转化枯草芽孢杆菌KC菌株,通过壮观霉素抗性平板筛选、淀粉降解实验及PCR检测获得重组菌KC-spaA-cbpB。用免疫印迹及间接免疫荧光实验检测重组菌表达的SpaA和CbpB蛋白,并测定了重组菌在小鼠体内的遗传稳定性。构建壮观霉素抗性基因敲除质粒pMAD-△spe^(r),转化KC-spaA-cbpB,筛选、鉴定获得KC-spaA-cbpB::△spe^(r),并进行了小鼠的口服免疫实验。实验结果显示,重组菌KC-spaA-cbpB在菌体表面表达SpaA蛋白,在芽孢表面表达CbpB蛋白,在小鼠体内稳定。壮观霉素抗性基因敲除菌KC-spaA-cbpB::△spe^(r)能表达SpaA和CbpB蛋白,其芽孢经灌胃免疫小鼠42d后,小鼠血清中SpaA和CbpB蛋白的特异性抗体IgG和粪便中特异性sIgA均极显著高于阴性对照(P<0.01),攻毒保护率为67.5%。本研究成功构建了表达红斑丹毒丝菌SpaA和CbpB蛋白的重组枯草芽孢杆菌,为研究猪丹毒口服活载体疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 红斑丹毒丝菌 spaa蛋白 CbpB蛋白 枯草芽孢杆菌

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猪丹毒杆菌SpaA单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

3

作者 黄雅琴 蔡金双 +1 位作者 缪芬芳 李玉峰 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第9期84-90,共7页

旨在制备猪丹毒杆菌单克隆抗体,并确定其识别的抗原表位。采用原核表达、细胞融合试验、间接ELISA、亚克隆技术、Western blot、抗原表位以及抗体分型鉴定来研究猪丹毒杆菌表面保护性抗原A(SpaA)的单克隆抗体。结果:制备了SpaA重组蛋白... 旨在制备猪丹毒杆菌单克隆抗体,并确定其识别的抗原表位。采用原核表达、细胞融合试验、间接ELISA、亚克隆技术、Western blot、抗原表位以及抗体分型鉴定来研究猪丹毒杆菌表面保护性抗原A(SpaA)的单克隆抗体。结果:制备了SpaA重组蛋白,得到4株稳定分泌的单抗,且这4株单抗均能与SpaA蛋白发生特异性反应,其中1E8、5B3杂交瘤细胞培养上清液抗体效价为1∶1600,5B5、9B5杂交瘤细胞培养上清液抗体效价为1∶3200;1E8重链为IgG 2b,5B3、9B5重链为IgG 1,5B5重链为IgG 2a,轻链均为Kappa;1E8、5B5识别的抗原表位因SpaA蛋白C端的重复序列无法确认,5B3识别的抗原表位为258~267 aa,9B5识别的抗原表位为462~472 aa。综上,本研究制备的单克隆抗体将为猪丹毒杆菌ELISA检测方法的建立奠定基础。 展开更多

关键词 猪丹毒杆菌 spaa蛋白 原核表达 单克隆抗体

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猪丹毒杆菌的分离鉴定及其SpaA基因的遗传变异分析 被引量：26

4

作者 车勇良 陈如敬 +5 位作者 王隆柏 魏宏 吴学敏 俞玉鸿 庄向生 周伦江 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1591-1593,1604,共4页

为确定导致福建某猪场猪只发病的病原,从病猪心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验及PCR鉴定,确定为猪丹毒杆菌。SpaA基因测序结果表明该分离菌在第609位点处出现了由胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,对应的氨基酸是由甲硫... 为确定导致福建某猪场猪只发病的病原,从病猪心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验及PCR鉴定,确定为猪丹毒杆菌。SpaA基因测序结果表明该分离菌在第609位点处出现了由胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,对应的氨基酸是由甲硫氨酸突变为异亮氨酸。致病性试验结果表明,2.1×108 CFU/mL的菌液10倍稀释后,感染28日龄健康昆明小鼠,该分离菌对28日龄健康小鼠的半数致死量为2.1×103.5 CFU/mL,死亡小鼠的剖解病变表现为心肌有白色坏死点,肝脏实变、坏死,肺出血和脾脏梗死等,并分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对青霉素、红霉素、氨苄青霉素、强力霉素、先锋霉素、阿奇霉素等较为敏感。 展开更多

关键词 猪丹毒杆菌 分离鉴定 spaa基因 遗传变异

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猪丹毒丝菌C43311株spaA基因N端免疫保护区的克隆和表达 被引量：11

5

作者 吾鲁木汗·那孜尔别克 刘祝祥 +2 位作者 李科 陈义光 恩特马克·布拉提白 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期207-212,共6页

采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核... 采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-SpaA-N,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。测序结果表明spaA基因片段大小为1881bp,与已报道的不同血清型菌株spaA基因的核苷酸序列比较,核苷酸序列同源性在93%～99%之间。SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为64kDa,与预期的大小相近。Western印迹检测结果表明,表达的融合蛋白GST-SpaA-N能与C43311株SpaA蛋白的抗血清发生特异性反应,证明原核融合表达蛋白具有免疫反应性。 展开更多

关键词 猪丹毒丝菌 spaa基因 融合蛋白 免疫反应性 原核表达

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猪丹毒杆菌SpaA基因的生物信息学分析 被引量：11

6

作者 卢琴 李明波 +3 位作者 彭先文 宋忠旭 雷彬 梅书棋 《动物医学进展》 北大核心 2015年第9期23-27,共5页

旨在对猪丹毒杆菌的SpaA基因进行PCR检测,并对该基因所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。首先对猪丹毒杆菌SpaA基因进行PCR检测,后将SpaA基因的保守区域进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增得到了与猪丹毒杆菌SpaA基因大小一致的1... 旨在对猪丹毒杆菌的SpaA基因进行PCR检测,并对该基因所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。首先对猪丹毒杆菌SpaA基因进行PCR检测,后将SpaA基因的保守区域进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增得到了与猪丹毒杆菌SpaA基因大小一致的1 531bp片段,二级结构的预测结果显示,该蛋白主要以螺旋、无规则卷曲为主,只有少数的伸展链。推测该蛋白有4个B细胞抗原表位区域。该研究为猪场猪丹毒杆菌病的检测提供了试验数据,也为阐明猪丹毒杆菌病的免疫机理和制备表位疫苗等奠定理论基础。 展开更多

关键词 猪丹毒 PCR检测 spaa 生物信息学分析

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红斑丹毒丝菌SpaA抗原基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测 被引量：6

7

作者 李伟杰 赵耘 +3 位作者 康凯 岂晓鑫 杜昕波 陈敏 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1631-1634,1639,共5页

参照红斑丹毒丝菌表面抗原A(SpaA)基因的核苷酸序列合成1对引物,对我国生产用红斑丹毒丝菌CVCC43005的SpaA全基因进行了PCR扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,SpaA基因全长1 881bp,含有1个开放性阅读框,编... 参照红斑丹毒丝菌表面抗原A(SpaA)基因的核苷酸序列合成1对引物,对我国生产用红斑丹毒丝菌CVCC43005的SpaA全基因进行了PCR扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,SpaA基因全长1 881bp,含有1个开放性阅读框,编码626个氨基酸。与已提交的红斑丹毒丝菌血清型1a、1b、2a、2b、5、8、9、12、15、16、17、N型的氨基酸同源性为97.5%～100%,血清型4、6、11、19、21的氨基酸同源性为52.8%～55.2%。与已提交的丹毒丝菌血清型18的氨基酸同源性为57.5%～58.0%。采用Chou-Fasman和Karplus-Schulz方案预测蛋白质的二级结构和柔性区域;运用Kyte-Doolittle方案预测氨基酸的亲水性,按Jame-son-Wolf方案预测抗原指数,利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性。对预测结果综合分析,推测最有可能的B细胞表位位于N端的59～64、85～91、174～186、193～201、212～215、221～231、266～275、278～288、291～308、314～327、329～349、356～376、403～456、508～516、528～537、568～576和607～626。 展开更多

关键词 红斑丹毒丝菌 spaa基因 克隆和序列分析 结构预测

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丹毒丝菌spaA基因免疫保护区的克隆与功能研究 被引量：5

8

作者 曹文尧 李江伟 +2 位作者 吕芳 侯秋莲 张富春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期496-500,共5页

本研究以丹毒丝菌XJ1249基因组DNA为模板,根据GenBank已发表的丹毒丝菌表面保护性抗原A (SpaA)的序列设计引物进行PCR扩增,得到大小约1 029 bp的spaA基因N端免疫保护片段(spaA-N)。将spaA-N连接到载体pGEX-4T-1上构建重组原核表达质粒pG... 本研究以丹毒丝菌XJ1249基因组DNA为模板,根据GenBank已发表的丹毒丝菌表面保护性抗原A (SpaA)的序列设计引物进行PCR扩增,得到大小约1 029 bp的spaA基因N端免疫保护片段(spaA-N)。将spaA-N连接到载体pGEX-4T-1上构建重组原核表达质粒pGEX-spaA-N,对重组质粒进行序列验证后,在IPTG的诱导下,表达和纯化重组蛋白r-SpaA-N,并研究其对小鼠的免疫保护作用。结果显示:分离纯化的重组蛋白具有免疫原性,并对小鼠具有免疫保护性,能够有效防止丹毒丝菌对小鼠的侵染。研究结果为进一步研究丹毒丝菌致病机理,开发新的猪丹毒诊断试剂盒和亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 丹毒丝菌 spaa基因 克隆

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猪丹毒丝菌的分离鉴定及其SpaA基因高变区域的序列分析 被引量：8

9

作者 彭凌 杨旭夫 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1727-1732,共6页

为确定来自广东韶关某猪场猪只发病的病原,从送检材料中分离纯化细菌,共分离到3株细菌,根据3株菌的形态特征、生化试验、16SrRNA基因序列结果确定3株细菌均为猪丹毒丝菌。药敏试验结果表明,3个菌株对22种常用抗生素表现出耐药。SpaA基因... 为确定来自广东韶关某猪场猪只发病的病原,从送检材料中分离纯化细菌,共分离到3株细菌,根据3株菌的形态特征、生化试验、16SrRNA基因序列结果确定3株细菌均为猪丹毒丝菌。药敏试验结果表明,3个菌株对22种常用抗生素表现出耐药。SpaA基因432bp高变区域的序列测定结果表明,3个菌株的序列一致,但区分于GC42株;将该序列在GenBank中进行Blast比对,获得39个高度同源的猪丹毒丝菌的SpaA基因序列;将所有43个序列采用MEGA5.05软件进行序列比对,发现5个氨基酸位点替换,根据这种多态性,可将所有菌株分为5个SpaA型,国内流行SpaAⅡ、Ⅲ、Ⅳ型,其中SpaAⅡ最流行,占分析的国内菌株的75%。 展开更多

关键词 猪丹毒丝菌 spaa基因 16S RRNA 药敏试验

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鼠李糖乳杆菌菌毛SpaA亚基的表达、抗体制备及其种属特异性研究

10

作者 魏永峰 杨振泉 +4 位作者 高璐 饶胜其 尹永祺 方维明 顾瑞霞 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1288-1294,共7页

【目的】制备鼠李糖乳杆菌菌毛亚基Spa A多克隆抗体,研究其种属特异性。【方法】应用PCR方法从鼠李糖乳杆菌GG的基因组扩增出spa A,并连接到质粒p ET-28α(+)中。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和镍柱纯化制备重组Spa... 【目的】制备鼠李糖乳杆菌菌毛亚基Spa A多克隆抗体,研究其种属特异性。【方法】应用PCR方法从鼠李糖乳杆菌GG的基因组扩增出spa A,并连接到质粒p ET-28α(+)中。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和镍柱纯化制备重组SpaA。通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,利用全菌ELISA、Western和Dot-blot分析了SpaA在18株乳酸菌(12个种)中的分布特征。【结果】表达的重组SpaA分子量为36 k D,与预期大小一致;获得的Spa A抗体效价为1:12 800。Western结果显示抗体与天然Spa A具有良好的反应性。在测定的18株乳酸菌中,鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌3个种属菌株的spa A基因PCR和RT-PCR检测均为阳性。但全菌ELISA和Dot-blot结果显示,只有3株鼠李糖乳杆菌的全菌细胞与SpaA抗体呈特异性反应,而其它种属的菌株没有明显的交叉反应。【结论】尽管spa A基因在鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌中具有高度同源性,但SpaA蛋白只特异性地呈现在鼠李糖乳杆菌细胞表面。本研究中获得的Spa A抗体,为高黏附性鼠李糖乳杆菌的免疫磁珠分离及菌毛功能研究提供了工具。 展开更多

关键词 鼠李糖乳杆菌GG 菌毛 spaa亚基 表达 抗体

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人乳头瘤病毒L1基因与丹毒丝菌SpaA-N优势抗原表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定

11

作者 庆格乐图 杨薇薇 +2 位作者 晏鹏飞 苏幼红 李江伟 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期145-150,共6页

为确定丹毒丝菌表面保护性抗原A的N-末端(SpaA-N)优势抗原表位,研发新型表位DNA嵌合疫苗,利用生物信息学软件对丹毒丝菌SpaA-N的优势B细胞抗原表位进行预测,以重叠PCR将优势表位插入人乳头瘤病毒16型的主要衣壳蛋白(HPV-16 L1)HI环结构... 为确定丹毒丝菌表面保护性抗原A的N-末端(SpaA-N)优势抗原表位,研发新型表位DNA嵌合疫苗,利用生物信息学软件对丹毒丝菌SpaA-N的优势B细胞抗原表位进行预测,以重叠PCR将优势表位插入人乳头瘤病毒16型的主要衣壳蛋白(HPV-16 L1)HI环结构的编码序列中,构建获得重组嵌合质粒pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA。该重组质粒经体内、外瞬时转染后,RT-PCR均扩增获得了1 500 bp左右的目的片段。免疫印迹试验显示,体外转染嵌合质粒的细胞总蛋白能够与GST-SpaA-N重组蛋白免疫血清在56 kD处产生特异性结合。ELISA分析显示嵌合质粒可在小鼠体内产生差异显著的特异性抗体(P<0.01),抗体滴度为1∶1 000。此外,pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA制备的抗血清至少可在1∶10稀释度条件下,介导外源补体对半数以上的菌体进行杀伤。该研究表明,获得的SpaA-N表位DNA嵌合疫苗具有免疫活性,为研发安全有效的丹毒丝菌新型DNA疫苗提供了一个新思路。 展开更多

关键词 丹毒丝菌 spaa-N 表位预测 HPV-16 L1嵌合质粒 瞬时表达 杀菌活性

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一株猪丹毒丝菌的全基因组测序及SpaA基因分析

12

作者 彭凌 林锦铨 +2 位作者 李玲慧 刘博婷 蔡巩林 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2021年第3期694-698,共5页

本研究测定猪丹毒丝菌临床毒株SG7的全基因组序列,并运用生物信息学方法对测定的全基因组序列及猪丹毒丝菌表面保护性抗原A基因(SpaA)进行分析。SG7菌株的基因组全长为1834291.00 bp,G+C含量为36.3%,基因总数1846个。将SG7菌株与GenBank... 本研究测定猪丹毒丝菌临床毒株SG7的全基因组序列,并运用生物信息学方法对测定的全基因组序列及猪丹毒丝菌表面保护性抗原A基因(SpaA)进行分析。SG7菌株的基因组全长为1834291.00 bp,G+C含量为36.3%,基因总数1846个。将SG7菌株与GenBank中8条完整的猪丹毒丝菌全基因组序列进行比较,发现国内外不同菌株间基因组的基本信息存在不同程度差异。基于全基因组单核苷酸多态性(SNPs)的系统发育分析结果表明,9株菌株聚为3个分支,国内菌株并不完全处于同一分支,SG7菌株与国内常见菌株不属于同一进化分支。SpaA基因高变区的分析结果显示,9株菌株亦可分为3个SpaA型,SG7菌株为携带Met203的高致病性菌株。除SG7菌株外,其他8株菌株的SpaA基因分型结果与基于全基因组SNPs分析的结果一致,说明SG7菌株的遗传背景复杂。本研究结果可为猪丹毒丝菌基因组整体水平研究和疫苗的研发奠定基础。 展开更多

关键词 猪丹毒丝菌 全基因组测序 表面保护性抗原A(spaa)

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猪丹毒丝菌SpaA蛋白的表达与纯化

13

作者 刘博婷 李肇高 +4 位作者 严舒焕 李荣君 蔡巩林 林锦铨 彭凌 《生物技术》 CAS 2020年第1期12-16,共5页

[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯... [目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD600为0.9时,加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA;Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 猪丹毒丝菌 表达 spaa基因 纯化

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猪丹毒丝菌SpaA基因原核表达及表达蛋白质的免疫原性分析 被引量：10

14

作者 姚焱彬 陆萍 +3 位作者 杨志鹏 魏建忠 孙裴 李郁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期492-500,共9页

旨在克隆表达猪丹毒丝菌SpaA蛋白,分析其免疫原性,为猪丹毒新型疫苗的研发奠定基础。运用PCR扩增SpaA基因,连接至pGEX-6P-1载体,将阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE分析表达产物,GST亲和层析纯化融合蛋白质,W... 旨在克隆表达猪丹毒丝菌SpaA蛋白,分析其免疫原性,为猪丹毒新型疫苗的研发奠定基础。运用PCR扩增SpaA基因,连接至pGEX-6P-1载体,将阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE分析表达产物,GST亲和层析纯化融合蛋白质,Western blot鉴定;纯化SpaA蛋白免疫小鼠,间接ELISA检测血清中IgG和Th1、Th2相关细胞因子;不同致病力猪丹毒丝菌攻击免疫小鼠,观察病理组织变化及其免疫保护率。结果显示,猪丹毒丝菌SpaA基因在大肠杆菌中实现表达,获得大小为75ku的纯化目的蛋白质。该蛋白质能特异性识别猪丹毒丝菌抗血清,可诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使TNF-β、IFN-γ、IL-5、IL-10含量显著升高,对攻毒菌的免疫保护率均为100%,病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显。可见成功获得的重组SpaA蛋白具有良好的免疫原性,能激发机体的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为研发猪丹毒亚单位疫苗的候选抗原。 展开更多

关键词 猪丹毒丝菌 spaa基因 原核表达 免疫原性 免疫保护力

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检测猪丹毒杆菌抗体重组SpaA ELISA的建立 被引量：8

15

作者 姚焱彬 李倩文 +4 位作者 杨志鹏 陆萍 魏建忠 孙裴 李郁 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期739-748,共10页

【目的】利用表达纯化的猪丹毒杆菌表面保护性蛋白SpaA,建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【方法】克隆扩增猪丹毒杆菌SpaA基因,并将SpaA基因与原核表达载体p GEX-6P-1连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受... 【目的】利用表达纯化的猪丹毒杆菌表面保护性蛋白SpaA,建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【方法】克隆扩增猪丹毒杆菌SpaA基因,并将SpaA基因与原核表达载体p GEX-6P-1连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌E.coli Rosetta(DE3),并利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。将SpaA重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的猪丹毒杆菌SpaA蛋白作抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1.0 mg/L,血清的最佳稀释度为1:100,建立了检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,批内及批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性及特异性。用建立的间接ELISA方法检测猪丹毒疫苗免疫后的健康猪血清样品,检测结果与美国TSZ公司猪丹毒杆菌抗体检测试剂盒和Western blot鉴定结果进行对比,两者总符合率分别为92.20%、92.59%。【结论】试验利用原核表达的SpaA重组蛋白作抗原建立的检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于猪丹毒杆菌的抗体检测及流行病学调查。 展开更多

关键词 猪丹毒杆菌 表面保护性蛋白spaa 克隆表达 间接ELISA 建立

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猪丹毒杆菌表面抗原SpaA的原核表达纯化及免疫原性验证 被引量：2

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作者 张一帜 张媛 +9 位作者 李建 王甲 冯妍 赵浩然 任小侠 王秀丽 刘元杰 李旭妮 王浩杰 刘燕 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期352-358,共7页

本研究制备了一种具备优良免疫原性的猪丹毒杆菌表面抗原重组蛋白。采用基因调取的方式,构建质粒并亚克隆到表达载体pET28a上,进一步将改造质粒转化到大肠杆菌感受态BL21细胞中,构建了1株猪丹毒SpaA全基因重组表达菌株。之后通过IPTG诱... 本研究制备了一种具备优良免疫原性的猪丹毒杆菌表面抗原重组蛋白。采用基因调取的方式,构建质粒并亚克隆到表达载体pET28a上,进一步将改造质粒转化到大肠杆菌感受态BL21细胞中,构建了1株猪丹毒SpaA全基因重组表达菌株。之后通过IPTG诱导表达、镍离子层析柱分离纯化、梯度透析获得高纯度重组SpaA蛋白。经免疫攻毒试验验证,重组SpaA蛋白能够有效保护小鼠和猪免于猪丹毒杆菌强毒攻击,其中小鼠的重组SpaA蛋白最小免疫剂量为每只2.0μg,100μg的重组SpaA蛋白能够保护猪免于猪丹毒杆菌强毒株感染。以重组SpaA蛋白作为组分与猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗共同免疫小鼠,结果显示该混合疫苗对于猪丹毒杆菌及猪多杀性巴氏杆菌均有良好的保护效果。本研究结果证实,重组SpaA蛋白是我国现行猪丹毒杆菌传统灭活疫苗升级换代的理想候选抗原,同时也具备良好的抗原相容性,其高纯度及低免疫剂量的特点也为其他组分提供了充足的剂量空间。 展开更多

关键词 猪丹毒杆菌 spaa蛋白 蛋白表达纯化 亚单位疫苗

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红斑丹毒丝菌SpaA蛋白保护区域的免疫学检测 被引量：4

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作者 刘丹丹 恩特马克.布拉提白 +1 位作者 杨振龙 吾鲁木汗.那孜尔别克 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2013年第5期5-11,共7页

为了确定菌体表面保护性抗原A(SpaA)的免疫保护区域,通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中分别扩增出编码成熟SpaA及其N端342个氨基酸序列(SpaA-N)和C端160个氨基酸序列(SpaAC)的基因片段,将它们分别克隆到表达载体pET32a上,转化... 为了确定菌体表面保护性抗原A(SpaA)的免疫保护区域,通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中分别扩增出编码成熟SpaA及其N端342个氨基酸序列(SpaA-N)和C端160个氨基酸序列(SpaAC)的基因片段,将它们分别克隆到表达载体pET32a上,转化入大肠埃希菌BL21,IPTG诱导,亲和层析法纯化重组蛋白,并检测它们对小鼠的保护作用。SDS-PAGE结果显示重组SpaA、SpaA-N和SpaA-C以可溶性形式表达在大肠埃希菌BL21细胞质中并具有良好的免疫原性。保护试验结果表明重组SpaA、SpaA-N和NaOH提取抗原完全保护小鼠受强毒株C43065的致死性感染,但重组SpaA-C没有保护作用。结果表明SpaA-N可以作为预防猪丹毒的亚单位疫苗。 展开更多

关键词 红斑丹毒丝菌 spaa 原核表达 免疫保护区域

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转移因子对猪丹毒杆菌SpaA抗原免疫效果的影响 被引量：1

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作者 胡辉灿 刘洋 +2 位作者 姚清 赵墩 余兴龙 《河南农业科学》 北大核心 2019年第4期135-138,共4页

为了探寻转移因子(Transfer factor,TF)对猪丹毒杆菌SpaA(Surface protective antigen A)蛋白抗原免疫效果的影响,将重组SpaA蛋白与双相佐剂乳化后(称SpaA抗原)免疫小鼠,取免疫小鼠和未免疫小鼠脾脏,以超滤法分别制备特异性TF和普通TF,... 为了探寻转移因子(Transfer factor,TF)对猪丹毒杆菌SpaA(Surface protective antigen A)蛋白抗原免疫效果的影响,将重组SpaA蛋白与双相佐剂乳化后(称SpaA抗原)免疫小鼠,取免疫小鼠和未免疫小鼠脾脏,以超滤法分别制备特异性TF和普通TF,并利用BCA法测定所得TF的质量分数,经过无菌及安全性检测后,将2种TF分别腹腔接种至小鼠体内,24 h后,对2组TF处理后的小鼠均免疫SpaA抗原,并以未接种TF的免疫小鼠作为对照(仅免疫组)。分别于免疫后12 d、21 d和30 d对小鼠进行采血,用间接ELISA法对小鼠血清进行抗体检测。结果表明,利用原核表达系统表达的重组SpaA蛋白分子质量60 ku且具有可溶性;以超滤法制备的特异性TF质量浓度为2.56 mg/mL,普通TF质量浓度为2.40 mg/mL,且2种TF安全无毒;抗体检测数据显示,2种TF处理组在免疫后21、30 d的抗体水平均高于仅免疫组,且差异显著,而2种TF处理组之间抗体水平差异不显著。因此,TF能诱导SpaA抗原快速产生抗体,提高SpaA抗原的免疫效果,但与TF的特异性关系不大,表明TF可作为猪丹毒杆菌基因工程亚单位疫苗的免疫增效剂,提高免疫动物的抗体水平。 展开更多

关键词 转移因子 特异性 猪丹毒杆菌 spaa抗原 抗体水平

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猪丹毒丝菌强毒株与弱毒疫苗株SpaA基因生物信息学分析 被引量：1

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作者 袁晓晴 彭凌 +3 位作者 陈锦红 温权 刘博婷 蔡巩林 《江苏农业科学》 2020年第17期70-76,共7页

对猪丹毒丝菌SpaA蛋白进行生物信息学分析,并对比了猪丹毒丝菌弱毒菌株和野生强毒菌株间的差异。结果显示,由于猪丹毒丝菌GC42的SpaA蛋白缺少一段含有80个氨基酸的序列,使得该菌株的蛋白质相对分子质量、氨基酸组成、二级和三级结构与... 对猪丹毒丝菌SpaA蛋白进行生物信息学分析,并对比了猪丹毒丝菌弱毒菌株和野生强毒菌株间的差异。结果显示,由于猪丹毒丝菌GC42的SpaA蛋白缺少一段含有80个氨基酸的序列,使得该菌株的蛋白质相对分子质量、氨基酸组成、二级和三级结构与强毒株的SpaA蛋白质相比均有所差异,导致这2株菌株引发机体产生的免疫原性和抗原性强弱有所不同,推测这2株菌株中,SG7菌株的免疫原性相对GC42较强;GC42菌株的抗原性相对SG7菌株的抗原性来说较弱,而猪丹毒丝菌GC42菌株的毒力相对猪丹毒丝菌SG7菌株较弱,因此呈现弱毒菌株特性;推测2株菌株的氨基酸序列均在193~206、217~231、290~309、313~327、328~376、386~457区段具有较高的形成B细胞表位的可能性。 展开更多

关键词 猪丹毒丝菌 spaa蛋白 弱毒菌株 生物信息学分析 B细胞抗原表位

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猪丹毒杆菌SpaA基因的克隆与生物信息学分析 被引量：6

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作者 林琳 江斌 +1 位作者 吴胜会 张世忠 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1232-1236,共5页

旨在克隆猪丹毒杆菌表面保护性抗原A(surface protein A,SpaA)的编码基因,并预测该蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨猪丹毒杆菌SpaA蛋白在免疫保护中所起的作用。首先对猪丹毒杆菌SpaA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并进行同源性... 旨在克隆猪丹毒杆菌表面保护性抗原A(surface protein A,SpaA)的编码基因,并预测该蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨猪丹毒杆菌SpaA蛋白在免疫保护中所起的作用。首先对猪丹毒杆菌SpaA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并进行同源性比较。应用生物信息学方法,对猪丹毒杆菌SpaA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。结果显示,猪丹毒杆菌SpaA基因全长1 881bp,编码626个氨基酸,发育进化树结果表明分离的2株猪丹毒杆菌菌株与GenBank中其他菌株在进化树中关系较远,自成一个分支。二级结构的预测结果显示该蛋白主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主,只有少数的β转角;推测该蛋白有14个B细胞优势抗原表位区域、8个N-肉豆蔻酰化位点。该研究为进一步分析猪丹毒杆菌免疫机理、表位疫苗设计等奠定理论基础。 展开更多

关键词 猪丹毒杆菌 表面保护性抗原A 二级结构 B细胞抗原表位

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