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弓形虫表面主要抗原1(SAG1)蛋白的原核表达与鉴定
1
作者 代琴 骆璐 +5 位作者 董春霞 凌洪权 吴胜昔 曾政 秦萍 韦广苗 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第12期69-73,128,共6页
为了实现弓形虫主要表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)蛋白在原核表达系统中的高效表达,试验根据GenBank中弓形虫SAG1基因序列(登录号为S76248.1)及大肠杆菌密码子偏好性对目的基因序列进行优化设计,以pET-32a(+)为表达载体构建重组表... 为了实现弓形虫主要表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)蛋白在原核表达系统中的高效表达,试验根据GenBank中弓形虫SAG1基因序列(登录号为S76248.1)及大肠杆菌密码子偏好性对目的基因序列进行优化设计,以pET-32a(+)为表达载体构建重组表达质粒pET32a(+)-SAG1,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)对重组菌进行诱导,表达重组蛋白,通过优化诱导条件实现对重组蛋白的大量表达,使用NGC^(TM)层析纯化系统纯化重组蛋白,并分别以抗His标签单克隆抗体和犬弓形虫阳性血清作为一抗、羊抗鼠IgG-HRP和HRP-兔抗犬作为二抗对重组蛋白进行Western-blot鉴定。结果表明:重组表达质粒pET32a(+)-SAG1经双酶切分别在5 900 bp和1 020 bp处出现1条载体条带和1条目的基因条带,与预期结果相符;重组蛋白大小为55 ku且以包涵体的形式成功表达,当诱导条件为25℃、0.4 mmol/L IPTG诱导8 h时重组蛋白的表达量最高;纯化后的重组蛋白条带单一,纯度较高,3个样品质量浓度分别为0.409 5,0.368 5,0.451 9 mg/mL;表达的重组蛋白与抗His标签单克隆抗体和犬弓形虫阳性血清均能特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了弓形虫SAG1重组蛋白,纯化后的重组蛋白纯度和质量浓度较高,且具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 原核表达 镍柱纯化 蛋白免疫印迹
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弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察 被引量：15
2
作者 杨婷婷 何深一 +5 位作者 张加勤 周怀瑜 丛华 古钦民 李瑛 赵群力 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第5期410-413,共4页
目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ... 目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 ROP2 复合基因 DNA疫苗 流式细胞术
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截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定 被引量：14
3
作者 言慧 李华 +2 位作者 周晓红 吴昆 陈晓光 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第4期412-414,共3页
目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a(+)-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET... 目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a(+)-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中,构建表达重组质粒pET-32a(+)-trSAG1。将重组质粒转入E.coliBL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA agarose纯化后, Western-blotting分析其免疫反应性。结果成功构建重组质粒pET-32a(+)-trSAG1 ,通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白,相对分子质量40 000,Western-blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性,ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段,表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别,有望成为一种有价值的诊断抗原。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1抗原 大肠杆菌 可溶性 表达 纯化 免疫反应性鉴定
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弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1在大肠杆菌中表达的初步研究 被引量：11
4
作者 陈海峰 陈观今 +2 位作者 郭虹 郑焕钦 王又红 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第2期8-10,共3页
目的　构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法　用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细... 目的　构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法　用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE及Western -Blot分析。结果　获得pET2 8-SAG1/ROP1重组表达载体 ;SDS -PAGE及Western -Blot印迹显示SAG1/ROP1复合基因表达蛋白产物分子量约为 6 6kD ,具有一定的免疫活性。结论　弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1可在大肠杆菌中表达 ,表达产物具有免疫活性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 ROP1 基因表达 抗原基因 大肠杆菌
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弓形虫复合基因疫苗pcSAG1-ROP5诱导小鼠免疫应答的研究 被引量：7
5
作者 赵焕阁 范志刚 +4 位作者 黄风迎 黄用豪 周松林 林映莹 谭光宏 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期1-5,共5页
目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5，分别通过PCR、酶切和测序鉴定后，转染人宫颈癌细胞（HeLa细胞），蛋白印迹（Westernblotting）分析重... 目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5，分别通过PCR、酶切和测序鉴定后，转染人宫颈癌细胞（HeLa细胞），蛋白印迹（Westernblotting）分析重组蛋白的体外表达情况。70只昆明小鼠随机均分为5组（每组14只），分别为pc-SAGl组、pcROP5组、pcSAGl-ROP5组、空质粒组和空白对照组。重组质粒组每次每只肌注100μg重组质粒，每2周免疫1次，共3次。空质粒组和空白对照组分别注射等量的空质粒和PBS。于每次免疫前和末次免疫后2周眼眶采血。制备血清。采用ELISA法检测pcSAGl-ROP5组小鼠末次免疫后2周的血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价，以及5组小鼠的各次血清中抗弓形虫抗体IgG水平。末次免疫后3周，每组小鼠取10只腹腔接种10s弓形虫速殖子，观察生存时间。末次免疫后4周，采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中r干扰素（IFN-r）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果重组真核表达质粒构建成功。Westernblotting分析结果显示，重组质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5均能在HeLa细胞中表达，重组蛋白的相对分子质量（尬）分别为31000、57000和88000。pcSAGl-ROP5组小鼠血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价分别为1：320、1：160和1：2560。3个重组质粒组小鼠血清抗弓形虫IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高，末次免疫后2周，pcSAGl-ROP5组小鼠血清IgG抗体水平（0．612±0．031）显著高于其他各组（P〈0．05）。攻击感染后，pcSAGl-ROP5组小鼠的平均存活时间为（288±7）h，较pc—SAGl组和pcROP5组分别延长了48h和96h（P〈0．05）。末次免疫后4周，pcSAGl-ROP5组小鼠脾细胞培养上清中IFN-1水平[（908．52±6．31）pg／m1]显著高于其他各组（P〈0．05），各组的IL-4水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论与弓形虫单基因疫苗pcSAGl和pcROP5相比，复合基因疫苗pcSAGl-ROP5所诱导的抗弓形虫IgG抗体和IFN-1水平较高，攻击感染后存活时间延长。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 复合基因疫苗 sag1-ROP5
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弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测 被引量：7
6
作者 陈晓光 杨培梁 +2 位作者 李华 龚娅 冯明钊 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第8期561-564,共4页
目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后，定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+），酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确，将重组质粒转化大肠杆菌BL2... 目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后，定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+），酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导表达, 对融合的表达产物进行纯化和复性，通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒，并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达，其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31.58%。经过简易的纯化和复性过程，该重组抗原（rSAG1）能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达，重组抗原经纯化和复性后，能有效检测弓形虫的感染，可用于构建弓形虫病检测试剂盒。 展开更多
关键词 弓形虫感染 基因表达 寄生虫学 大肠杆菌 重组抗原 sag1基因
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弓形虫SAG1和GRA4基因的原核表达及其重组猫疱疹病毒Ⅰ型转移载体的构建 被引量：5
7
作者 高洋 程子英 +3 位作者 王铭 郑君 贾洪林 鲁承 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期886-890,共5页
为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或... 为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或GRA4基因,构建重组FHV-1的转移载体pBS-TK-SAG1和pBS-TK-GRA4。将其分别转染于293T细胞,通过原核细胞表达的截短SAG1和GRA4重组蛋白制备的鼠多克隆抗体进行western blot鉴定。结果显示,制备的弓形虫SAG1和GRA4多克隆抗体能够特异性识别重组表达和虫体表达的天然的SAG1和GRA4两种弓形虫蛋白,分子量一致,分别为35 ku和45 ku。本研究为表达弓形虫RH株SAG1和GRA4基因的猫重组疱疹病毒Ⅰ型载体疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 GRA4 猫疱疹病毒I型 转移载体
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弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建 被引量：4
8
作者 黄达娜 吴少庭 +6 位作者 袁仕善 高世同 张仁利 雷明军 潘晖榕 林琦萍 秦莉 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第2期128-131,共4页
目的　构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法　采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVA... 目的　构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法　采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果　PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论　成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。 展开更多
关键词 弓形虫 表面抗原 sag1 DNA疫苗 免疫应答 多聚酶链反应技术
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弓形虫SAG1基因在蜥蜴利什曼原虫中的表达 被引量：4
9
作者 许越 杨欢欢 +2 位作者 魏峰 商立民 刘全 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期696-700,共5页
利用PCR扩增技术从弓形虫RH株全基因组中扩增出弓形虫抗原基因SAG1,将其克隆入真核表达载体质粒pLEXSY-neo2,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-SAG1。利用电穿孔转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,经G418筛选阳性克隆。表达... 利用PCR扩增技术从弓形虫RH株全基因组中扩增出弓形虫抗原基因SAG1,将其克隆入真核表达载体质粒pLEXSY-neo2,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-SAG1。利用电穿孔转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,经G418筛选阳性克隆。表达的外源重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,证明SAG1重组蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。 展开更多
关键词 弓形虫 蜥蜴利什曼原虫 sag1基因 电穿孔转染 表达
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弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达 被引量：4
10
作者 胡旭初 余新炳 +2 位作者 徐劲 吴忠道 陈守义 《热带医学杂志》 CAS 2002年第4期330-333,共4页
目的　分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法　在 5′端和3′端引物分别引入EcoRⅠ和SpeⅠ酶切位点 ,PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因 ,定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中 ,构建不带 6个组氨酸尾... 目的　分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法　在 5′端和3′端引物分别引入EcoRⅠ和SpeⅠ酶切位点 ,PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因 ,定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中 ,构建不带 6个组氨酸尾序列的重组质粒。重组质粒被PacⅠ酶切下表达盒 ,氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16 ,通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子 ,并利用MM/MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式。筛选甲醇利用野生型的重组酵母 ,用甲醇诱导表达 ,并分析SAG1的表达水平 ,从中筛选高表达转化子。结果　获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株。在甲醇诱导后第 3天 ,细胞裂解液SDS PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带 ,但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少 ,而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少。上清中有 4 0kDa和 2 7kDa的两种蛋白 ,后者的量大于前者 ,并与SAG1成熟肽的大小一致 ,PMD16株的表达量大于PMD11株 ,总蛋白量约 35 μg/ml。 结论　弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达 ,但PMD11宿主菌会降解外源蛋白 ,而缺失了蛋白酶的PMD16? 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 甲醇酵母 表达
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应用核酸原位分子杂交法检测弓形虫SAG1抗原基因在免疫小鼠体内的表达 被引量：5
11
作者 陈海峰 陈观今 +2 位作者 王又红 郑焕钦 郭虹 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第3期13-15,共3页
PCR扩增RH株弓形虫抗原基因SAG1编码序列 ,构建pcDNA3 -SAG1重组表达质粒。DNA免疫接种小鼠 ,3周后处死动物 ,取注射部位肌肉作冰冻切片 ,用原位分子杂交方法检测弓形虫 pcDNA3 -SAG1重组质粒在免疫小鼠肌肉内的表达。结果PCR扩增出SAG... PCR扩增RH株弓形虫抗原基因SAG1编码序列 ,构建pcDNA3 -SAG1重组表达质粒。DNA免疫接种小鼠 ,3周后处死动物 ,取注射部位肌肉作冰冻切片 ,用原位分子杂交方法检测弓形虫 pcDNA3 -SAG1重组质粒在免疫小鼠肌肉内的表达。结果PCR扩增出SAG1编码区目的基因 ,片段大小为 10 2 0bp。测序、酶切分析表明构建的 pcDNA3 -SAG1重组表达质粒含有扩增的基因。利用原位分子杂交在免疫接种 pcDNA3-SAG1的小鼠骨骼肌中检测到紫蓝色的阳性杂交信号 ,提示局部肌肉有目的基因mRNA转录的发生。 展开更多
关键词 弓形虫 基因免疫 sag1抗原 原位分子杂交 PCR DNA免疫
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弓形虫表面抗原蛋白基因SAG1在骨骼肌中的表达 被引量：5
12
作者 陈海峰 陈观今 +2 位作者 王又红 郑焕钦 郭虹 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第6期89-91,共3页
构建弓形虫速殖子表面抗原蛋白SAG1的真核表达载体 ,直接注入小鼠骨骼肌 ,观察该基因的表达程度和表达定位 ,研究利用骨骼肌异源表达SAG1,探讨发展一种简易、有效和安全的基因免疫途径的可能性。免疫组化结果显示 ,直接肌肉注射重组真... 构建弓形虫速殖子表面抗原蛋白SAG1的真核表达载体 ,直接注入小鼠骨骼肌 ,观察该基因的表达程度和表达定位 ,研究利用骨骼肌异源表达SAG1,探讨发展一种简易、有效和安全的基因免疫途径的可能性。免疫组化结果显示 ,直接肌肉注射重组真核表达载体pcDAN3-SAG1可使SAG1在免疫小鼠骨骼肌中表达 。 展开更多
关键词 弓形虫 表面抗原蛋白 免疫组织化学 sag1 骨骼肌
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三种表达形式的SAG1基因对小鼠的免疫效果观察(英文) 被引量：3
13
作者 陈晓光 周晓红 +4 位作者 龚娅 杨培梁 沈树满 冯明钊 伦照荣 《热带医学杂志》 CAS 2001年第1期3-9,共7页
自的 构建了三种表达形大的弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）基因－表膜型、分泌型和细胞内型，并分别用于免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠、结果ＳＡＧ１基因免疫小鼠后，表膜型和分泌型较细胞内型体液免疫出现早且反应强；细胞因子水平测试显示... 自的 构建了三种表达形大的弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）基因－表膜型、分泌型和细胞内型，并分别用于免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠、结果ＳＡＧ１基因免疫小鼠后，表膜型和分泌型较细胞内型体液免疫出现早且反应强；细胞因子水平测试显示免疫后小鼠免疫反应趋向Ｔｈ１型。攻击感染结果证实：表膜型和分泌型免疫小鼠较细胞内型免疫小鼠所获保护力强。结论 展开更多
关键词 刚地弓形虫 sag1基因 免疫 表膜型 分泌型 细胞内分型
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用重组SAG1抗原检测弓形虫抗体 被引量：3
14
作者 邹梦晨 言慧 +2 位作者 吴焜 陈晓光 李华 《热带医学杂志》 CAS 2009年第6期654-657,共4页
目的探讨重组SAG1抗原对弓形虫IgG和IgM抗体的检测效果。方法用rSAG1作抗原建立免疫印迹方法(rSAG1-WB),与玻片虫体过氧化物酶免疫染色试验(TSHE)平行检测不同来源血清。结果15例病原学检查阳性小鼠血清和5例免疫兔血清的IgG抗体均为阳... 目的探讨重组SAG1抗原对弓形虫IgG和IgM抗体的检测效果。方法用rSAG1作抗原建立免疫印迹方法(rSAG1-WB),与玻片虫体过氧化物酶免疫染色试验(TSHE)平行检测不同来源血清。结果15例病原学检查阳性小鼠血清和5例免疫兔血清的IgG抗体均为阳性,30例正常小鼠血清和10例正常兔血清均未出现阳性反应。rSAG1-WB检测可疑弓形虫病患者血清阳性率为60.3%(38/63),献血员血清阳性率为6%(3/50),与TSHE检测结果(65.1%和4%)均无统计学差异(P>0.05)。1例IgM强阳性血清和13例IgM弱阳性血清在Western-blot检测中分别出现相应的强阳性与弱阳性反应,50例献血员血清均未出现IgM阳性反应,结果与TSHE一致。结论rSAG1-WB检测弓形虫IgG和IgM抗体均具有高度的敏感性和特异性,与TSHE的符合率高。 展开更多
关键词 弓形虫 重组抗原 sag1 WESTERN-BLOT TSHE
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弓形虫RH株SAG1基因序列体外扩增及生物信息学分析 被引量：4
15
作者 陈莎丽 张玉英 +4 位作者 覃珊珊 李娟兰 金小宝 江钢锋 汪琦 《生命科学研究》 CAS CSCD 2007年第4期348-351,共4页
根据SAG1基因序列,自行设计一对寡核苷酸引物,利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中成功扩增出编码SAG1抗原的基因片段,扩增出的基因片段大小与预期长度(1006bp)相符,结果经测序验证,并利用生物信息学方法对SAG1蛋白理化性质、结构和功... 根据SAG1基因序列,自行设计一对寡核苷酸引物,利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中成功扩增出编码SAG1抗原的基因片段,扩增出的基因片段大小与预期长度(1006bp)相符,结果经测序验证,并利用生物信息学方法对SAG1蛋白理化性质、结构和功能进行了预测. 展开更多
关键词 弓形虫 sag1基因 体外扩增 生物信息学分析
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弓形虫SAG1,ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究 被引量：4
16
作者 李薇 刘玉和 刘波 《北华大学学报（自然科学版）》 CAS 2008年第4期314-316,共3页
目的检测混合SAG1和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答，评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果．方法 将SAG1和编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体，构建重组质粒；RT-PCR体外验证重组质粒在NH3T3细胞中的表达；通过检测... 目的检测混合SAG1和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答，评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果．方法 将SAG1和编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体，构建重组质粒；RT-PCR体外验证重组质粒在NH3T3细胞中的表达；通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫：腹腔内注射毒性株弓形虫速殖子攻击免疫小鼠．结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达；SAG1和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫，对于毒性株弓形虫感染攻击具有保护作用．结论 不同候选抗原编码基因重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，提示含有多种成分的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一． 展开更多
关键词 弓形虫 DNA免疫 sag1 ROP1
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弓形虫SAG1的高密度发酵表达、纯化及免疫反应性鉴定 被引量：2
17
作者 李华 言慧 +2 位作者 陈白虹 刘敏 陈晓光 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1180-1183,共4页
目的探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程。方法利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、SephadexG-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Westernblotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓... 目的探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程。方法利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、SephadexG-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Westernblotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓形虫抗体的敏感性与特异性。结果高密度发酵诱导4h后工程菌液的OD600达到20.21;平均每升发酵液可收获工程菌26.10g;目标蛋白的表达量占菌体蛋白的25.82%;经Ni-NTA、Ni-NTA联合SephadexG-75及Ni-NTA联合切胶纯化的rSAG1蛋白纯度分别为72.36%、98.54%和97.39%;Westernblotting结果显示联合纯化的rSAG1与弓形虫免疫兔血清呈单一反应条带,与正常兔血清未出现反应带;Ni-NTA联合Sephadex-G75纯化的rSAG1对25例感染小鼠血清和38例抗体阳性患者血清的检出率分别为96%和94.7%。结论利用高密度发酵技术高效表达、Ni-NTA联合SephadexG-75纯化的rSAG1具有较高纯度和良好的免疫反应性,该工艺可以用于rSAG1抗原的批量生产。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 发酵 表达 纯化
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弓形虫SAG1、GRA2单基因疫苗及SAG1-GRA2复合基因疫苗的免疫效果观察 被引量：4
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作者 李首庆 古钦民 +1 位作者 杨广民 马寅芙 《中国实验诊断学》 2008年第10期1219-1222,共4页
目的检测SAG1和GRA2基因编码的单基因及复合基因疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法大量制备pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2、pcDNA3.1-SAG1-GRA2真核表达重组质粒,肌内注射BALB/c小鼠,分别于2周、4周后... 目的检测SAG1和GRA2基因编码的单基因及复合基因疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法大量制备pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2、pcDNA3.1-SAG1-GRA2真核表达重组质粒,肌内注射BALB/c小鼠,分别于2周、4周后加强免疫一次。另设立pcDNA3.1及PBS对照组。于3次免疫后4周作免疫指标测定(包括ELISA法测定小鼠血清IgG抗体及细胞因子IFN-γ、IL-4,MTT法测定小鼠淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性),并观察弓形虫速殖子攻击感染后小鼠的生存时间。结果SAG1-GRA2组小鼠血清IgG抗体、IFN-γ、淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性均高于SAG1及GRA2组(P<0.05);各组均未检测到IL-4;复合基因组小鼠生存时间较单基因疫苗组延长(P<0.01)。结论弓形虫SAG1-GRA2复合基因疫苗较SAG1、GRA2单基因疫苗具有更好的免疫保护性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 GRA2 复合基因 疫苗
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弓形虫SAG1 ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究 被引量：2
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作者 陈观今 郑焕钦 +2 位作者 周永安 郭虹 陈海峰 《热带医学杂志》 CAS 2002年第4期317-319,共3页
关键词 弓形虫 sag1 ROP1基因 复合抗原基因 核酸免疫
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弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆表达、纯化与鉴定 被引量：3
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作者 杨雯 田春林 +1 位作者 朱穗京 刘晓泉 《广西医科大学学报》 CAS 2010年第2期205-208,共4页
目的:构建弓形虫SAG1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白SAG1,分离纯化并检测其免疫反应性。方法:设计一对特异引物,体外扩增SAG1目的基因(双酶切纯化后)定向克隆至质粒pET29a(+)中,转化到大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,采用PCR、... 目的:构建弓形虫SAG1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白SAG1,分离纯化并检测其免疫反应性。方法:设计一对特异引物,体外扩增SAG1目的基因(双酶切纯化后)定向克隆至质粒pET29a(+)中,转化到大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,采用PCR、双酶切和测序等方法鉴定,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况,经镍离子柱纯化重组蛋白后,用蛋白质印迹(Western blotting)分析与小鼠弓形虫阳性血清的免疫反应性。结果:重组质粒经PCR、双酶切反应和测序鉴定,产物的大小与结构均与预期值相符,经IPTG诱导后,稳定表达相对分子量(Mr)为28950的蛋白,纯化后的重组蛋白经Western blotting分析显示,与小鼠弓形虫感染血清有特异性反应条带。结论:成功构建重组表达质粒pET29a(+)-SAG1,使弓形虫表面抗原SAG1在体外获得表达,分离纯化的SAG1重组蛋白有免疫反应性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1基因 克隆表达 纯化 免疫反应性
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