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外泌体递送CRISPR/Cas系统在靶细胞内可实现基因编辑
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作者 王白燕 杨树 +5 位作者 王弋鸣 吴梦晴 肖瑀 郭梓璇 张博艺 冯书营 《中国组织工程研究》 北大核心 2026年第7期1839-1849,共11页
背景:CRISPR/Cas基因编辑系统具有精准基因编辑、靶向设计简单、低成本以及高效率等特性,已被广泛应用于科学研究和相关临床治疗。然而,CRISPR/Cas系统如何更安全、更高效、更精准地递送到靶细胞内,仍是一个急需解决的难题。目的:从递送... 背景:CRISPR/Cas基因编辑系统具有精准基因编辑、靶向设计简单、低成本以及高效率等特性,已被广泛应用于科学研究和相关临床治疗。然而,CRISPR/Cas系统如何更安全、更高效、更精准地递送到靶细胞内,仍是一个急需解决的难题。目的:从递送CRISPR/Cas系统的外泌体来源及工程化策略、外泌体对CRISPR/Cas系统的装载方法、CRISPR/Cas系统的生物形式及其在细胞内的作用途径等方面进行全方面综述,为该领域的研究者提供更直观、更系统的视角。方法:以“exosome,drug delivery systems,delivery,CRISPR/Cas,gene editing,engineered exosomes,targeting”为英文检索词,以“外泌体,药物递送,CRISPR/Cas,工程化”为中文检索词,分别检索Pub Med数据库及中国知网,检索时限为2014-2024年。通过仔细阅读文献的标题和摘要进行初步筛选,排除研究内容相关性差及内容重复的文献,最终纳入了78篇文献进行归纳和探讨。结果与结论:(1)外泌体是一种直径30-150 nm的脂质囊泡,具有循环半衰期长、靶向组织的内在能力、良好的生物相容性以及较小的固有毒性等优势,显现出强大的靶向递送能力;(2)CRISPR/Cas系统虽是一种强大的基因编辑工具,然而现有的CRISPR/Cas系统递送载体各有利弊,无法完全满足需求;(3)递送CRISPR/Cas系统的外泌体主要来源于高产外泌体的细胞或组织,但研究者们依然需要根据研究所需进行选择或进一步工程化;(4)递送CRISPR/Cas系统的外泌体主要通过基因工程修饰、化学修饰、外泌体-脂质体杂交等策略实现工程化;(5)外泌体装载CRISPR/Cas系统的方法包括电穿孔、孵育、转染和主动装载途径等,选择合适的装载方法取决于CRISPR/Cas系统的理化性质;(6)外泌体递送CRISPR/Cas系统的生物形式包括质粒和核糖核蛋白复合体,两种形式各具特点,成功递送的CRISPR/Cas系统在靶细胞内实现基因编辑。 展开更多
关键词 外泌体 crispr/Cas系统 基因编辑 药物负载 靶向递送 工程化
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基于RPA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒基因检测方法建立
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作者 董小旭 牛楠楠 +5 位作者 赵印震 杜学利 李灵轲 王继创 李玉林 王云龙 《郑州大学学报(理学版)》 北大核心 2026年第1期87-94,共8页
利用基于重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和簇状规则间隔短回文重复序列相关蛋白12a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 12a,CRISPR/Cas12a)建立猴... 利用基于重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和簇状规则间隔短回文重复序列相关蛋白12a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 12a,CRISPR/Cas12a)建立猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)核酸快速检测体系,并与侧向层析(lateral flow assay,LFA)相结合,构建基于RPA-CRISPR/Cas12a的MPXV核酸层析快速检测系统,实现可视化快速检测。实验结果表明:RPA最佳反应条件为37℃、15 min;CRISPR体系Cas12a、crRNA、NEBuffer、ssDNA最佳加入量分别为1.0,0.25,3.0,0.25μL。整个检测流程仅需1 h,与灭活的甲、乙型流感病毒原液以及牛痘、天花质粒对照无交叉反应,最低检测限为10 copies/μL。成功开发了基于RPA-CRISPR/Cas12a灵敏度高、特异性强、快速检测MPXV的方法,可应用于现场检测,为MPXV检测提供了一种简便快速的检测方法。 展开更多
关键词 猴痘病毒 簇状规则间隔短回文重复序列相关蛋白12a 重组酶聚合酶等温扩增技术 胶体金试纸条
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The Increasing Trends of Short and Long Sleep Duration among Chinese Adults from 2010 to 2018:A Repeated Nationally Representative Cross-sectional Survey
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作者 Yun Chen Lan Wang +12 位作者 Mei Zhang Sifan Hu Yan Shao Xiao Zhang Chun Li Jie Chen Zhenping Zhao Yanhong Dong Lin Lu Maigeng Zhou Limin Wang Junliang Yuan Hongqiang Sun 《Biomedical and Environmental Sciences》 2026年第1期46-59,共14页
Objective This study aimed to determine the temporal trends in sleep duration among Chinese adults.Methods In this series of repeated nationally representative cross-sectional surveys(China Chronic Disease and Risk Fa... Objective This study aimed to determine the temporal trends in sleep duration among Chinese adults.Methods In this series of repeated nationally representative cross-sectional surveys(China Chronic Disease and Risk Factors Surveillance)conducted between 2010 and 2018,a total of 645,420 adult participants(97,741 in 2010;175,749 in 2013;187,777 in 2015;and 184,153 in 2018)were included in the trend analysis.Linear and logistic regression models were utilized to assess trends in sleep duration.Results In 2018,the estimated overall mean sleep duration among the Chinese adult population was7.58(SD,1.45)hours per day,with no significant trend from 2010.A significant increase in short sleep duration(≤6 hours)was observed in the total population,from 15.3%(95%CI:14.1%–16.5%)in 2010 to18.5%(95%CI:17.7%–19.3%)in 2018(P<0.001).Similarly,the trend in long sleep duration(>9 hours)was also significant,increasing in weighted prevalence from 7.2%(95%CI:6.3%–8.1%)in 2010 to 9.0%(95%CI:8.2%–9.9%)in 2018(P<0.001).Conclusion The prevalence of both short and long sleep durations significantly increased among Chinese adults from 2010 to 2018,highlighting the urgency of health initiatives to promote optimal sleep duration in China. 展开更多
关键词 Sleep duration Trend analysis repeated cross-sectional study Nationally representative survey CCDRFS
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玉米种子不同部位基因组提取效率对CRISPR/Cas12a检测体系的影响
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作者 李昀怡 李桐 +4 位作者 刘婷 张倩 黄昆仑 罗云波 程楠 《食品安全质量检测学报》 2026年第1期187-194,共8页
目的 探究玉米种子不同部位在基因组提取和核酸检测中的表现差异,明确最优选择和对成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白12a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein12a, CRISPR/Cas12a)检测... 目的 探究玉米种子不同部位在基因组提取和核酸检测中的表现差异,明确最优选择和对成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白12a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein12a, CRISPR/Cas12a)检测体系结果的影响。方法 本研究比较了玉米种子胚、胚乳和全籽粒的基因组提取效率;通过常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)级联CRISPR/Cas12a系统,对各部位提取产物进行靶标扩增和识别,评估所提取基因组对后续核酸检测的影响;通过对比DNA提取效率、扩增效果和荧光信号强度,验证各部位样本在检测中的适应性。结果 玉米种子不同组织部位的DNA提取效率存在差异,胚部基因组含量最高、全籽粒次之,胚乳相对较低,符合玉米种子生物学结构特征;各部位基因组均能成功扩增,级联CRISPR/Cas12a系统检测产生明确阳性信号;本研究构建的方法定性检出限为0.1 wt%,符合大多数国家和地区对转基因成分的检测要求。结论 玉米种子不同部位基因组提取效率存在差异,但均具备良好的核酸扩增和CRISPR/Cas12a检测适应性,在实际检测中全籽粒取样即可满足检测灵敏度且操作更便捷。本研究开发的方法无需大型仪器设备,能够满足对转基因玉米种子现场检测的需求,具备转基因食品安全筛查的应用价值。 展开更多
关键词 转基因玉米种子 基因组提取 核酸检测 成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白12a
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Utility of liver surface-guided encirclement of hepatoduodenal ligament for the Pringle maneuver in minimally invasive repeat liver resection
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作者 Yoichi Kawano Takahiro Murokawa +18 位作者 Yuto Aoki Akira Hamaguchi Takashi Ono Takahiro Haruna DaigoYoshimori Toshiyuki Irie Junji Ueda Tetsuya Shimizu Akira Matsushita Mampei Kawashima Ryo Ga Hiroyasu Furuki Tomohiro Kanda Yukio Oshiro Keisuke Minamimura Masato Yoshioka Nobuhiko Taniai Yoshiharu Nakamura Hiroshi Yoshida 《World Journal of Gastroenterology》 2026年第1期126-138,共13页
BACKGROUND Repeated application of the Pringle maneuver is a key obstacle to safe minimally invasive repeat liver resection(MISRLR).However,limited technical guidance is available.AIM To study the utility of newly dev... BACKGROUND Repeated application of the Pringle maneuver is a key obstacle to safe minimally invasive repeat liver resection(MISRLR).However,limited technical guidance is available.AIM To study the utility of newly developed Pringle taping method guided by liver surface in MISRLR.METHODS We retrospectively reviewed 72 cases of MISRLR performed by a single surgeon at two centers from August 2015 to July 2024.Beginning in October 2019,a liver surface-guided encirclement of hepatoduodenal ligament(LSEH)was used for repeat Pringle taping.Perioperative outcomes including Pringle taping success,operative time,blood loss,conversion rate,morbidity,and mortality were assessed.RESULTS Laparoscopic and robotic approaches were used in 63 patients and 9 patients,respectively.The median operative time,blood loss,and hospital stay were 331.5 minutes,70 mL,and 8 days,respectively.Open conversion occurred in two cases(2.8%)due to severe adhesions and right renal vein injury.Clavien-Dindo grade≥III complications occurred in 5.6%of cases with no mortality.Anti-adhesion barriers were used in 54 patients(75.0%).LSEH was attempted in 57 cases,improving Pringle taping success from 33.0%to 91.4%(P<0.001).LSEH succeeded in all patients with prior open liver resection(n=11).Among 6 patients in whom LSEH failed,3 patients(50.0%)had undergone a third liver resection,and 1 patient had a history of distal gastrectomy with choledochoduodenostomy.CONCLUSION The newly developed LSEH technique for Pringle taping in MISRLR was feasible,enhancing safety and reproducibility even in patients with a history of open liver resection. 展开更多
关键词 Laparoscopic liver resection repeat liver resection Pringle maneuver Postoperative adhesion Minimally invasive liver resection Hepatocellular carcinoma Cancer of colon and rectum Liver metastasis Guidelines Second and third hepatectomies
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基于RPA-CRISPR/Cas12a的沙氏弧菌可视化检测方法的建立 被引量:1
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作者 葛辉 巫旗生 +8 位作者 宁岳 冯君雅 陈昊翔 李慧耀 叶军 吴丽云 温凭 徐春燕 任磊 《水产学报》 北大核心 2025年第11期203-215,共13页
【目的】建立基于RPA-CRISPR/Cas12a的沙氏弧菌实时荧光检测法和试纸条检测法,满足牡蛎新发病原沙氏弧菌的快速检测需求。【方法】实验针对沙氏弧菌toxR基因设计特异性片段,优选RPA引物和crRNA序列,确保基因标志物的准确扩增与识别;当CR... 【目的】建立基于RPA-CRISPR/Cas12a的沙氏弧菌实时荧光检测法和试纸条检测法,满足牡蛎新发病原沙氏弧菌的快速检测需求。【方法】实验针对沙氏弧菌toxR基因设计特异性片段,优选RPA引物和crRNA序列,确保基因标志物的准确扩增与识别;当CRISPR/Cas12a系统识别到RPA扩增的病原靶标基因并激活其反式切割活性后,生物素修饰的单链DNA荧光探针作为报告分子被切割,分别依据蓝光下的荧光强度和试纸条的显色情况判定检测结果;实验采用多种弧菌验证检测方法的特异性,并通过不同浓度沙氏弧菌菌液评估2种检测方法的灵敏度;最终将2种检测方法与PCR方法进行真实样本检测对比。【结果】本研究成功建立了RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测法和试纸检测法,且均表现出优异的特异性,可准确识别沙氏弧菌,整个检测流程可在1 h内完成;2种方法的检测限均达到100 CFU/mL,检测结果与PCR高度一致(符合率100%)。【结论】本研究开发的基于RPA-CRISPR/Cas12a的荧光检测法和试纸检测法,突破了传统方法的局限,显著缩短检测时间,且无需复杂仪器,操作简便,为沙氏弧菌的现场快速检测提供了可靠的技术支持。本研究为沙氏弧菌的快速检测提供了高效、便捷的新方法,对水产养殖病害防控和食品安全保障具有重要意义。 展开更多
关键词 沙氏弧菌 重组酶聚合酶扩增(RPA) crispr/Cas12a 荧光检测 试纸检测
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CRISPR/Cas9技术:探索lncRNA的自身功能以及在癌症进程中的作用
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作者 李欣 胡莹 王玉明 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第3期364-375,共12页
CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物... CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物和治疗靶点,具有重要的应用前景。然而,由于lncRNA普遍具有低丰度和保守性差等特点,限制了传统手段对其功能的研究。CRISPR/Cas9技术为lncRNA的研究提供了一个高效、灵活且精确的工具,显著加速了该领域的进展。本文首先回顾了CRISPR/Cas9系统的基本原理及其在基因编辑中的广泛应用,包括CRISPR敲除、敲入、干扰和激活等多种功能系统。这些技术不仅可以筛选特定生物过程中的关键lncRNA,还能够用于基因功能研究,探索其在疾病中的作用。本文重点分析了CRISPR/Cas9技术在研究lncRNA功能和调控机制,以及其在肿瘤研究中的关键应用。此外,文章还总结了通过CRISPR/Cas9进行全基因组筛选以识别功能性lncRNA的方法,并探讨了这些lncRNA在癌症细胞增殖、迁移、侵袭以及耐药性中的作用。CRISPR/Cas9敲除系统可以高效敲除lncRNA基因,揭示其在基因调控中的具体功能。同时,CRISPR激活和干扰技术为非编码基因的研究提供了新的思路,通过调控lncRNA的表达水平,进一步探索其在癌症等疾病中的临床应用。文章还探讨了CRISPR技术在未来lncRNA研究中的潜力,尤其是在解决基因组复杂性、靶向效率和脱靶效应等技术难题方面的进展。综上所述,CRISPR/Cas9技术不仅为研究lncRNA提供了强有力的工具,也为未来开发新的癌症诊断和治疗手段提供了新的思路和机会。 展开更多
关键词 成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr/Cas9) 长非编码RNA 基因调控 癌症
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利用CRISPR/Cas9编辑草莓FvPDS基因的研究
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作者 刘丽锋 宋艳红 +2 位作者 赵霞 李刚 周厚成 《园艺学报》 北大核心 2025年第7期1687-1695,共9页
八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素生物合成的关键酶,其编码的PDS基因参与并调控植物类胡萝卜素的累积,PDS基因突变会使植物产生肉眼可见的白化表型,常用来作为检测基因编辑成功与否的标记基因。选取森林草莓Fv... 八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素生物合成的关键酶,其编码的PDS基因参与并调控植物类胡萝卜素的累积,PDS基因突变会使植物产生肉眼可见的白化表型,常用来作为检测基因编辑成功与否的标记基因。选取森林草莓FvPDS基因作为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建双靶点基因编辑载体,农杆菌介导法稳定遗传转化森林草莓种质HLJ-005(红果)、HLJ-004(白果),通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。遗传转化HLJ-005约2250块叶片外植体,筛选到具有卡那霉素抗性的植株147株,通过PCR鉴定,24株为阳性材料,阳性率为16.32%,最后测序获得了5株具有编辑的材料,编辑效率为20.83%;遗传转化HLJ-004约2305块叶片外植体,获得具有卡那霉素抗性的植株234株,PCR检测为6株阳性材料,阳性率为2.56%,测序只有3株为具有编辑的材料,编辑效率为50%。两个编辑位点都产生了突变,分别是单碱基或多个碱基的缺失,但是这两份种质的突变类型不尽相同。结果表明,利用CRISPR/Cas9系统可以通过稳定表达,HLJ-004、HLJ-005两个森林草莓实现双靶点同时敲除,HLJ-004、HLJ-005可作为草莓基因编辑的遗传转化材料,并验证了适合草莓基因编辑的CRISPR/Cas9系统。 展开更多
关键词 草莓 crispr/Cas9 FvPDS 基因编辑
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EuCAD基因CRISPR/Cas9敲除载体构建及基因编辑效果验证
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作者 陈博雯 肖玉菲 +4 位作者 李军集 钟连香 魏秋兰 覃子海 刘海龙 《分子植物育种》 北大核心 2025年第7期2226-2231,共6页
为了对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)木质素合成关键基因开展基因编辑研究,本研究构建了Eu-CAD基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。对EuCAD基因序列进行分析,设计两条位于外显子的靶位点序列,使... 为了对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)木质素合成关键基因开展基因编辑研究,本研究构建了Eu-CAD基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。对EuCAD基因序列进行分析,设计两条位于外显子的靶位点序列,使用Golden Gate技术构建得到基因编辑载体pRGEB35-CAD。以尾叶桉继代苗茎尖为材料建立原生质体转化体系,用pGFP质粒进行转化,依据GFP荧光激发结果统计体系的转化率为2.47%。将pRGEB35-CAD转化至原生质体,PCR鉴定显示在原生质体中EuCAD发生了预期的基因编辑,pRGEB35-CAD取得了预期基因编辑效果。本研究构建的EuCAD基因CRISPR/Cas9敲除载体可对目标基因进行基因编辑,为进一步创制EuCAD敲除突变体奠定了研究基础。 展开更多
关键词 crispr/Cas9敲除载体 原生质体转化 CAD基因 尾叶桉
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基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系
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作者 王楠 杜伟伟 +7 位作者 王婉洁 王悦 袁茂莎 聂雨欣 孙亚茹 刘志国 吴添文 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期1966-1976,共11页
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因... 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因与公猪精液品质性状之间的关系奠定基础。【方法】利用CRISPOR在线网站在猪WIP 1基因g.37536832 C>A位点附近区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX458-GFP载体;通过T7E1酶切试验检测3条sgRNA活性,选择效率较高的sgRNA。构建Donor载体,并将其与sgRNA载体共同转染至ST细胞,采用流式细胞术将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性细胞进行富集和单克隆细胞筛选,并对筛选出的单克隆细胞进行基因型鉴定。【结果】质粒测序结果表明,成功将3条sgRNA连接至pX458-GFP载体上;T7E1酶切结果显示,转染pX458-GFP-sgRNA1和pX458-GFP-sgRNA2质粒组产生了切割,效率分别为24%和27%,而转染pX458-GFP-sgRNA3质粒组未检测到切割,因此选择pX458-GFP-sgRNA2质粒进行试验。成功构建Donor载体,并将pX458-GFP-sgRNA2和Donor载体共转染至ST细胞。基因型鉴定结果显示,获得的269株单克隆中有205株细胞发生了基因编辑,基因编辑效率为76%,其中9株为WIP 1基因g.37536832 C>A位点纯合突变的ST细胞,精确突变效率为3%。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系,为深入研究WIP 1基因对公猪精液品质的影响提供了良好的细胞模型。 展开更多
关键词 crispr/Cas9 WIP 1基因 ST细胞系
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应用CRISPR/Cas9技术对五指山猪GHRHR基因的编辑
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作者 王文涛 张思佳 +9 位作者 何鑫淼 陈诗怡 吴赛辉 张冬杰 陈瑶生 丛佩清 亓美玉 田明 刘娣 何祖勇 《东北农业大学学报》 北大核心 2025年第2期44-52,共9页
生长激素释放激素受体(GHRHR)表达于垂体细胞表面,调节垂体生长激素合成与分泌,对动物生长发育发挥重要调控作用。为深入了解GHRHR对五指山猪生长发育的影响,通过CRISPR-ctRNP体外酶切试验,筛选出切割效率达27.3%的1条gRNA用于构建CRISP... 生长激素释放激素受体(GHRHR)表达于垂体细胞表面,调节垂体生长激素合成与分泌,对动物生长发育发挥重要调控作用。为深入了解GHRHR对五指山猪生长发育的影响,通过CRISPR-ctRNP体外酶切试验,筛选出切割效率达27.3%的1条gRNA用于构建CRISPR/Cas9表达载体。转染五指山猪肾细胞后,经流式分选富集到编辑效率高达100%的细胞群体作为供体细胞,进行体细胞核移植;再将250枚克隆胚胎转移至5头代孕母猪输卵管中,最终1头代孕母猪成功妊娠,分娩3头克隆仔猪均为GHRHR双等位基因编辑个体;编辑均导致GHRHR基因产生移码突变,可导致蛋白翻译提前终止,丧失生物学功能。最终仅有1头GHRHR编辑五指山猪存活,该个体60日龄时,体质量较野生型个体平均体质量下降23.4%。研究结果在五指山猪中实现GHRHR基因高效编辑,为培养微型宠物猪及解析GHRHR的调控功能提供理论依据。 展开更多
关键词 五指山猪 生长激素释放激素受体 基因编辑猪 crispr/Cas9
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基于RTCPA-CRISPR/Cas12a的牛病毒性腹泻病毒检测方法的建立及应用
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作者 蒙琦 常亮 +2 位作者 杨明 曹映辉 贺泂杰 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期80-88,共9页
本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,... 本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,此外,借助建立的该方法,开展了临床样品的检测。结果显示:所建立的检测方法对BVDV的最低检出限为8.0 copies/μL,并具有高度特异性,对42份临床样品检测显示,该方法与传统PCR方法的一致性好,符合率能达到92.86%。该研究建立了牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a检测方法,为该病的诊断提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 交叉引物恒温扩增技术 crispr/Cas12a 灵敏度 特异性
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基于CRISPR-Cas系统的多重耐药菌防治技术研究进展 被引量:1
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作者 周倩 唐梦君 +4 位作者 张小燕 陆俊贤 唐修君 杨星星 高玉时 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期42-51,共10页
动物源细菌耐药性影响动物养殖安全,同时对人类公共卫生和食品安全产生重要威胁。抗生素的滥用加剧了耐药细菌的传播,而新型抗菌药物研发日益困难,动物源细菌耐药污染已成为全球范围内的公共危机,一旦耐药菌从动物向人类扩散,将极大地... 动物源细菌耐药性影响动物养殖安全,同时对人类公共卫生和食品安全产生重要威胁。抗生素的滥用加剧了耐药细菌的传播,而新型抗菌药物研发日益困难,动物源细菌耐药污染已成为全球范围内的公共危机,一旦耐药菌从动物向人类扩散,将极大地威胁人类健康,亟须新的方法和策略应对细菌耐药。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR-associated)是第三代“基因组定点编辑技术”,该技术能够靶向剪切外源性核酸,保护微生物遗传物质遗传稳定性。与传统的多重耐药菌防治策略相比,CRISPR-Cas系统具备独特的DNA序列的靶向性和灵敏度,通过精准、简便和高效的基因编辑技术,与核酸扩增技术、比色技术等相结合,可以提高灵敏度和检测时效性等性能指标。本文介绍了CRISPR-Cas系统的由来、系统分类、基因编辑的作用机理,在此基础之上,聚焦于该系统在多重耐药菌防治领域的研究进展和应用,在耐药致病菌消除、耐药基因消除以及致病菌诊断检测方面给出案例分析以及目前存在的挑战。总的来说,基于CRISPR-Cas系统的序列特异性抗菌剂能够降低细菌多重耐药性,结合核酸扩增技术和实时监控设备提升检测的精准性和效率,为动物源细菌耐药防控和监测研究提供了新思路。 展开更多
关键词 crispr-Cas系统 基因编辑 多重耐药菌 耐药基因 防治技术
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基于CRISPR/Cas12a与重组酶扩增的非洲猪瘟病毒可视化检测技术
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作者 戴丽红 吴植 朱善元 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第12期124-129,共6页
旨在建立一种快速、灵敏且特异性强的即时诊断(point-of-care testing,POCT)非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,以满足现场快速诊断和监控的需求。本研究以ASFV的CD2v基因为靶点,采用酶促重组酶扩增技术(ERA)实现核酸的恒温快速扩增,并结合C... 旨在建立一种快速、灵敏且特异性强的即时诊断(point-of-care testing,POCT)非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,以满足现场快速诊断和监控的需求。本研究以ASFV的CD2v基因为靶点,采用酶促重组酶扩增技术(ERA)实现核酸的恒温快速扩增,并结合CRISPR/Cas12a系统对扩增产物进行特异性识别,同时结合荧光报告分子,构建了一种可视化快速检测体系。通过优化反应条件,验证了该体系的灵敏度、特异性和稳定性。结果:该检测体系在37℃恒温条件下,30 min内即可完成检测,灵敏度可达10 copies/μL病毒DNA。特异性检测结果显示,该体系未与伪狂犬病毒(PRV)等常见猪病病毒发生交叉反应,且阳性样品可通过肉眼直观识别。此外,该方法无需精密仪器和复杂操作,检测周期显著短于传统方法。综上,本研究建立的ASFV可视化快速检测体系具有快速、灵敏、特异性强和操作简便等特点,在实验室条件下表现出良好性能,为其在现场条件下的早期诊断和监测应用提供了技术储备和研究基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 即时诊断 酶促重组酶扩增技术 crispr/Cas12a 侧向流试验
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基于RPA-CRISPR/Cas13a-LFD的鸭星状病毒2型快速可视化检测方法的建立
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作者 何书海 陶梦筱 +4 位作者 王露遥 周德方 周静 成子强 黄立 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第7期1372-1377,共6页
为了实现鸭星状病毒2型(duck astrovirus type 2,DAstV-2)的高效快速检测,根据DAstV-2的ORF2基因保守序列设计合成了RPA引物和crRNA,构建了集RPA核酸扩增、LwCas13a切割和胶体金试纸条可视化显色于一体的DAstV-2检测方法,并评估了该检... 为了实现鸭星状病毒2型(duck astrovirus type 2,DAstV-2)的高效快速检测,根据DAstV-2的ORF2基因保守序列设计合成了RPA引物和crRNA,构建了集RPA核酸扩增、LwCas13a切割和胶体金试纸条可视化显色于一体的DAstV-2检测方法,并评估了该检测方法的灵敏性、特异性和符合性。结果显示,该方法对DAstV-2重组质粒标准品的检测限为1.2×10^(1)copies/μL,优于常规RT-PCR方法;可特异性检测DAstV-2病原核酸,对DAstV-1、DAstV-3、DAstV-4、鸭瘟病毒(duck plague virus,DEV)和鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)无交叉反应;在对疑似DAstV-2感染病鸭肝脏组织样本进行检测时,本方法与实时荧光定量PCR的检测结果完全一致,符合率为100%,但操作更加简便快捷。研究结果表明,所建立的RPA-CRISPR/Cas13a-LFD检测体系灵敏度高、特异性强、准确性高,能够在37℃恒温条件下1 h内完成DAstV-2核酸的快速可视化检测,为DAstV-2的快速诊断提供了新的技术平台。 展开更多
关键词 鸭星状病毒2型 重组酶聚合酶扩增 crispr/Cas13a 横向侧流层析试纸条 核酸检测
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利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻nsLTPs家族基因OsLTPL166
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作者 王伟 王俊敏 《分子植物育种》 北大核心 2025年第17期5727-5733,共7页
非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,nsLTPs)广泛存在于植物界中,参与许多关键的生物学过程,如花粉的发育、种子发育及细胞壁的延伸等。OsLTPL166基因编码区长度是465 bp,其编码的蛋白质由154个氨基酸组成;根据... 非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,nsLTPs)广泛存在于植物界中,参与许多关键的生物学过程,如花粉的发育、种子发育及细胞壁的延伸等。OsLTPL166基因编码区长度是465 bp,其编码的蛋白质由154个氨基酸组成;根据跨膜结构域及信号肽预测,OsLTPL166在13~35氨基酸处含有跨膜结构域,N端存在一个32个氨基酸残基的信号肽,切割位点位于氨基酸残基32和33之间,产生具有122个氨基酸残基的成熟蛋白质。组织表达分析发现,OsLTPL166仅在种子中特异性表达,且种子发育后期表达量较高。为了研究水稻Os LTPL166在种子发育中的功能,本研究以‘浙辐粳83’为遗传背景构建了敲除载体,利用CRISPR/Cas9技术对OsLTPL166进行定点编辑,共获得24个独立的转基因株系,其中纯合突变株系有7株,编辑方式主要为碱基的插入和缺失,导致氨基酸序列发生移码,成功获得OsLTPL166功能缺陷型突变体。本研究为进一步探究该基因在种子发育进程中的生物学功能提供了遗传材料。 展开更多
关键词 水稻 种子发育 非特异性脂质转移蛋白 crispr/Cas9
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CRISPR/Cas9技术(递送)在支气管上皮细胞中的应用和进展
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作者 张莹莹 王楚雯 钱国清 《中国病理生理杂志》 北大核心 2025年第1期173-180,共8页
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病... 规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病发病率升高,但治疗进展相对缓慢,亟需找到治疗的突破口。CRISPR/Cas9系统可以进行精准基因编辑,为慢性气道疾病提供新策略。本文从CRISPR/Cas9的多种递送方式和作用机制出发,对其在原代、永生化支气管上皮细胞和动物体内的应用与进展进行概述,探讨了其发展前景和面临的挑战,以期为未来应用该技术进行气道疾病治疗提供参考。 展开更多
关键词 crispr/Cas9系统 支气管上皮细胞 基因编辑
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基于CRISPR∕Cas9技术创制抗稻瘟病基因pi21突变体
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作者 谢留杰 段敏 黄善军 《上海农业学报》 2025年第2期8-15,共8页
利用CRISPR∕Cas9技术对台15-7糯的抗稻瘟病基因pi21进行编辑。选择位于pi21基因第一、第二外显子上的2段序列作为靶点构建双元表达载体pHUE411-pi21-Cas9,通过农杆菌侵染法获得21个以台15-7糯为背景的T0代单株。加代后在149个T1代单株... 利用CRISPR∕Cas9技术对台15-7糯的抗稻瘟病基因pi21进行编辑。选择位于pi21基因第一、第二外显子上的2段序列作为靶点构建双元表达载体pHUE411-pi21-Cas9,通过农杆菌侵染法获得21个以台15-7糯为背景的T0代单株。加代后在149个T1代单株中检测出6个不含载体的纯合突变体,包含3种突变类型,分别命名为pi21-t1、pi21-t2、pi21-t3,每种突变分别导致pi21基因编码的蛋白缺失227、239、99个氨基酸。稻瘟病鉴定结果表明:成熟期时,3种突变体中仅pi21-t3的病斑数量和面积较台15-7糯显著降低,其他2种突变体发病水平与台15-7糯基本相同。除抗稻瘟病能力有所提高外,突变体pi21-t3在成熟期的其他农艺性状,如株高、每穗粒数、结实率等,与台15-7糯没有显著差异。本研究可为抗稻瘟病水稻育种提供借鉴。 展开更多
关键词 crispr∕Cas9技术 pi21基因 稻瘟病 纯合突变体
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基于CRISPR-Cas9敲除系统的胚胎干细胞基态多能性退出调控基因的筛选与鉴定
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作者 杨艺 阮艳 +3 位作者 张俊磊 田衍平 余梦 李红丽 《陆军军医大学学报》 北大核心 2025年第18期2223-2236,共14页
目的系统性鉴定调控胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)基态多能性退出的关键基因,为深入解析多能性状态转换及早期细胞命运决定机制提供新靶点和理论依据。方法利用全基因组Brie敲除文库感染Nanog-绿色荧光蛋白(Nanog-green fluores... 目的系统性鉴定调控胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)基态多能性退出的关键基因,为深入解析多能性状态转换及早期细胞命运决定机制提供新靶点和理论依据。方法利用全基因组Brie敲除文库感染Nanog-绿色荧光蛋白(Nanog-green fluorescent protein,Nanog-GFP)报告基因标记的ESC,在白血病抑制因子/血清(leukemia inhibitory factor/serum,LIF/S)条件下持续培养14 d;通过流式细胞术分选Nanog-GFP^(+)(基态)与Nanog-GFP^(-)(始发态)细胞群,提取基因组DNA进行高通量测序;采用MAGeCK软件分析GFP^(-)/Input、GFP^(+)/Input与GFP^(+)/GFP^(-)组的差异基因,利用Metascape和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)进行功能富集分析;基于筛选结果构建候选基因敲除模型,通过细胞形态观察、Nanog阳性率检测、克隆形成实验及分子标志物检测评估候选基因功能。结果在GFP^(+)/Input筛选中,鉴定出2921个负向变化基因(主要富集于RNA代谢、细胞周期等基础生命过程)和1393个正向变化基因(主要富集于神经系统发育、糖代谢和脉管系统发育等过程)。在GFP^(-)/Input筛选中,鉴定到2765个负向变化基因(主要富集于RNA代谢、细胞周期等基础生命过程)和1303个正向变化基因(主要富集于神经发育、细胞存活、内皮迁移等过程)。在GFP^(+)/GFP^(-)筛选中,鉴定出1001个负向变化基因[主要参与细胞应激响应和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路抑制]和983个正向变化基因[主要参与成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶(fibroblast growth factor/extracellular signal-regulated kinase,FGF/ERK)信号通路和糖代谢过程],其中不仅包括已知的多能性维持因子(如Nanog、Nr5a2、Klf2、Klf4)及多能性退出相关基因(如Gata6、Grb2、Zeb1、Fgfr1),还包括一些在基态多能性退出过程中功能尚未明确的基因(如Dmrt1、Rxra、Zbtb14和Tmem41b)。候选基因功能验证显示,瞬时敲除Dmrt1、Tmem41b和Hic2的ESC中Nanog+细胞比例显著升高(P<0.01),表明这些基因可能抑制基态多能性退出。Dmrt1稳定敲除使ESC呈现更基态的表型,表现为克隆形态变紧密、呈穹隆状,未分化克隆比例增加(P<0.01),基态多能性标志基因(如Nanog、Nr5a2、Dppa3)表达上调(P<0.01),而始发态标志基因(如Fgf5、Lefty1、Dnmt3b)表达下调(P<0.01)。回复表达Dmrt1可逆转上述表型。结论本研究通过全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定出调控ESC基态多能性退出的候选基因集,明确Dmrt1在促进ESC基态多能性退出过程中的关键作用。 展开更多
关键词 crispr-Cas9 胚胎干细胞 基态 始发态 多能性退出
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绵羊无浆体LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的建立 被引量:2
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作者 郭心龙 周勇志 +4 位作者 曹杰 王亚楠 张厚双 段德勇 周金林 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第3期330-337,共8页
绵羊无浆体(Anaplasma ovis)是一种蜱传、寄生于红细胞内的细菌病原体,引起绵羊、山羊和野生反刍动物等发病,对我国养羊业发展造成严重危害。尽管已有多种绵羊无浆体诊断方法报道,但仍然缺少简易快捷、应用于现场的检测技术。本研究旨... 绵羊无浆体(Anaplasma ovis)是一种蜱传、寄生于红细胞内的细菌病原体,引起绵羊、山羊和野生反刍动物等发病,对我国养羊业发展造成严重危害。尽管已有多种绵羊无浆体诊断方法报道,但仍然缺少简易快捷、应用于现场的检测技术。本研究旨在建立一种针对绵羊无浆体msp4基因的LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法。该检测方法是在恒定温度下进行的,不需要特殊设备仪器,能够产生荧光呈现可视化的结果。通过优化LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的体系以确定各成分最佳浓度比。该检测方法能够检测到绵羊无浆体msp4基因最低质粒DNA拷贝数为3.90 copies/μL,具有较高的敏感性。检测其他无浆体和其他常见羊病原体时呈阴性,表明特异性良好。对临床样本的应用检测,与常规PCR检测结果符合率为100%。结果表明,建立的LAMP-CRISPR/Cas12a体系适用于绵羊无浆体的检测,具有快捷方便的现场诊断和在资源匮乏的情况下应用的优势。 展开更多
关键词 绵羊无浆体 msp4基因 LAMP crispr
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