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BRD4和ZNF76协同调控非洲猪瘟病毒p30表达促进病毒复制的机制研究
1
作者 陈迎恩 赵亚茹 +6 位作者 陈奕康 孙华林 张忠辉 杨吉飞 关贵全 殷宏 牛庆丽 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第10期1279-1290,共12页
本研究旨在解析宿主蛋白BRD4与ZNF76的相互作用对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)复制的协同调控作用。通过免疫沉淀联合质谱分析(IP-MS),鉴定出宿主BRD4蛋白通过其溴结构域(BD1/2)与宿主转录相关因子ZNF76存在相互作用... 本研究旨在解析宿主蛋白BRD4与ZNF76的相互作用对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)复制的协同调控作用。通过免疫沉淀联合质谱分析(IP-MS),鉴定出宿主BRD4蛋白通过其溴结构域(BD1/2)与宿主转录相关因子ZNF76存在相互作用。免疫荧光(IF)试验表明BRD4与ZNF76在细胞核内存在共定位现象。ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)时,ZNF76的m RNA和蛋白水平表达随ASFV感染时间延长及病毒感染复数增加呈现显著上调趋势,过表达试验则进一步证实ZNF76显著促进病毒复制。机制研究揭示BRD4和ZNF76复合物能结合ASFV早期关键蛋白p30,并通过协同作用增强其表达。本研究首次揭示了ZNF76作为促病毒复制因子的功能,明确了BRD4-ZNF76相互作用通过调控病毒蛋白表达促进ASFV复制的机制,为深入理解ASFV劫持宿主因子促进自身复制的分子基础及开发基于宿主靶点的抗病毒策略提供了重要理论支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 BRD4 ZNF76 协同调控 p30 相互作用
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非洲猪瘟病毒p30抗体竞争化学发光法的建立
2
作者 温升辉 邵军军 +5 位作者 高闪电 彭德财 常惠芸 丁嘉烽 刘伟 师铭咸 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第1期1-7,共7页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起猪的一种急性、热性、高致死性疾病。鉴于当前尚缺乏商业化的疫苗,并且近年来ASFV不断演变,中等毒力基因Ⅱ型毒株的涌现以及基因Ⅰ型弱毒... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起猪的一种急性、热性、高致死性疾病。鉴于当前尚缺乏商业化的疫苗,并且近年来ASFV不断演变,中等毒力基因Ⅱ型毒株的涌现以及基因Ⅰ型弱毒株的传入,导致猪仅出现了持续性和慢性感染的状况。因此,对ASFV的特异性抗体检测变得势在必行。本研究利用p30单克隆抗体建立了一种检测ASFV p30抗体的竞争化学发光法——p30-cCLIA。通过检测背景清晰的阴阳性血清,确定该方法的Cut-off值为50%时,诊断敏感性(Dsn)和诊断特异性(Dsp)均为100%。在最佳反应条件下筛选出适用于p30单抗16-5E7E8-HRP的酶标稳定剂。此外,本研究建立的p30-cCLIA方法的灵敏度比商品化阻断ELISA试剂盒更高(1∶2048 vs 1∶512),并具有良好的重复性。通过检测其他病毒感染猪阳性血清,结果表明与这些血清无交叉反应性。该方法的建立为ASF早期诊断提供了有力工具。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 p30抗体 抗体检测 化学发光法
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非洲猪瘟病毒p30蛋白在乳酸菌工程菌株中的表达及动物免疫
3
作者 陈萌萌 赵洪哲 +7 位作者 刘春羽 陈克伟 王亚新 孟海 王昊 张赫 温永俊 王凤雪 《动物医学进展》 北大核心 2025年第5期1-8,共8页
为了探究表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的重组乳酸杆菌口服免疫防控非洲猪瘟效果,以载体pPG612.1为骨架,构建重组质粒,将其电转到乳酸菌XM-38感受态细胞中,抗性筛选获得含有pPG612.1-p30表达质粒的重组乳酸... 为了探究表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的重组乳酸杆菌口服免疫防控非洲猪瘟效果,以载体pPG612.1为骨架,构建重组质粒,将其电转到乳酸菌XM-38感受态细胞中,抗性筛选获得含有pPG612.1-p30表达质粒的重组乳酸菌,木糖诱导其表达,通过Western blot和间接免疫荧光,鉴定融合表达蛋白的免疫反应性及膜表达定位;进一步用重组菌灌喂ASFV抗体阴性的健康仔猪,采集猪血清进行ELISA和Western blot检测p30抗体。结果表明,成功构建了融合表达ASFV p30蛋白的乳酸杆菌,命名为XM38-pPG612.1-p30;重组表达蛋白分子质量约59 ku,与p30单抗有良好结合活性;表达的ASFV p30能锚定在乳酸菌XM-38细胞表面;动物免疫试验表明重组菌XM38-pPG612.1-p30可刺激猪产生抗ASFV p30的抗体,为ASFV新型疫苗的研发提供了思路。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 p30蛋白 免疫原性 乳酸菌 细胞共定位
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刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文) 被引量：9
4
作者 张佃波 魏庆宽 +7 位作者 宰德富 崔勇 李瑾 高红刚 柏雪莲 赵立江 韩广东 刘克义 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期538-543,共6页
目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PC... 目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 p30和ROP2基因 融合蛋白 WESTERN blot.
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基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立 被引量：11
5
作者 孙燕燕 赵亚茹 +9 位作者 李昕 杨吉飞 牛庆丽 林密 王兆贵 刘猛 关贵全 殷宏 蒋韬 刘志杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期939-945,共7页
为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控... 为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 抗体检测 金纳米颗粒 免疫层析法
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弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果 被引量：14
6
作者 龚娅 陈晓光 冯明钊 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期282-286,共5页
目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜... 目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,包括信号肽及疏水尾 )pcDNA3 P30Mb ,分泌型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,不包括疏水尾 )pcDNA3 P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,但不包括信号肽 )pcDNA3 P30In。将以上 3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠 ,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体。　结果　成功构建了弓形虫P30基因 3种表达形式的重组质粒 ,经双酶切鉴定及DNA序列测定 ,3种重组质粒中的插入片段确为P30的编码基因 ,且读码框架正确 ;抗体测定显示 :3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体 ,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异。　结论　用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫 ,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体 ;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠 ,但 4wk后 3组间差异无显著性。 展开更多
关键词 弓形虫 p30 核酸免疫 重组质粒 免疫效果
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弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠的细胞免疫反应及抗体生成的动态过程 被引量：8
7
作者 李文姝 陆惠民 +2 位作者 张惠琴 夏超明 黄伟达 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第2期82-84,共3页
目的　观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫效果和抗体IgG的动态发生过程。方法　口服免疫BALB/c小鼠 ,一个月后 ,取鼠脾细胞作ConA刺激淋转试验 (MTT法 )及T细胞亚群的测定 ;不同免疫时间段内 ,收集实验鼠血清 ,ELIS... 目的　观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫效果和抗体IgG的动态发生过程。方法　口服免疫BALB/c小鼠 ,一个月后 ,取鼠脾细胞作ConA刺激淋转试验 (MTT法 )及T细胞亚群的测定 ;不同免疫时间段内 ,收集实验鼠血清 ,ELISA法检测抗体水平的变化。结果　P30乳酸球菌口服免疫组脾淋巴细胞ConA刺激后增殖能力比两对照组显著提高 ,CD+ 4 和CD+ 8的百分数均明显升高 ;第 12周 (即最后一次免疫结束一个月 ) ,P30乳酸球菌口服免疫组检测到特异性抗体IgG。结论　P30乳酸球菌口服疫苗有效地激发了小鼠细胞免疫反应 ,特异性抗体IgG在免疫结束一个月后生成明显。 展开更多
关键词 弓形虫 p30乳酸球菌口服疫苗 诱导 小鼠 细胞免疫反应 抗体生成 动态过程
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弓形虫表面抗原P22、P30复合基因在原核细胞中表达的研究 被引量：7
8
作者 古钦民 王伟 +4 位作者 卞继峰 丛华 胡海燕 何深一 李瑛 《山东大学学报（医学版）》 CAS 2002年第2期123-124,127,共3页
目的 :对含有P2 2、P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达 ,进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性。方法 :用IPTG对工程菌进行诱导表达 ,表达产物行SDS PAGE蛋白凝胶电泳及Western Blot免疫印记检测。结果 :蛋白电泳结果显示 ,阳... 目的 :对含有P2 2、P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达 ,进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性。方法 :用IPTG对工程菌进行诱导表达 ,表达产物行SDS PAGE蛋白凝胶电泳及Western Blot免疫印记检测。结果 :蛋白电泳结果显示 ,阳性重组菌比阴性菌在 6 6 .5KDa位置上明显多一条带 ,此条带可与P30抗体结合并使免疫印记显示阳性结果。结论 :含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体经诱导表达出融合蛋白 ,其内的组分蛋白P30具有与其相应抗体结合的能力。 展开更多
关键词 弓形虫 基因 p30 基因 P22 基因表达
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弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导的细胞免疫应答 被引量：16
9
作者 周永安 陈观今 +2 位作者 郭虹 郑焕钦 吕芳丽 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1999年第3期11-13,共3页
目的用pcDNA_3－P30真核表达质粒直接免疫小鼠，观察所诱导的小鼠细胞免疫应答。方法大量制备量级质粒pcDNA_3－P30，经肌肉注射BALB／c小鼠，每隔3周接种1次，一共免疫3次。用MTT方法对脾脏的NK杀伤细胞率和淋巴细胞的转化率进行测定... 目的用pcDNA_3－P30真核表达质粒直接免疫小鼠，观察所诱导的小鼠细胞免疫应答。方法大量制备量级质粒pcDNA_3－P30，经肌肉注射BALB／c小鼠，每隔3周接种1次，一共免疫3次。用MTT方法对脾脏的NK杀伤细胞率和淋巴细胞的转化率进行测定，采用免疫荧光法对CD4+、CD8+细胞进行测定。结果实验组NK细胞杀伤率为：70．0％±3．64，对照组及空白对照组分别为48．5％±6．06和470％±5．93，实验组NK细胞活性比对照组明显增高（P＜0．05）；ConA刺激小鼠淋巴细胞转化实验，实验组与对照组及空白对用级差异无显著性（P＞0．05）;对T淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋进行动态分析，可见随着感染时间的延长，CD8＋的数量逐渐上升，CD4＋／CD8＋的比率逐渐下降，实验组与对照组及空白对照有明显差异（P＜0．05）。结论重组质粒pcDNA3-p30免疫BALB／c小鼠可诱导一定的细胞免疫。 展开更多
关键词 弓形虫 DNA疫苗 p30基因 细胞免疫应答
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绵羊肺炎支原体Y98 P30基因的克隆、表达及免疫试验 被引量：8
10
作者 赵红艳 刘文青 +3 位作者 车腾飞 卢金华 宋静岚 赵宝华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期397-400,405,共5页
根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白P30基因序列设计引物,通过PCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白P30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOP30基因与Mhp P30基因核苷酸序列同源性为... 根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白P30基因序列设计引物,通过PCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白P30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOP30基因与Mhp P30基因核苷酸序列同源性为79%。抗原表位及跨膜结构预测的结果表明,MO P30基因与Mhp P30基因的抗原表位及跨膜结构均具有高度的一致性。该片段中含1个TGA编码Trp,而不是终止密码子。将P30基因与原核表达载体pET-28a连接构建pET-28a-P30表达质粒,转化受体菌Rossta得到重组菌株Rossta(pET-28a-P30)。经诱导后SDS-PAGE表明有30 000左右的目的条带出现;Western blot表明Rossta(pET-28a-P30)表达的30 000蛋白主要以包涵体的形式存在;小鼠免疫试验表明Rossta(pET-28a-P30)原核表达的蛋白对小鼠具有一定的保护作用。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体Y98 p30基因 基因表达 免疫动物
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弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达 被引量：12
11
作者 杨秋林 陆惠民 +1 位作者 闵太善 黄伟达 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第4期27-29,共3页
目的　在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ... 目的　在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ,并以SDS -PAGE和Westernblotting进行鉴定。 结果　 1、在我们比较的 783个碱基中 ,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同 ;2、得到一分子量为 5 4kDa的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 38%。结论　 1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异 ;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达。 展开更多
关键词 弓形虫 p30 PCR 基因表达 克隆
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非洲猪瘟病毒p30-54融合蛋白基因的构建、表达及其多克隆抗体制备 被引量：7
12
作者 李杰 张星星 +6 位作者 郭晶 孟庆玲 乔军 张国武 王晓婷 李妍 才学鹏 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第9期126-130,共5页
为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片... 为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30-54融合蛋白 大肠杆菌表达系统 多克隆抗体 反应原性
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绵羊肺炎支原体P30-HSP70C融合蛋白的表达及免疫原性研究 被引量：5
13
作者 刘文青 胡明丽 +1 位作者 孙红岩 赵宝华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期894-897,共4页
为增强绵羊肺炎支原体标准株Y98的外膜抗原P30的免疫原性,本研究构建p30-hsp70C融合基因的原核重组表达载体,并转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和western blot结果表明,P30-HSP70C融合蛋白约40%以可溶性形式表达。将r P30... 为增强绵羊肺炎支原体标准株Y98的外膜抗原P30的免疫原性,本研究构建p30-hsp70C融合基因的原核重组表达载体,并转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和western blot结果表明,P30-HSP70C融合蛋白约40%以可溶性形式表达。将r P30和r P30-HSP70C以100μg/只剂量分别免疫小鼠,免疫两次。间接ELISA试验表明,免疫的小鼠血清中两种蛋白的抗体效价分别为1∶8 000和1∶128 000。此外,两种蛋白免疫的小鼠血清中均检测出特异性的P30抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,r P30和r P30-HSP70C的免疫保护率分别为50%和80%。这些结果表明P30和HSP70C的融合表达可以显著增强P30蛋白的免疫保护效果。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 p30 HSP70C 克隆 表达 免疫原性
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基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：6
14
作者 马俊 王志远 +4 位作者 梁杏玲 郑泽中 杨汉春 张桂红 王衡 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4325-4336,共12页
旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原... 旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明^(146) PAEPYTT ^(152)为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2μg·mL^(-1)),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05%PBST溶液稀释5000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 p54蛋白 生物淘选 表位串联多肽 间接ELISA
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pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建与鉴定 被引量：4
15
作者 魏庆宽 王英婷 +10 位作者 闫运琴 肖婷 李瑾 徐超 刘功振 刘娟美 仲维霞 尹昆 付斌 闫歌 黄炳成 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 2014年第1期46-50,共5页
目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术将HBsA... 目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术将HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中。应用聚合酶链反应(PCR)初筛,再采用酶切、测序等技术对构建的重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2进行鉴定。结果 PCR扩增出HBsAg基因片段,构建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表达载体。PCR与酶切结果显示,该基因片段大小均与理论值相符;测序结果显示该重组表达载体包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列。结论成功构建了多基因重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2,为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 表面抗原1(p30) 棒状体分泌抗原2(ROP2) 乙肝表面抗原 基因重组
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截短的弓形虫P30基因在E.coli中的高效表达及纯化条件的探索 被引量：13
16
作者 龚娅 陈晓光 杨培梁 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第2期14-18,共5页
目的　构建能在E .coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原 (P30 )基因的重组表达质粒 ,并对纯化条件进行优化。方法　对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍 ,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段 ,插入载体pET ... 目的　构建能在E .coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原 (P30 )基因的重组表达质粒 ,并对纯化条件进行优化。方法　对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍 ,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段 ,插入载体pET 30 (a)中 ,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达 ,包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后 ,进行SDS PAGE及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段 ,成功构建重组表达质粒 pET P30 ;SDS -PAGE显示蛋白表达带的分子量约为 31kD ,表达量占菌体总蛋白的 31.5 8% ,经 1M及 2M尿素洗涤后 ,其纯度分别达 6 3.42 %及 75 .74% ;免疫印迹显示 ,该纯化蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别 ,而且当浓缩至初始体积的 1/ 3～ 1/ 6时 ,纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应最强。结论　成功构建重组质粒 pET P30 ,并以融合蛋白的形式进行了高效表达 ,经变性、复性后 ,该蛋白具有特异的免疫反应性 ,为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。 展开更多
关键词 弓形虫 p30基因 蛋白表达 E.COLI 纯化
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弓形虫P30基因-乳酸乳球菌重组质粒的构建及其表达 被引量：5
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作者 易艳军 许丽芳 +1 位作者 周支香 杨秋林 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2012年第6期440-442,共3页
目的构建表达弓形虫昆山分离株P30基因的乳酸乳球菌表达载体L2-Ps-P30-T,并在乳酸乳球菌中表达P30蛋白。方法用BamHⅠ/XhoⅠ将P30从质粒pSK-P30中切出并克隆至质粒pSK-PsT,构建pSK-Ps-P30-T质粒;用PvuⅡ将表达元件-Ps-P30-T-从pSK-Ps-P3... 目的构建表达弓形虫昆山分离株P30基因的乳酸乳球菌表达载体L2-Ps-P30-T,并在乳酸乳球菌中表达P30蛋白。方法用BamHⅠ/XhoⅠ将P30从质粒pSK-P30中切出并克隆至质粒pSK-PsT,构建pSK-Ps-P30-T质粒;用PvuⅡ将表达元件-Ps-P30-T-从pSK-Ps-P30-T质粒中切出,以相同的酶切位点导入大肠埃希菌与乳酸乳球菌穿梭质粒pTRKL2,构建L2-Ps-P30-T质粒;通过电转化将L2-Ps-P30-T导入乳酸乳球菌中,以Western blot鉴定P30蛋白的表达。结果酶切及PCR鉴定质粒L2-Ps-P30-T构建正确,并在乳酸乳球菌中表达能被弓形虫病患者血清识别的分子质量单位为30ku的蛋白。结论重组载体L2-Ps-P30-T构建正确,电转化入乳酸乳球菌后能表达具有反应原性的P30蛋白。 展开更多
关键词 弓形虫 p30 乳酸乳球菌 表达
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绵羊肺炎支原体Y98标准株P30外膜蛋白与IFN-γ的融合表达及其免疫原性 被引量：4
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作者 张亚宁 刘文青 +2 位作者 赵红艳 张乐祎 赵宝华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期843-848,共6页
以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneonia,MO)标准株Y98的P30外膜蛋白为抗原,同时以细胞因子IFN-γ为佐剂,将两者串联融合表达。小鼠免疫保护试验结果显示,P30重组蛋白的免疫保护率为60%,IFN-γ重组蛋白的免疫保护率为20%,P30-IFN-γ... 以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneonia,MO)标准株Y98的P30外膜蛋白为抗原,同时以细胞因子IFN-γ为佐剂,将两者串联融合表达。小鼠免疫保护试验结果显示,P30重组蛋白的免疫保护率为60%,IFN-γ重组蛋白的免疫保护率为20%,P30-IFN-γ重组蛋白的免疫保护率达到80%。间接ELISA试验证实,经100μL与200μL P30-IFN-γ重组蛋白免疫小鼠的血清中,P30抗体效价分别为1∶32 000与1∶64 000。以上结果证实,所制备的重组蛋白对小鼠实验个体基本安全,且P30-IFN-γ重组蛋白中的细胞因子IFN-γ组分可以调节机体免疫机能,增强P30蛋白的免疫保护效果。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 p30基因 IFN-Γ 融合蛋白
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弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究 被引量：7
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作者 周永安 陈观今 +1 位作者 郭虹 郑焕钦 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1999年第5期41-43,共3页
目的　用重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠， 观察其 Ｄ Ｎ Ａ 免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法　大量制备质粒 Ｄ Ｎ Ａ， 肌肉注射免疫小鼠。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定 Ｉｇ Ｇ 抗体滴度；... 目的　用重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠， 观察其 Ｄ Ｎ Ａ 免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法　大量制备质粒 Ｄ Ｎ Ａ， 肌肉注射免疫小鼠。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定 Ｉｇ Ｇ 抗体滴度； 免疫鼠血液组织 Ｐ３０ 基因 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增； 弓形虫攻击感染。结果　用 Ｅ Ｌ Ｉ Ａ Ｓ 法检测的抗体 Ｉｇ Ｇ 滴度１∶２５６０ ， 免疫后３ 周及６ 个月从免疫鼠血液组织中检测到 Ｐ３０ 基因；攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长（ Ｐ＜ ００５） ， 结论　重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠可诱导一定的体液免疫应答， 对抗攻击感染具有一定的保护性。 展开更多
关键词 DNA 弓形体病 p30基因 免疫应答 小鼠
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弓形虫P30乳酸球菌口服免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-2及NO含量的测定 被引量：5
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作者 李文姝 陆惠民 +1 位作者 张惠琴 黄伟达 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2006年第5期356-358,共3页
目的观察弓形虫P30乳酸球菌(L.lactis/P30)口服免疫鼠血清中细胞因子IFN-γI、L-2及NO的变化情况。方法L.lactis/P30口服免疫BALB/c小鼠,以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为对照,在第3周、第9周及第12周分别收集各实验组小鼠血清,ELISA法... 目的观察弓形虫P30乳酸球菌(L.lactis/P30)口服免疫鼠血清中细胞因子IFN-γI、L-2及NO的变化情况。方法L.lactis/P30口服免疫BALB/c小鼠,以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为对照,在第3周、第9周及第12周分别收集各实验组小鼠血清,ELISA法测定血清IFN-γI、L-2含量;酶法测定NO浓度。结果L.lactis/P30口服免疫鼠血清中IFN-γI、L-2含量均显著高于两对照组,血清中NO含量随着免疫时间延长与两对照组差异逐渐明显。结论L.lactis/P30口服免疫能有效刺激小鼠细胞因子IFN-γ和IL-2的产生及NO分子的释放。 展开更多
关键词 弓形虫 p30乳酸球菌 口服免疫 细胞因子 NO
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