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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究 被引量：9
1
作者 李强 梁耀东 +2 位作者 成军 王琳 程明亮 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2003年第3期254-256,共3页
目的　筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因 ,研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法　应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 ,以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-) -NS5A转染HepG2细胞 ,... 目的　筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因 ,研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法　应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 ,以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-) -NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列数据库的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 70。结果　NS5ATP9基因的编码序列全长为 3 3 6个核苷酸 (nt) ,编码产物由 111个氨基酸残基 (aa)组成 ,并成功的克隆化。结论　HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆 。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白NS5A 反式激活 ns5atp9 基因克隆化 分子生物学机制
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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因 被引量：2
2
作者 李强 梁耀东 +5 位作者 成军 王琳 张建 邵清 刘敏 程明亮 《世界华人消化杂志》 CAS 2004年第4期828-831,共4页
目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术, 筛选并克隆人白细胞中与NS5A... 目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术, 筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有C-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1 个,RNA多聚酶Ⅲ3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1 个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个. 结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索. 展开更多
关键词 酵母双杂交技术 白细胞 ns5atp9蛋白 抑制性消减杂交技术 SSH 编码基因 酵母细胞
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应用表达谱芯片技术筛选NS5ATP9反式调节基因的研究 被引量：2
3
作者 李强 梁耀东 +5 位作者 成军 王琳 王建军 张健 刘妍 程明亮 《世界华人消化杂志》 CAS 2004年第2期323-326,共4页
目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP9基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP9,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NSSATP9转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞... 目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)的反式调节基因.方法:构建NS5ATP9基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP9,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NSSATP9转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP9后,有16条差异基因表达水平发生显著改变,其中3条基因表达增强,13条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化、凋亡及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒NS5ATP9作用HepG2细胞后差异表达基因,为阐明NS5ATP9的作用提供了新的依据. 展开更多
关键词 表达谱芯片技术 ns5atp9反式调节基因 肝炎病毒 HCV 基因功能 丙型肝炎
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NS5ATP9对饥饿诱导的肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡的作用 被引量：1
4
作者 全敏 刘顺爱 成军 《中国肝脏病杂志（电子版）》 CAS 2016年第4期52-56,共5页
目的观察NS5ATP9对饥饿诱导肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡的作用随时间的变化。方法将NS5ATP9的表达载体、siRNA小分子干扰及其各自的对照分别转染HepG2细胞48小时后,分别用EBSS饥饿细胞12小时、24小时、36小时和48小时后,利用Annexin V/7-AA... 目的观察NS5ATP9对饥饿诱导肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡的作用随时间的变化。方法将NS5ATP9的表达载体、siRNA小分子干扰及其各自的对照分别转染HepG2细胞48小时后,分别用EBSS饥饿细胞12小时、24小时、36小时和48小时后,利用Annexin V/7-AAD流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。同时利用化学发光法检测胱冬肽酶-3/7(caspase-3/7)的活性变化,观察饥饿不同时间点NS5ATP9对细胞凋亡的作用变化。结果①与对照组相比,NS5ATP9过表达组在HepG2饥饿24小时、36小时和48小时后,总凋亡率显著减低(t=17.132、9.138、17.318,P=0.003、0.012、0.003);12小时、36小时和48小时caspase-3/7酶活性显著减低(t=7.637、6.944、13.490,P=0.017、0.02、0.005),二者均以48小时最显著。②与对照组相比,si-NS5APT9转染组在HepG2饥饿36小时和48小时总凋亡率显著增加(t=-5.064、-4.342,P=0.034、0.049),12小时、36小时和48小时caspase-3/7酶活性显著增加(t=-8.837、-7.469、-18.630,P=0.013、0.017、0.003),二者均以48小时最显著。结论在HepG2细胞中NS5ATP9能显著抑制饥饿诱导的细胞凋亡,随着饥饿时间的延长,NS5ATP9对细胞凋亡率的抑制越明显,以48小时最为显著。 展开更多
关键词 ns5atp9 饥饿 细胞凋亡
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Beclin 1介导NS5ATP9对饥饿诱导的HepG2细胞凋亡的作用 被引量：1
5
作者 全敏 邢卉春 《肝脏》 2022年第7期782-784,788,共4页
目的探讨Beclin 1在NS5ATP9抑制饥饿诱导肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡中的作用。方法将HepG2细胞用EBSS饥饿不同时间点,通过蛋白质印迹法检测NS5ATP9、Beclin1及bax蛋白的表达变化;将NS5ATP9的siRNA及过表达载体分别转染HepG2细胞48 h后,用E... 目的探讨Beclin 1在NS5ATP9抑制饥饿诱导肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡中的作用。方法将HepG2细胞用EBSS饥饿不同时间点,通过蛋白质印迹法检测NS5ATP9、Beclin1及bax蛋白的表达变化;将NS5ATP9的siRNA及过表达载体分别转染HepG2细胞48 h后,用EBSS饥饿细胞24 h,通过蛋白质印迹检测bax的变化;应用Beclin 1siRNA抑制Beclin 1表达后,转染NS5ATP9过表达载体,EBSS饥饿细胞24 h,利用化学发光法检测胱冬肽酶-3/7(caspase-3/7)的活性变化,同时用蛋白质印迹法检测NS5ATP9、Beclin1,bax蛋白的表达变化。结果饥饿HepG2细胞0、6、12、18、24 h后,NS5ATP9及bax的蛋白表达量相应升高。NS5ATP9表达被抑制后,bax蛋白表达量增加。饥饿HepG2细胞24 h后,Beclin 1表达被抑制,caspase-3/7的活性增加(P=0.001),NS5ATP9抑制caspase-3/7活性的作用减弱(P<0.01)。NS5ATP9对bax的负性调控作用减弱。结论Beclin 1通过下调bax的表达部分参与了NS5ATP9抑制饥饿诱导HepG2细胞凋亡的作用。 展开更多
关键词 ns5atp9 饥饿 细胞凋亡 Beclin 1 bax
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NS5 ATP9抑制血清饥饿诱导的HepG2细胞凋亡 被引量：2
6
作者 赵崇山 刘顺爱 +3 位作者 王琦 张锦前 赵龙凤 成军 《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》 CAS 2012年第2期1-4,共4页
目的探讨HCV NS5A反式激活基因NS5ATP9对肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响。方法将NS5ATP9基因表达质粒、NS5ATP9干扰RNA质粒及各自的对照空质粒转染到HepG2细胞中,48h后换无血清培养基培养24h诱导细胞凋亡,采用实时荧光定量PCR验证转染后... 目的探讨HCV NS5A反式激活基因NS5ATP9对肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响。方法将NS5ATP9基因表达质粒、NS5ATP9干扰RNA质粒及各自的对照空质粒转染到HepG2细胞中,48h后换无血清培养基培养24h诱导细胞凋亡,采用实时荧光定量PCR验证转染后NS5ATP9mRNA表达水平的变化,采用Annexin V/7-AAD流式细胞术检测细胞凋亡情况,JC-1检测线粒体膜电位,Western blot检测Bax蛋白表达,综合观察NS5ATP9对HepG2细胞血清饥饿诱导凋亡的影响。结果 Annexin V/7-AAD检测结果显示,和对照组细胞相比NS5ATP9过表达组早期凋亡和总凋亡率显著减少(P<0.05);而NS5ATP9干扰RNA组细胞的早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡率均显著增加(P<0.05)。JC-1检测结果显示,和对照组相比NS5ATP9过表达组细胞线粒体膜电位保持正常形式的比例增加,而出现去极化电位形式的比例显著减少(P<0.05);而NS5ATP9干扰RNA组线粒体膜电位保持正常形式的比例显著减少(P<0.05)。Western blot检测结果显示,NS5ATP9干扰RNA组促凋亡分子Bax表达量显著升高(P<0.05),NS5ATP9过表达组Bax表达量则有下降趋势。结论 NS5ATP9基因抑制血清饥饿诱导的HepG2细胞凋亡,其机制可能是通过线粒体途径实现。 展开更多
关键词 ns5atp9基因 细胞凋亡 线粒体
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节蛋白9的研究进展 被引量：1
7
作者 周利 成军 《中华实验和临床感染病杂志（电子版）》 CAS 2015年第4期10-13,共4页
HCV NS5A反式调节蛋白9(NS5ATP9),是一种增殖细胞核抗原结合因子,在生物体内参与多种功能,如细胞增殖、分化、凋亡及DNA复制、损伤修复和信号转导等,在肿瘤的发生发展中也起着一定作用。本文将对NS5ATP9的前期研究进行总结,以利于后期... HCV NS5A反式调节蛋白9(NS5ATP9),是一种增殖细胞核抗原结合因子,在生物体内参与多种功能,如细胞增殖、分化、凋亡及DNA复制、损伤修复和信号转导等,在肿瘤的发生发展中也起着一定作用。本文将对NS5ATP9的前期研究进行总结,以利于后期对其作用机制和其他功能进行深入探究。 展开更多
关键词 HCV NS5A反式调节蛋白9 增殖细胞核抗原 肝纤维化 自噬 抑癌基因
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