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NK4基因转染对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响 被引量：5
1
作者 赖人旭 张世能 +1 位作者 Toshikazu Nakamura 袁世珍 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第10期1191-1195,共5页
背景与目的:NK4不仅是肝细胞生长因子的拮抗剂,而且是血管形成的抑制剂。研究已经证实NK4可以抑制肿瘤的生长和转移,但有关其在胰腺癌中的作用,目前少见文献报道。为此,本研究旨在探讨NK4基因在裸鼠体内的抗胰腺癌作用及其可能的机制。... 背景与目的:NK4不仅是肝细胞生长因子的拮抗剂,而且是血管形成的抑制剂。研究已经证实NK4可以抑制肿瘤的生长和转移,但有关其在胰腺癌中的作用,目前少见文献报道。为此,本研究旨在探讨NK4基因在裸鼠体内的抗胰腺癌作用及其可能的机制。方法:建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,构建NK4基因真核细胞表达载体并转染入瘤体内,转染前后称其体重、瘤重和测肿瘤体积,采用免疫组织化学和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术对裸鼠胰腺癌组织中的凋亡细胞、增殖抗原和微血管密度进行观察和比较。结果:4周后,NK4转染组裸鼠移植瘤体积为(1.39±0.33)cm3,明显小于对照组和空载体组[(2.06±0.55)cm3和(1.90±0.36)cm3,P<0.01];其瘤重为(1.30±0.81)g,也显著低于对照组和空载体组[(3.45±1.88)g和(3.14±1.51)g,P<0.01],抑瘤率为62.29%。NK4转染组肿瘤细胞的凋亡指数为9.34±0.91,显著高于对照组和空载体组(4.13±0.79和3.94±1.03,P<0.001);而NK4转染组肿瘤细胞的增殖指数为53.88±4.30,与对照组间和空载体组比较无显著性差异(56.24±4.03和54.33±5.41,P>0.05);NK4转染组肿瘤组织的微血管密度为(12.24±4.63),明显低于对照组和空载体组(20.13±7.00和19.70±6.15,P<0.05)。结论:转染NK4基因可显著抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长,其作用机制可能是通过抑制肿瘤新生血管的形成,促进肿瘤细胞凋亡。 展开更多
关键词 胰腺肿瘤 移植瘤 nk4/拮抗剂和抑制剂 nk4 基因 基因转染 基因治疗 血管形成 裸鼠 nk4基因
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纳豆芽孢杆菌Bacillus natto NK4液态发酵产纳豆激酶的工艺优化
2
作者 叶延欣 秦鹏 +4 位作者 别鹏坤 张书斌 李蕾蕾 陈艳艳 张道雷 《河南城建学院学报》 CAS 2024年第2期103-108,132,共7页
为提高纳豆激酶的产量,采用单因素试验及正交试验对纳豆芽孢杆菌Bacillus natto NK4进行发酵条件优化,获得该菌种液体发酵产酶的最优条件。结果表明,纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶最佳的发酵条件为接种量2%,培养基初始pH值6.0,培养温度34℃,... 为提高纳豆激酶的产量,采用单因素试验及正交试验对纳豆芽孢杆菌Bacillus natto NK4进行发酵条件优化,获得该菌种液体发酵产酶的最优条件。结果表明,纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶最佳的发酵条件为接种量2%,培养基初始pH值6.0,培养温度34℃,发酵时间72 h。此时,纳豆激酶酶活力由848.28 IU/mL提高到1569.31 IU/mL。 展开更多
关键词 Bacillus natto nk4 纳豆激酶 正交试验 发酵条件
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NK4基因的克隆及其在Raji细胞中的表达 被引量：5
3
作者 滑世轩 岑东 +3 位作者 赵行 吕建新 涂植光 裴仁治 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期970-975,共6页
目的:克隆NK4基因,构建其重组真核表达载体,并观察其在Raji细胞中的表达。方法:从人肝组织中提取总RNA,行RT-PCR获得NK4基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞。潮霉素B筛选后,采用实时荧光定量PCR、ELISA、细... 目的:克隆NK4基因,构建其重组真核表达载体,并观察其在Raji细胞中的表达。方法:从人肝组织中提取总RNA,行RT-PCR获得NK4基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞。潮霉素B筛选后,采用实时荧光定量PCR、ELISA、细胞免疫组化和半固体培养等方法检测NK4基因在Raji细胞的表达,筛选稳定表达的细胞株。结果:NK4基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs-NK4;转染NK4基因后的Raji细胞经RT-PCR发现存在特异性DNA片段。NK4基因在Raji细胞可稳定表达NK4mR-NA和蛋白,且可抑制Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭。结论:NK4基因成功克隆并构建了重组真核表达载体,转染Raji细胞后表达稳定。 展开更多
关键词 基因 nk4 克隆 基因表达 RAJI细胞
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重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的构建与鉴定 被引量：3
4
作者 匡文斌 成凤 +5 位作者 秦晓林 范晓卿 王秦 董晋豫 梁勤东 涂植光 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第6期676-681,共6页
目的构建携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法以pcDNA3/hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至腺... 目的构建携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法以pcDNA3/hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-hNK4,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP,经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,经4轮扩增后,测定病毒滴度;将重组腺病毒感染AD-293细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测感染细胞中NK4基因的转录及蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hNK4-EGFP对肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)诱导的MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;经包装及4轮扩增后,重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的滴度可达1.5×1011PFU/ml;经RT-PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的NK4基因能够在AD-293细胞中表达;HGF可促进MDA-MB-231细胞增殖,而Ad5-hNK4-EGFP可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞增殖。结论成功构建了表达hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,其可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞的增殖,为进一步深入研究HGF和NK4的功能、相互作用及作用机制奠定了基础,也为乳腺癌的靶向基因治疗提供了一个新的靶点。 展开更多
关键词 腺病毒 肝细胞生长因子 nk4 乳腺癌 基因治疗
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NK4拮抗HGF促进肿瘤细胞凋亡的生物学效应 被引量：3
5
作者 郑筱娇 高洲 +4 位作者 沈蓉蓉 岑东 裴仁治 罗建平 吕建新 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期674-681,共8页
观察NK4通过拮抗肝细胞生长因子(HGF)诱导不同肿瘤细胞凋亡,研究其生物学作用及分子机制.以足叶乙甙(VP-16)诱导凋亡,分别或经HGF蛋白、NK4蛋白处理5种肿瘤细胞(B细胞淋巴瘤细胞系Raji、人急性粒细胞白血病细胞系HL-60、宫颈癌细胞系HeL... 观察NK4通过拮抗肝细胞生长因子(HGF)诱导不同肿瘤细胞凋亡,研究其生物学作用及分子机制.以足叶乙甙(VP-16)诱导凋亡,分别或经HGF蛋白、NK4蛋白处理5种肿瘤细胞(B细胞淋巴瘤细胞系Raji、人急性粒细胞白血病细胞系HL-60、宫颈癌细胞系HeLa、前列腺癌细胞系PC-3、非小细胞肺癌细胞系A549),采用流式细胞术(FCM)、吖啶橙(AO)染色法、苏木素-伊红(HE)染色法定量观察5种肿瘤细胞的凋亡情况,并进行相关分析.FCM发现,经VP-16处理5种肿瘤细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.001),而HGF+VP-16组凋亡率明显下降(P<0.01),HGF+NK4+VP-16组细胞凋亡率均明显高于HGF+VP-16组(P<0.05).AO染色和HE染色结果也证实,5种肿瘤细胞经VP-16处理后凋亡率均显著增高(P<0.001,P<0.001),而HGF+VP-16组细胞凋亡率均明显低于VP-16组(P<0.001,P<0.01),HGF+NK4+VP-16组细胞凋亡率均明显高于HGF+VP-16组(P<0.001,P<0.05).此外,发现NK4+VP-16组、HGF+NK4+VP-16组、VP-16组等3组间凋亡率无统计学差异(P>0.05).以上结果提示,HGF蛋白可抵抗凋亡诱导剂VP16的作用,明显降低细胞凋亡;NK4通过竞争性抑制HGF从而促进肿瘤细胞的凋亡,具有潜在的肿瘤治疗价值. 展开更多
关键词 肝细胞生长因子 肝细胞生长因子拮抗剂nk4 凋亡 拮抗
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NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达 被引量：4
6
作者 李霏 李松林 尹元琴 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1081-1084,共4页
目的构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况。方法采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位... 目的构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况。方法采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLenti6.3-NK4-IRES-EGFP共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选最适MOI,以最适MOI重组慢病毒感染HCCLM3细胞,观察转染效率。Western blot法测定细胞中NK4蛋白表达水平。结果成功构建共表达NK4基因和EGFP基因的慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES-EGFP,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL。重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI为7。转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达,而未转染细胞中无NK4蛋白的表达。结论成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体,有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白。 展开更多
关键词 nk4 慢病毒载体 人高侵袭转移肝癌细胞LM3 基因转染
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利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4 被引量：6
7
作者 阙文忠 陈君敏 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期462-467,共6页
目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重... 目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上,利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAD/BL-DEST,获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞,获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID 50(tissue cell infectiousdosage 50,TCID 50)法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。结果证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段;病毒滴度为6.3×1011 PFU.L-1;荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。 展开更多
关键词 腺病毒 GATEWAY技术 人肝细胞生长因子 nk4 基因治疗 肿瘤
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表达GST-NK4工程菌的发酵工艺研究 被引量：2
8
作者 常冰梅 解军 +4 位作者 王勇 张俊芳 张悦红 程牛亮 牛勃 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 2005年第2期102-104,共3页
目的建立重组GST NK4融合基因工程菌的发酵工艺。方法采用摇瓶、发酵罐发酵,对影响工程菌生长和表达的条件如pH值、诱导时间及诱导剂浓度等进行优化。结果根据优化的条件,15L发酵罐发酵11h ,菌体收获量可达到湿重(2 4 .6±0 .98)g/... 目的建立重组GST NK4融合基因工程菌的发酵工艺。方法采用摇瓶、发酵罐发酵,对影响工程菌生长和表达的条件如pH值、诱导时间及诱导剂浓度等进行优化。结果根据优化的条件,15L发酵罐发酵11h ,菌体收获量可达到湿重(2 4 .6±0 .98)g/L ,目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的5 0 %左右。结论确定了周期短。 展开更多
关键词 nk4 大肠杆菌 发酵
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转染NK4基因对人胰腺癌SW1990细胞生物学特性的影响 被引量：3
9
作者 赖人旭 袁世珍 Toshikazu Nakamura 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第10期1134-1138,共5页
背景与目的:肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)通过其受体c-Met的激活,在调节肿瘤侵袭和转移和血管形成中具有重要作用。NK4不仅是HGF的拮抗剂,也是血管形成的抑制剂,阻断HGF/c-Met途径和肿瘤血管的形成可成为抗肿瘤治疗的策... 背景与目的:肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)通过其受体c-Met的激活,在调节肿瘤侵袭和转移和血管形成中具有重要作用。NK4不仅是HGF的拮抗剂,也是血管形成的抑制剂,阻断HGF/c-Met途径和肿瘤血管的形成可成为抗肿瘤治疗的策略之一。为此,我们构建NK4基因真核细胞表达载体并进行转染研究,探讨NK4基因在胰腺癌细胞中的表达及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响。方法:对重组pcDNA3/hNK4质粒进行酶切,将NK4基因克隆到真核表达载体pRC/CMV2,应用脂质体将重组pRC/CMV2-hNK4质粒转入胰腺癌SW1990细胞中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Westernblot)分别检测转染的肿瘤细胞中NK4mRNA和蛋白的表达并筛选出高表达的细胞克隆。采用Transwall小室和Matrigel侵袭小室测定转染NK4基因对胰腺癌细胞运动和侵袭的影响。结果:转导NK4基因的SW1990细胞可表达并分泌NK4,RT-PCR扩增出预期的453bp片段,Westernblot显示有50000的NK4蛋白,转染NK4基因对胰腺癌细胞SW1990的生长无抑制作用(P>0.05),但可显著抑制HGF或成纤维细胞所诱导胰腺癌细胞的运动和侵袭(P<0.01),而转染空载体则无此作用(P>0.05)。结论:转染NK4基因可抑制胰腺癌细胞的运动和侵袭,在胰腺癌抗转移治疗中可能具有重要作用。 展开更多
关键词 nk4基因 转染 胰腺癌细胞 HGF 侵袭 细胞生物学特性 运动 真核细胞表达载体 质粒 细胞克隆
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NK4基因在重组腺病毒中的表达与初步鉴定 被引量：3
10
作者 介建政 王健伟 +3 位作者 王巍 姜秀丽 魏强 洪涛 《中国实验诊断学》 2003年第5期397-400,共4页
目的　构建含有肝细胞生长因子 (HGF)NK4基因的重组腺病毒载体 ,为应用HGF/NK4进行肿瘤基因治疗奠定实验基础。方法　应用AdEasy腺病毒载体系统 ,将PCR扩增所得的NK4基因片段与穿梭质粒pShuttle CMV进行连接 ,获得重组质粒pShuttle CMV ... 目的　构建含有肝细胞生长因子 (HGF)NK4基因的重组腺病毒载体 ,为应用HGF/NK4进行肿瘤基因治疗奠定实验基础。方法　应用AdEasy腺病毒载体系统 ,将PCR扩增所得的NK4基因片段与穿梭质粒pShuttle CMV进行连接 ,获得重组质粒pShuttle CMV NK4 ,将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ5 183获得重组腺病毒质粒pAdCMV NK4 ,用该质粒转染 2 93细胞包装产生出重组腺病毒rvAdCMV NK4。重组腺病毒分别经电子显微镜技术及RT PCR、WesternBlot等方法进行鉴定。结果　得到含有NK4基因的重组腺病毒rvAdCMV NK4 ,电子显微镜下可见典型腺病毒颗粒形态 ,RT PCR及WesternBlot分析显示rvAdCMV NK4感染 2 93细胞后NK4基因可有效转录并表达。结论　成功构建出含有NK4基因的重组腺病毒rvAdCMV NK4 ,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。 展开更多
关键词 nk4基因 重组腺病毒 鉴定 腺病毒载体 肝细胞生长因子 肿瘤 基因治疗
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NK4蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化、复性及活性测定 被引量：1
11
作者 常冰梅 刘晓军 +3 位作者 李美宁 张悦红 程牛亮 牛勃 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期60-65,共6页
目的在大肠埃希菌(E.coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性。方法采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E.coliBL21(DE3),温控诱导表达目的蛋白NK4。蛋... 目的在大肠埃希菌(E.coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性。方法采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E.coliBL21(DE3),温控诱导表达目的蛋白NK4。蛋白鉴定采用SDS-PAGE和Western blot;蛋白纯化采用包涵体超声破碎、洗涤和Sephacryl-S200凝胶过滤层析。经梯度稀释复性后,采用MTT法和免疫细胞化学方法检测重组蛋白NK4对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)ECV304增殖的作用。结果重组质粒pBV220-NK4酶切图谱和序列测定与预期一致。SDS-PAGE显示有相对分子质量49 000的目的蛋白,表达量为30%。Western blot结果证实目的蛋白带有NK4的氨基端,经包涵体洗涤、层析后NK4的纯度为95%。复性后的NK4可抑制ECV304增殖,并抑制ECV304增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen,PCNA)的表达。结论我们建立了NK4的原核高表达体系及纯化制备工艺,所制备的NK4蛋白具有生物学活性,为大规模制备有活性的NK4及深入研究其相关功能奠定了基础。 展开更多
关键词 nk4 原核表达 纯化 活性测定
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肝细胞生长因子拮抗剂NK4对裸鼠体内人宫颈癌种植瘤生长的影响 被引量：2
12
作者 王冬冬 王晓黎 林蓓 《山东医药》 CAS 2012年第12期54-56,共3页
目的通过建立裸鼠皮下肿瘤生长模型,研究肝细胞生长因子(HGF)拮抗剂NK4在裸鼠体内对人宫颈癌细胞的生长抑制作用。方法 NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染至人宫颈癌细胞CaSki;应用Western blot检测NK4在细胞培养基中的分泌表达情况;检... 目的通过建立裸鼠皮下肿瘤生长模型,研究肝细胞生长因子(HGF)拮抗剂NK4在裸鼠体内对人宫颈癌细胞的生长抑制作用。方法 NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染至人宫颈癌细胞CaSki;应用Western blot检测NK4在细胞培养基中的分泌表达情况;检测3组肿瘤细胞(CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4)体外生长速度;种植3组肿瘤细胞至裸鼠皮下,比较其在裸鼠体内的生长速度。结果在CaSki/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照(CaSki和CaSki/LUC)细胞中无表达。3组肿瘤细胞体外生长曲线无统计学差异(P>0.05)。1周后CaSki/NK4细胞接种的肿瘤生长缓慢,CaSki和CaSki/LUC细胞接种的肿瘤生长迅速,两组比较P<0.05。结论本研究观察到在裸鼠体内NK4能抑制宫颈癌种植瘤的生长,因此NK4是一个潜在的治疗宫颈癌的新策略。 展开更多
关键词 nk4 子宫肿瘤 基因治疗
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含pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌的制备及其稳定性研究 被引量：1
13
作者 杨志华 哈小琴 +5 位作者 张尚弟 冯强生 薛荣利 杨淑娟 赵勇 杨迎桂 《解放军医药杂志》 CAS 2014年第7期33-38,共6页
目的制备含pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌TPIN并检测其稳定性。方法将pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒转进减毒沙门菌Ty21a感受态,制备成重组的减毒沙门菌菌株TPIN;将TPIN在含有氨苄西林(+)和氨苄西林(-)的LB培养板传代培养至第10代、20代... 目的制备含pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌TPIN并检测其稳定性。方法将pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒转进减毒沙门菌Ty21a感受态,制备成重组的减毒沙门菌菌株TPIN;将TPIN在含有氨苄西林(+)和氨苄西林(-)的LB培养板传代培养至第10代、20代、30代和40代时用灭菌的牙签分别挑取含有氨苄西林(+)和氨苄西林(-)LB培养基上的单克隆菌落,质粒提取、PCR扩增酶切鉴定;TPIN转染HepG2细胞后采用RT-PCR检测IL-2和NK4基因表达,ELISA法检测细胞培养上清IL-2和NK4蛋白。结果构建菌株经提取质粒、酶切、PCR扩增获得目的基因IL-2、NK4特异条带;在氨苄西林(+)和氨苄西林(-)LB培养板传代培养40代的TPIN菌株均可扩增并双酶切出目的基因IL-2及NK4;TPIN体外转染HepG2细胞后,IL-2及NK4表达水平均显著升高。结论重组携带IL-2/NK4双基因的减毒沙门菌菌株TPIN可稳定遗传,不受无选择性压力的影响而丢失质粒,且在体外IL-2、NK4基因及蛋白可以稳定高效表达。 展开更多
关键词 白细胞介素 2 nk4 沙门菌菌苗 疫苗 减毒 基因
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Ad-NK4增强人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞对硼替佐米化疗敏感性的作用 被引量：4
14
作者 阙文忠 陈君敏 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期1079-1085,共7页
目的:观察Ad-NK4能否增强RPMI 8226细胞对硼替佐米(BOR)的化疗敏感性。方法:细胞-基质粘附实验和RPMI 8226细胞-ECV 304细胞粘附实验检测Ad-NK4对RPMI 8226细胞粘附的影响;Western blot检测粘附和侵袭相关蛋白MMP2、MMP3、MMP7、VEGF表... 目的:观察Ad-NK4能否增强RPMI 8226细胞对硼替佐米(BOR)的化疗敏感性。方法:细胞-基质粘附实验和RPMI 8226细胞-ECV 304细胞粘附实验检测Ad-NK4对RPMI 8226细胞粘附的影响;Western blot检测粘附和侵袭相关蛋白MMP2、MMP3、MMP7、VEGF表达的变化;MTT法检测Ad-NK4对细胞增殖的影响;PI流式细胞术检测Ad-NK4对细胞凋亡的影响;Western Blot检测Cleaved caspase-3、BAX和BCL-2蛋白表达水平的变化。结果:两种细胞粘附实验均显示Ad-NK4可显著抑制RPMI 8226细胞粘附,且与Erk信号通路和JAK/STAT信号通路显著相关(P<0.05);Ad-NK4能明显降低RPMI 8226细胞MMP-2、MMP-3和VEGF蛋白的表达水平(P<0.05),但对M M P-7的蛋白表达水平无明显影响(P>0.05)。Ad-NK4和BOR联用的细胞抑制率和诱导凋亡比例均显著高于单用Ad-NK4或BOR。同样,Ad-NK4和BOR联用组Cleaved caspase-3和BAX蛋白水平均明显高于单独作用组,而BCL-2蛋白水平却相反,同时在联用组BAX/BCL-2比率增加。结论:通过活化Caspase-3和上调BAX/BCL-2比率的途径,Ad-NK4可增强BOR体外抗骨髓瘤RPM I 8226细胞作用。 展开更多
关键词 Ad-nk4 多发性骨髓瘤 RPMI 8226细胞 硼替佐米 细胞凋亡
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NK4基因联合奥沙利铂对人结肠癌细胞株HCT116凋亡和侵袭的影响 被引量：1
15
作者 杨柳婷 姜蓬垒 +3 位作者 祖丹丹 李美宁 张栋 常冰梅 《中国癌症防治杂志》 CAS 2017年第6期456-461,共6页
目的探讨NK4基因联合奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)在人结肠癌细胞HCT116凋亡和侵袭中的作用。方法构建NK4质粒表达载体,将NK4基因转染至HCT116细胞,采用流式细胞术分析NK4基因联合奥沙利铂对HCT116细胞凋亡的影响,Transwell小室法检测NK... 目的探讨NK4基因联合奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)在人结肠癌细胞HCT116凋亡和侵袭中的作用。方法构建NK4质粒表达载体,将NK4基因转染至HCT116细胞,采用流式细胞术分析NK4基因联合奥沙利铂对HCT116细胞凋亡的影响,Transwell小室法检测NK4基因联合奥沙利铂对该细胞侵袭的影响。采用金正均Q值法判断NK4基因联合奥沙利铂是否有协同作用;Western blot法检测不同药物作用下相关机制蛋白p-Akt的变化情况。结果在HCT116细胞中成功构建NK4质粒表达载体,NK4组m RNA表达水平高于阴性对照组(NC组)和空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。与NC组相比,NK4基因联合奥沙利铂促细胞凋亡作用最显著(16.55%vs 46.86%,P<0.05);抑制细胞侵袭能力最强(0.9%vs 77.4%,P<0.05);金正均Q值法结果显示NK4基因联合奥沙利铂具有协同相加作用(0.85≤Q<1.15),且细胞凋亡和侵袭相关蛋白p-Akt的表达在联合用药组中显著下调,亦显示协同作用(P<0.01)。结论 NK4基因协同奥沙利铂可能通过Akt相关信号通路诱导HCT116结肠癌细胞凋亡并抑制该细胞侵袭。 展开更多
关键词 结肠肿瘤 nk4 奥沙利铂 凋亡 侵袭
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NK4基因在人胰腺癌细胞中的表达及其对血管内皮生长的影响 被引量：1
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作者 赖人旭 袁世珍 刘启才 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期658-661,共4页
目的 :构建NK4基因真核表达载体并进行转染研究。方法 :对重组质粒pcDNA3/hNK4进行酶切 ,将目的基因NK4克隆到较强的真核表达载体pRC/CMV2中 ,应用脂质体将NK4基因转染到胰腺癌细胞株SW1990中 ,G4 18筛选获得稳定表达克隆 ,采用RT -PCR... 目的 :构建NK4基因真核表达载体并进行转染研究。方法 :对重组质粒pcDNA3/hNK4进行酶切 ,将目的基因NK4克隆到较强的真核表达载体pRC/CMV2中 ,应用脂质体将NK4基因转染到胰腺癌细胞株SW1990中 ,G4 18筛选获得稳定表达克隆 ,采用RT -PCR及Westernblot鉴定及筛选出高转录和高表达的细胞克隆。以MTT法检测转染重组质粒pRC/CMV2 -hNK4的细胞克隆表达产物对血管内皮细胞生长的影响。结果 :在转染NK4基因的SW1990细胞克隆中 ,RT -PCR能扩增出NK4mRNA预期的 4 5 3bp片段 ,但强弱不同 ,Westernblot显示均有约 5 0kD的NK4蛋白的表达。其上清可显著抑制血管内皮细胞的生长。结论 :重组质粒pRC/CMV2 -hNK4是一种高效真核表达载体 ,并且能够在SW1990细胞中高表达 ;NK4能够抑制血管内皮细胞的生长 ,提示其在肿瘤基因治疗中可能具有重要意义。 展开更多
关键词 胰腺癌 nk4基因 基因疗法 胰腺肿瘤 血管内皮 基因表达
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NK4基因转染对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学特性的影响 被引量：1
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作者 李松林 李霏 +1 位作者 刘新莉 尹元琴 《山西医科大学学报》 CAS 2013年第3期192-195,248,共5页
目的通过在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染携带有NK4基因的慢病毒载体,研究NK4对乳腺癌细胞的生物学特性影响及其作用机制。方法将NK4重组慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES-EGFP转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR... 目的通过在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染携带有NK4基因的慢病毒载体,研究NK4对乳腺癌细胞的生物学特性影响及其作用机制。方法将NK4重组慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES-EGFP转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹法(Western blot)检测转染细胞中NK4的基因和蛋白表达,检测在肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)存在的条件下磷酸化c-met受体(p-met)的表达。采用MTT、Transwell小室检测转染NK4基因对乳腺癌细胞的生长、侵袭的影响。结果转染NK4基因的乳腺癌细胞MDA-MB-231能够表达并分泌NK4,RT-PCR扩增出预期的453 bp片段,Western blot显示有50 kD的蛋白并且转染组与空载体组和对照组相比p-met的表达明显减弱。MTT结果显示转染NK4组细胞生长抑制率达(67±2.04)%,较其他两组抑制率高(P<0.01),Transwell结果显示转染NK4基因能够显著抑制由HGF诱导的乳腺癌细胞的侵袭(P<0.01)。结论 NK4通过竞争性抑制HGF诱导的乳腺癌细胞中c-met受体的磷酸化从而抑制了乳腺癌的生长、侵袭。 展开更多
关键词 nk4 乳腺癌 慢病毒载体
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肝细胞生长因子拮抗剂NK4对人舌鳞癌细胞株Tca-8113侵袭能力的影响 被引量：2
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作者 常红梅 李美宁 +2 位作者 张悦红 刘志贞 张栋 《实用医技杂志》 2008年第22期2890-2892,共3页
目的:研究不同浓度NK4因子对人舌鳞癌细胞株Tca-8113侵袭能力的影响。方法:采用基底膜侵袭实验观察不同浓度NK4因子对人舌鳞癌细胞株Tca-8113侵袭能力的影响。结果:在浓度为10μg/ml时,NK4因子对人舌鳞癌细胞株Tca-8113侵袭重组基底膜... 目的:研究不同浓度NK4因子对人舌鳞癌细胞株Tca-8113侵袭能力的影响。方法:采用基底膜侵袭实验观察不同浓度NK4因子对人舌鳞癌细胞株Tca-8113侵袭能力的影响。结果:在浓度为10μg/ml时,NK4因子对人舌鳞癌细胞株Tca-8113侵袭重组基底膜的抑制率为56.4%。结论:NK4因子具有抑制肿瘤细胞人舌鳞癌细胞株Tca-8113侵袭的能力。 展开更多
关键词 nk4 人舌鳞癌细胞 侵袭
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共表达人B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定 被引量：1
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作者 李敏雄 刘启才 +3 位作者 石慧 陈盛强 严小玲 陈德基 《现代临床医学生物工程学杂志》 2007年第2期105-108,共4页
目的构建能同时表达B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒载体，同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒，检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建以串联方式携带人B7-1和HGF／NK4基因的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1。Pme I线性化后与腺病毒载体... 目的构建能同时表达B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒载体，同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒，检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建以串联方式携带人B7-1和HGF／NK4基因的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1。Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd—NK4-B7—1。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒，应用病毒悬液感染人喉癌细胞株。用RT-PCR检测感染细胞中B7-1和NK4基因mRNA表达。结果酶切鉴定证实阳性pAdTrack—NK4-B7—1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF／NK4，同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达并逐渐增多、增强。制备的Ad—NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞，感染后可维持6d高水平的B7—1和NK4基因的表达，整体表达可持续2周。结论成功构建了同时表达B7．1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒，该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因，为进一步研究B7—1和NK4基因的功能及应用B7—1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材。 展开更多
关键词 腺病毒 B7—1基因 nk4基因 基因治疗
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