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白术多糖抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞损伤的作用研究
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作者 孙伟翔 朱平蔚 +7 位作者 刘涵月 吴慧娴 秦枫 张力 张乐 周末 吴植 朱善元 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第12期6031-6041,共11页
【目的】以非洲绿猴胚胎肾细胞(Marc-145)为模式细胞,研究白术多糖(Atractylodes macrocephala polysaccharides,AP)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染Marc-145细胞所致损伤的... 【目的】以非洲绿猴胚胎肾细胞(Marc-145)为模式细胞,研究白术多糖(Atractylodes macrocephala polysaccharides,AP)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染Marc-145细胞所致损伤的保护作用及其机制。【方法】取生长至80%~90%融合度的Marc-145细胞用不同稀释度(10^(-1)至10^(-10))的PRRSV感染,设空白对照组,继续培养后逐日记录各稀释度下产生细胞病变效应(CPE)孔数,待病变稳定后按Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。将Marc-145细胞以每孔不低于1×10^(6)/mL的密度接种于96孔细胞培养板中,用100 TICD 50的PRRSV分别感染细胞0、12、24、48及96 h,于各时间点用显微镜随机拍照,观察细胞形态。将Marc-145细胞分为对照组和不同浓度AP组(200、400、800、1600、3200和6400μg/mL),通过细胞毒性试验检测AP最适浓度范围;将Marc-145细胞分为对照组(Mock)、模型组(PRRSV)和给药组(不同浓度AP组(200、400、800μg/mL)及1μmol/mL利巴韦林组),采用以下3种给药方式评估AP对PRRSV感染的影响:①感染前给药:分别用AP和利巴韦林孵育给药组细胞24 h后,给药组和模型组同时感染PRRSV 24 h;②感染同时给药:给药组分别用AP、利巴韦林与PRRSV孵育细胞24 h,模型组同时单独感染PRRSV 24 h;③感染后给药:给药组和模型组细胞同时感染PRRSV 24 h后,给药组分别给予AP和利巴韦林孵育24 h,模型组同时给予2%FBS DMEM孵育24 h,以上各处理组中,对照组均以2%FBS DMEM孵育细胞24 h作为对照,待处理结束后,各组细胞均换用2%FBS DMEM再培养48 h后检测。以上试验感染滴度为100 TCID_(50),利用半数组织培养感染剂量(TCID_(50))法检测AP对于PRRSV感染不同阶段滴度的影响,实时荧光定量PCR检测AP对于PRRSV感染不同阶段PRRSV ORF 7基因相对表达量,利用比色法检测AP对于PRRSV感染不同阶段细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影响,Western blotting法检测PRRSV感染细胞不同阶段N蛋白和Nrf2/HO-1通路蛋白的表达。【结果】由PRRSV感染后24 h的CPE孔数,按照Reed-Muench法计算PRRSV的滴度为10^(-6.6)TCID_(50)/mL。与感染后0 h相比,PRRSV感染后24 h细胞出现聚集、团缩的现象,故该毒株最适感染细胞时间为24 h。AP孵育Marc-145细胞24 h时,与对照组相比,200~800μg/mL AP组细胞活力显著提高(P<0.05),后续选用200~800μg/mL AP孵育细胞24 h作为试验最适条件。与模型组相比,AP能显著降低PRRSV内吞、吸附阶段中的病毒TCID_(50)值、PRRSV ORF 7基因相对表达量、MDA含量和PRRSV N蛋白表达量(P<0.05),显著提高细胞SOD活力和GSH含量(P<0.05)并激活Nrf2/HO-1通路蛋白(P<0.05),但对于病毒胞内复制阶段中的上述指标无显著影响(P>0.05)。【结论】本试验结果表明,200~800μg/mL AP可通过激活Nrf2/HO-1通路抵抗PRRSV内吞、吸附阶段中对于细胞的氧化应激损伤作用。 展开更多
关键词 白术多糖 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) marc-145细胞 氧化应激
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Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立 被引量:15
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作者 冯磊 褚轩 +2 位作者 吴培培 王伟峰 侯继波 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第3期598-603,共6页
采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞... 采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 marc-145细胞 微载体 猪繁殖与呼吸综合征病毒 悬浮培养
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中药体外对Marc-145细胞的影响及抗PRRSV突变株的作用 被引量:4
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作者 曾强 黄良宗 +3 位作者 李丹 朱燕秋 谢海燕 顾万军 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期569-574,共6页
将板蓝根、甘草和鱼腥草3种单味中药各含量为100mg/mL的中药粗提物作连续倍比稀释后,采用CPE和MTT法将其在Marc-145细胞上进行最大安全质量浓度和对细胞增殖的影响试验,同时采用体外细胞培养的方法在Marc-145细胞上进行抗猪繁殖与呼吸... 将板蓝根、甘草和鱼腥草3种单味中药各含量为100mg/mL的中药粗提物作连续倍比稀释后,采用CPE和MTT法将其在Marc-145细胞上进行最大安全质量浓度和对细胞增殖的影响试验,同时采用体外细胞培养的方法在Marc-145细胞上进行抗猪繁殖与呼吸综合征病毒突变株(PRRSV PX株)作用试验。结果显示,3种中药粗提物最大安全作用质量浓度板蓝根和甘草均为3.125g/L、鱼腥草为1.563g/L;板蓝根、甘草、鱼腥草分别在3.125~0.049、3.125~0.195、1.563~0.391g/L时测得细胞D值大于细胞对照组,对细胞分裂增殖均有促进效果,最佳作用质量浓度均为1.563g/L;3种中药粗提物有不同程度的抗PRRSV PX株作用,板蓝根和甘草粗提物阻断、抑制PRRSV PX株感染及直接灭活PRRSV PX株效果最好的质量浓度;阻断为3.125、3.125g/L、抑制为1.563、0.391g/L:阻断、直接灭活为0.782、0.782g/L,鱼腥草粗提物在0.782g/L时阻断和抑制PRRSV PX株效果为好,但其对PRRSV PX株基本没有直接灭活作用。 展开更多
关键词 板蓝根 甘草 鱼腥草 marc-145细胞 PRRSV突变株
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猪生殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的病毒形态发生和细胞超微结构观察 被引量:4
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作者 汪铭书 程安春 +4 位作者 刘伍梅 周毅 郭宇飞 袁桂萍 陈孝跃 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期46-50,共5页
以猪生殖与呼吸综合征病毒四川分离株PRRSV-SC1株感染体外培养的Marc-145细胞为模型,通过透射电镜对PRRSV的病毒形态发生学和宿主细胞超微结构的动态变化规律进行研究。结果显示,病毒粒子呈球形,有囊膜,大小约45-65nm,内含直径约25-30n... 以猪生殖与呼吸综合征病毒四川分离株PRRSV-SC1株感染体外培养的Marc-145细胞为模型,通过透射电镜对PRRSV的病毒形态发生学和宿主细胞超微结构的动态变化规律进行研究。结果显示,病毒粒子呈球形,有囊膜,大小约45-65nm,内含直径约25-30nm的核衣壳。病毒感染细胞后以细胞内吞方式进入细胞,在胞浆内复制,装配好的病毒以出芽或细胞外分泌释放到细胞外。感染细胞超微结构变化主要表现为:细胞胞浆空泡增多,内质网扩张,线粒体增生、嵴肿胀、脱落,最后空泡化,细胞表面的微绒毛脱落,出现典型的细胞凋亡特征,并观察到凋亡小体,最后整个细胞裂解、破碎。 展开更多
关键词 猪生殖与呼吸综合征病毒 形态发生 marc-145细胞 超微结构
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Marc-145细胞培养条件摸索及其初步应用 被引量:7
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作者 兰海楠 张辉 +4 位作者 崔焕忠 杜东菊 孔金超 赵小丽 郑鑫 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第5期220-222,共3页
Marc-145细胞,上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(Ma-104细胞)克隆而得到,可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养,特别是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感,本试验主要研究Marc-145的适宜培养条件,以及PRRSV野毒株... Marc-145细胞,上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(Ma-104细胞)克隆而得到,可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养,特别是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感,本试验主要研究Marc-145的适宜培养条件,以及PRRSV野毒株在该细胞中的增殖。 展开更多
关键词 marc-145细胞 培养条件 猪繁殖与呼吸综合征病毒
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猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素6转录时相的影响 被引量:4
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作者 张彦桃 梁秀丽 +3 位作者 刘芳 李金磊 耿静微 魏战勇 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2011年第6期138-141,共4页
为了更好地了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145后引起的细胞炎性反应,特别是白细胞介素6(IL-6)的反应,以及探讨宿主与病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染Marc-145细胞后病毒DNA含量的变化和IL-6的分泌水平。结果表... 为了更好地了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145后引起的细胞炎性反应,特别是白细胞介素6(IL-6)的反应,以及探讨宿主与病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染Marc-145细胞后病毒DNA含量的变化和IL-6的分泌水平。结果表明,病毒感染后1 h就可以检测到病毒DNA,但病毒量相对较低,在感染48 h达到最高峰,为感染时的170倍左右。IL-6的表达量在感染后1 h、3 h、24 h显著增加,48 h下降至低于对照水平,说明猪细小病毒感染后可引起Marc-145细胞分泌IL-6的增加。 展开更多
关键词 marc-145细胞 白细胞介素6 猪细小病毒 转录时相
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Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建 被引量:3
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作者 曹宗喜 焦培荣 +3 位作者 林哲敏 于俊勇 吴欣伟 张桂红 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期28-31,共4页
猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和... 猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 marc-145细胞 CD163 克隆 表达载体
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猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的MARC-145细胞中外泌体的分离与鉴定 被引量:3
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作者 张亮 王帅帅 +5 位作者 陈忍霞 陶佳丽 范阔海 段马魁 扆妍妍 姜俊兵 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期1300-1305,共6页
旨在寻找有效方法,能够从PRRSV感染的MARC-145细胞中分离细胞产生的外泌体,并为探索外泌体在PRRSV感染细胞时的作用奠定基础。使用试剂盒提取MARC-145细胞产生的外泌体,利用电镜负染色法和Western blot技术对MARC-145细胞产生的外泌体... 旨在寻找有效方法,能够从PRRSV感染的MARC-145细胞中分离细胞产生的外泌体,并为探索外泌体在PRRSV感染细胞时的作用奠定基础。使用试剂盒提取MARC-145细胞产生的外泌体,利用电镜负染色法和Western blot技术对MARC-145细胞产生的外泌体进行鉴定;采用碘克沙醇速率区带离心分离MARC-145细胞产生的外泌体,并用Western blot技术检测外分泌体的分布区间。用PRRSV感染MARC-145细胞后,使用试剂盒对MARC-145细胞产生的外泌体进行初步分离后,采用免疫磁珠捕获技术进行进一步纯化,并使用Western blot进行验证。Western blot结果显示MARC-145细胞产生的外泌体存在特异性标记蛋白CD63、Tsg101和Alix,不存在外泌体非标记蛋白EEA1、GRP94和Cytochrome C;电镜负染色结果显示MARC-145细胞产生的外泌体尺寸大小处于30~100nm,符合外泌体特征。利用Western blot对碘克沙醇速率区带离心中收集到的样品进行分析,结果显示MARC-145细胞产生的外泌体分布于7.2%~18%碘克沙醇密度区间。Western blot结果显示免疫磁珠捕获法获得的对照组不存在外泌体标记蛋白Tsg-101。以上结果表明MARC-145细胞能够产生外泌体,并且通过免疫磁珠捕获法能够从PRRSV感染的MARC-145细胞中将其分离。 展开更多
关键词 marc-145细胞 外泌体 PRRSV粒子 速率区带离心 免疫磁珠
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Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较 被引量:4
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作者 冯磊 吴培培 +2 位作者 褚轩 王伟峰 侯继波 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2012年第7期182-185,共4页
采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力。结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5%新... 采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力。结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5%新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长。然而在1%新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长。经过在该1%血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松。由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好。比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变。 展开更多
关键词 marc-145细胞 驯化培养 无血清培养 PRRSV
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Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响 被引量:3
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作者 赵孟孟 冯松林 +3 位作者 王文佳 邢星 冯嘉萍 张桂红 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第12期3114-3120,共7页
试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和W... 试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组(P<0.05),是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP 9 基因 marc-145 细胞 复制
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利用荧光定量PCR方法研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖规律 被引量:3
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作者 胡慧 高晓平 +5 位作者 孟韩冰 王亚宾 陈丽颖 张红英 辛银川 崔保安 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第21期22-25,共4页
为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞系上的增殖规律,利用实时荧光定量PCR技术,研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖情况。结果发现:病毒在接种后12h开始大量增殖,且在12-36h增殖最为迅速;还发现在18h时Marc-... 为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞系上的增殖规律,利用实时荧光定量PCR技术,研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖情况。结果发现:病毒在接种后12h开始大量增殖,且在12-36h增殖最为迅速;还发现在18h时Marc-145细胞开始释放病毒,48h达最高峰。该结果为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理及利用细胞毒生产疫苗提供了试验基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 荧光定量PCR marc-145细胞 增殖规律
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猪2′,5′寡腺苷酸合成酶OAS1a基因克隆与序列分析及其在Marc-145细胞上对PRRSV复制的影响 被引量:2
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作者 赵孟孟 张雅 +7 位作者 谢莎 陈静 夏爽飞 罗雪刚 刘迎琦 黄晓静 乔松林 张改平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期25-32,共8页
旨在探索猪2’,5’寡腺苷酸合成酶OASla对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRs)的复制是否有抑制作用,进而为探索抑制病毒复制寻求新的思路。从PAM猪肺泡巨噬细胞中克隆了猪2’,5‘寡腺苷酸合成酶OASln基因,将该基因克隆到真核表达载体pc... 旨在探索猪2’,5’寡腺苷酸合成酶OASla对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRs)的复制是否有抑制作用,进而为探索抑制病毒复制寻求新的思路。从PAM猪肺泡巨噬细胞中克隆了猪2’,5‘寡腺苷酸合成酶OASln基因,将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序与序列分析之后将该基因转染Marc-145细胞,然后接种PRRSV病毒,与对照组比较病毒的抑制效果。结果显示,病毒的滴度明显下降,病毒的RNA水平也明显下降,由此推断猪2’,5,寡腺苷酸合成酶OAS1a可以在Marc-145细胞上抑制PRRS的复制。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 2’ 5’寡腺苷酸合成酶OAS1a 序列分析 滴度 marc-145细胞
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兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒血清在Marc-145细胞上对病毒复制影响 被引量:1
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作者 赵孟孟 孙龙 +4 位作者 陈耀 张雅 张二芹 冯松林 张桂红 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期52-58,共7页
制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,探索其对病毒复制影响,通过大量培养猪繁殖与呼吸综合征病毒XH-GD株病毒,高速离心后蔗糖梯度纯化浓缩并免疫新西兰大白兔,4免后采集抗血清,ELISA法测定效价。同时将抗血清与病毒共同孵育接种Marc-... 制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,探索其对病毒复制影响,通过大量培养猪繁殖与呼吸综合征病毒XH-GD株病毒,高速离心后蔗糖梯度纯化浓缩并免疫新西兰大白兔,4免后采集抗血清,ELISA法测定效价。同时将抗血清与病毒共同孵育接种Marc-145细胞,荧光定量PCR和TCID50测定病毒复制情况。成功制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,效价达1640,抗血清可以在m RNA水平和TCID50上降低病毒滴度。结果表明,兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清可以在Marc-145细胞上抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 抗血清 marc-145细胞 复制 滴度
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猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素18转录时相的影响 被引量:1
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作者 党玉丽 哈斯通拉嘎 +4 位作者 耿静微 王瑞宁 郭东辉 胡清林 魏战勇 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期568-570,584,共4页
为了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起细胞炎性反应特别是白细胞介素18(IL-18)的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-18的分泌水平.结果表明... 为了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起细胞炎性反应特别是白细胞介素18(IL-18)的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-18的分泌水平.结果表明,IL-18的表达量在1 h无明显变化、在3,24 h增加,48 h轻微下调.表明猪细小病毒感染可引起Marc-145细胞分泌IL-18增加. 展开更多
关键词 猪细小病毒 marc-145细胞 白细胞介素18 转录时相
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eIF5A基因敲除MARC-145多克隆细胞系的建立及其对PRRSV增殖的影响 被引量:1
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作者 李华玮 王旭英 +4 位作者 井汇源 万博 乔宏兴 郭科威 侯文静 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期122-129,共8页
旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系,并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒,用重组慢病毒感染MAR... 旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系,并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒,用重组慢病毒感染MARC-145细胞,嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选,获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测,T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率,病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明:(1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响;(2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低,并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系;(3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上,本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克隆细胞系,体外敲除eIF5A显著抑制PRRSV增殖,这将为进一步探索eIF5A调控PRRSV复制的分子机制奠定基础。 展开更多
关键词 真核翻译起始因子5A PRRSV CRISPR/Cas9 marc-145细胞
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稳定表达猪SAMHD1蛋白的MARC-145细胞系构建与鉴定 被引量:1
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作者 杨莘 姜一峰 +5 位作者 虞凌雪 刘欢 周艳君 高飞 黄勤峰 童光志 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2017年第4期1-5,共5页
SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒... SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 SAMHD1 慢病毒系统 marc-145细胞
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Marc-145细胞无血清培养液组分的优化筛选 被引量:2
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作者 冯磊 吴培培 +2 位作者 褚轩 王伟峰 侯继波 《生物技术通讯》 CAS 2012年第6期790-799,共10页
目的:对Marc-145细胞无血清培养液组分及浓度进行优化筛选。方法:采用Plackett-Burman设计和中心组合旋转设计对不同的营养成分进行优化筛选。结果:经Plackett-Burman设计,利用20组实验对14种不同营养成分进行考察,发现孕酮、抗氧化试... 目的:对Marc-145细胞无血清培养液组分及浓度进行优化筛选。方法:采用Plackett-Burman设计和中心组合旋转设计对不同的营养成分进行优化筛选。结果:经Plackett-Burman设计,利用20组实验对14种不同营养成分进行考察,发现孕酮、抗氧化试剂、乙醇胺、维生素B6、维生素B12和脂肪酸复合剂对Marc-145细胞无血清悬浮生长的比生长速率有显著影响;针对该6种因素进行中心组合旋转实验设计,利用53组实验筛选出它们的最优使用浓度分别为孕酮5.5 mg/L、抗氧化试剂250μL/L、乙醇胺2.1 mL/L、维生素B122.86 mg/L、维生素B644μg/L和脂肪酸复合剂215μL/L。结论:经2种实验设计方法优化,确定了Marc-145细胞无血清培养液组分及最适浓度,为无血清悬浮培养Marc-145细胞及增殖猪繁殖及呼吸综合征病毒提供了实验基础。 展开更多
关键词 marc-145细胞 PLACKETT-BURMAN设计 中心组合旋转设计 悬浮培养 无血清培养液
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PKR基因表达高效阻断Marc-145细胞系建立及其对PRRSV增殖的影响 被引量:1
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作者 肖跃强 杨慧 +5 位作者 于雪 王文秀 孙培姣 魏凤 唐娜 沈志强 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1535-1540,共6页
研究猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)在Marc-145细胞蛋白激酶R(interferon-induced,double-stranded RNA-activated kinase,PKR)下调表达状态下的感染特性。以Macr-145细胞PKR基因序列设计... 研究猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)在Marc-145细胞蛋白激酶R(interferon-induced,double-stranded RNA-activated kinase,PKR)下调表达状态下的感染特性。以Macr-145细胞PKR基因序列设计3个shRNA,并设阳性对照,合成后插入pSilencer^(TM)2.1-U6载体构建重组质粒,与Macr-145细胞PKR+EGFP标签融合表达的重组质粒共转染HEK293细胞,以筛选能下调表达PKR的shRNA,并将该shRNA重组质粒转染Marc-145细胞,潮霉素B抗性筛选并克隆纯化获得PKR下调表达的细胞系,感染重组病毒PRRSV XZ06a-EGFP,通过检测病毒结构蛋白M与EGFP表达、观察细胞病变等,研究此状态下感染特性。结果显示筛选获得致使PKR下调表达的shRNA,以及稳定表达shRNA、PKR表达降低90%以上的Marc-145细胞系,重组病毒感染后48h,M蛋白与EGFP表达均受到抑制,且与对照相比,感染后72~96 h,未观察到典型的细胞病变效应,说明在PKR表达受到抑制时,病毒增殖受到明显抑制。本研究通过建立PKR下调表达细胞系与PRRSV感染试验,初步阐明PKR在PRRSV增殖时所发挥的作用,为进一步开展PRRSV与细胞抗病毒固有免疫互作机制研究莫定了基础。 展开更多
关键词 marc-145细胞 PKR下调表达shRNA PRRSV
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猪繁殖与呼吸综合征病毒SDZP株与其Marc-145细胞传代株的基因变异分析 被引量:1
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作者 唐娜 张倩 +7 位作者 王金良 魏凤 董林 毕妍丽 于新友 谢金文 肖跃强 沈志强 《动物医学进展》 北大核心 2019年第9期7-12,共6页
为了研究PRRSV病毒在Marc-145细胞中长期传代后的基因变异特点,将高致病性PRRSV野毒株SDZP株感染Marc-145细胞,经连续传代120代获得了较为稳定的SDZP-p120传代毒株。通过RT-PCR分段扩增出SDZP亲本株与SDZP-p120株的全长基因,测序分析病... 为了研究PRRSV病毒在Marc-145细胞中长期传代后的基因变异特点,将高致病性PRRSV野毒株SDZP株感染Marc-145细胞,经连续传代120代获得了较为稳定的SDZP-p120传代毒株。通过RT-PCR分段扩增出SDZP亲本株与SDZP-p120株的全长基因,测序分析病毒传代过程中各基因的特征性变化。在传代过程中,病毒增殖速度出现了从慢到快的过程。连续传代后,SDZP-p120株出现了76个碱基的突变,涵盖了绝大部分功能基因,其中出现42个非同义突变,25个位于非结构蛋白,17个位于结构蛋白。囊膜相关结构蛋白的氨基酸突变率明显高于非结构蛋白,且多个囊膜相关结构蛋白的氨基酸突变规律与HuN4、JXA1等其他在Marc-145细胞上传代致弱的毒株具有相似性。研究结果为深入了解病毒与宿主细胞间的相互作用提供了参考数据。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 marc-145细胞 感染性 遗传变异
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猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的长链非编码RNA和mRNA转录组分析 被引量:2
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作者 张小霞 杨艳青 +3 位作者 王秋云 杜俊阳 曹瀚文 梁振普 《河南农业科学》 北大核心 2023年第4期127-136,共10页
为了挖掘猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞后宿主细胞长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA表达谱的变化,对PRRSV感染Marc-145细胞的lncRNA和mRNA进行转录组测序和分析。生物信息学分析结果显示,PRRSV感染后Marc-145细胞有39个差... 为了挖掘猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞后宿主细胞长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA表达谱的变化,对PRRSV感染Marc-145细胞的lncRNA和mRNA进行转录组测序和分析。生物信息学分析结果显示,PRRSV感染后Marc-145细胞有39个差异表达lncRNA(DElncRNA)和1320个差异表达mRNA(DEG)。进一步的富集分析结果显示,这些DElncRNA和DEG主要富集在氧化磷酸化信号通路。DElncRNA和DEG的联合分析结果显示,与lncRNA共表达的mRNA主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、神经营养素信号通路、AMPK信号通路、HIF-1信号通路、内质网中的蛋白质加工和碳代谢相关的信号通路,这些通路主要与宿主免疫有关。综上,PRRSV感染导致Marc-145细胞的lncRNA和mRNA表达谱均发生了改变,经生物信息学分析,推测差异表达产物可能在宿主对PRRSV感染的先天免疫反应中发挥重要作用。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 长链非编码RNA MRNA marc-145细胞 转录组
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