目的探讨SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法快速检测常见超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因的可行性。方法选取经测序验证携带有tem、shv、ctx-m-1组、ctx-m-9组耐药基因的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作为阳性菌株,建...目的探讨SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法快速检测常见超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因的可行性。方法选取经测序验证携带有tem、shv、ctx-m-1组、ctx-m-9组耐药基因的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作为阳性菌株,建立细菌耐药基因SYBR Green I实时荧光定量多重PCR检测体系,这四种耐药基因的扩增产物片段长度和融解温度(Tm值)都不同,可通过结合融解曲线分析加以区别。用此体系检测110株大肠埃希菌和94株肺炎克雷伯菌,根据特异性Tm值的有无和差别判断是否携带有耐药基因及携带耐药基因型别,结果与耐药表型、琼脂糖电泳、测序结果对照。结果经SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析,分别有47株(42.7%)大肠埃希菌和34株(36.2%)肺炎克雷伯菌携带有这四种常见的ESBLs耐药基因,与表型确证实验和电泳结果比较达到100%的一致性;根据Tm值的不同,对耐药基因进行鉴别,携带单个耐药基因菌株的检测与电泳结果和测序结果比较达到100%的一致性;对携带多个耐药基因菌株的检测不能达到较好的分辨性。结论SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法可以快速筛查常见超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因,对携带单个耐药基因的细菌的基因型能进行准确鉴定。这对指导临床医生合理使用抗生素进行临床治疗和对耐药细菌的流行病学监测具有重要价值。展开更多
为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombina...为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。展开更多
A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4....A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4.41×10^(8)~4.41×10^(2) copies/μL质粒标准品的扩增Ct值与拷贝数浓度呈良好的线性关系,熔解曲线为单峰;与其他引起牛腹泻的常见病原无交叉反应,最低检测限为4.41×10^(1) copies/μL,批内、批间重复性试验Ct值变异系数均低于1%;对临床粪便样品的阳性检出率高于地方标准中的PCR方法,且检测结果符合性较好。综上,本研究建立的BRV-A SYBR Green I RT-qPCR检测方法灵敏、特异、稳定,且操作简单、成本低,为临床样品的大规模BRV-A检测及其感染的早期诊断提供了技术支撑。展开更多
文摘目的探讨SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法快速检测常见超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因的可行性。方法选取经测序验证携带有tem、shv、ctx-m-1组、ctx-m-9组耐药基因的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作为阳性菌株,建立细菌耐药基因SYBR Green I实时荧光定量多重PCR检测体系,这四种耐药基因的扩增产物片段长度和融解温度(Tm值)都不同,可通过结合融解曲线分析加以区别。用此体系检测110株大肠埃希菌和94株肺炎克雷伯菌,根据特异性Tm值的有无和差别判断是否携带有耐药基因及携带耐药基因型别,结果与耐药表型、琼脂糖电泳、测序结果对照。结果经SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析,分别有47株(42.7%)大肠埃希菌和34株(36.2%)肺炎克雷伯菌携带有这四种常见的ESBLs耐药基因,与表型确证实验和电泳结果比较达到100%的一致性;根据Tm值的不同,对耐药基因进行鉴别,携带单个耐药基因菌株的检测与电泳结果和测序结果比较达到100%的一致性;对携带多个耐药基因菌株的检测不能达到较好的分辨性。结论SYBR Green I实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法可以快速筛查常见超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因,对携带单个耐药基因的细菌的基因型能进行准确鉴定。这对指导临床医生合理使用抗生素进行临床治疗和对耐药细菌的流行病学监测具有重要价值。
文摘为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。
文摘A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4.41×10^(8)~4.41×10^(2) copies/μL质粒标准品的扩增Ct值与拷贝数浓度呈良好的线性关系,熔解曲线为单峰;与其他引起牛腹泻的常见病原无交叉反应,最低检测限为4.41×10^(1) copies/μL,批内、批间重复性试验Ct值变异系数均低于1%;对临床粪便样品的阳性检出率高于地方标准中的PCR方法,且检测结果符合性较好。综上,本研究建立的BRV-A SYBR Green I RT-qPCR检测方法灵敏、特异、稳定,且操作简单、成本低,为临床样品的大规模BRV-A检测及其感染的早期诊断提供了技术支撑。
