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牛皮蝇HypoderminA基因在大肠杆菌中的表达 被引量:2
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作者 王文龙 哈斯阿古拉 +2 位作者 阮风雷 呼和巴特尔 赵云刚 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1394-1397,共4页
从牛皮蝇Ⅱ期幼虫中提取总RNA,进行RT-PCR扩增牛皮蝇Hypodermin A基因。将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达载体pET30-HA,转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导表达,得到表达量达到全菌蛋白35%以上的特异性蛋白。SDS-PAGE分析表明,表达... 从牛皮蝇Ⅱ期幼虫中提取总RNA,进行RT-PCR扩增牛皮蝇Hypodermin A基因。将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达载体pET30-HA,转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导表达,得到表达量达到全菌蛋白35%以上的特异性蛋白。SDS-PAGE分析表明,表达产物大部分以包涵体形式存在。Western-blot检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin A,具有较好的免疫活性。 展开更多
关键词 牛皮蝇 hypodermin A 原核表达 WESTERN-BLOT
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皮蝇Hypodermin C基因的克隆及重组表达载体的构建 被引量:1
2
作者 杨东英 罗建勋 +8 位作者 唐立刚 关贵全 马米玲 刘志杰 刘爱红 党志胜 王艳华 殷宏 欧阳五庆 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2003年第5期3-6,共4页
参照牛皮蝇HypoderminC(HC)基因的核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,以牛皮蝇总RNA为模板 ,用RT PCR扩增了牛皮蝇HC基因 ,将扩增基因进行克隆测序。测序结果表明 ,所获得基因与已知序列同源性达 99.4 5 %。同时 ,将该基因与表达载体 pGEX 4... 参照牛皮蝇HypoderminC(HC)基因的核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,以牛皮蝇总RNA为模板 ,用RT PCR扩增了牛皮蝇HC基因 ,将扩增基因进行克隆测序。测序结果表明 ,所获得基因与已知序列同源性达 99.4 5 %。同时 ,将该基因与表达载体 pGEX 4T 1连接 ,构建并获得阳性重组表达载体。 展开更多
关键词 皮蝇 hypoderminC基因 基因克隆 表达载体 牛皮 蝇蛆病
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皮蝇Hypodermin A基因的克隆及表达质粒构建 被引量:3
3
作者 唐立刚 杨东英 +2 位作者 罗建勋 欧阳五庆 殷宏 《动物科学与动物医学》 2004年第1期22-23,19,共3页
参照牛皮蝇HypoderminA(HA)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇HA基因,将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%和99.3%。... 参照牛皮蝇HypoderminA(HA)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇HA基因,将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。 展开更多
关键词 牛皮蝇 hypodermin A基因 基因克隆 基因表达 皮蝇蛆病 基因工程疫苗
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纹皮蝇Hypodermin B基因在大肠杆菌中的表达
4
作者 王文龙 哈斯阿古拉 +3 位作者 阮风雷 呼和巴特尔 张海龙 侯振宇 《内蒙古大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期683-688,共6页
从纹皮蝇期幼虫中提取总RNA,RT-PCR扩增纹皮蝇Hypodermin B(HB)基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达载体pET30-HB,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达后,得到表达量达全菌蛋白30%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明表达产物主... 从纹皮蝇期幼虫中提取总RNA,RT-PCR扩增纹皮蝇Hypodermin B(HB)基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达载体pET30-HB,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达后,得到表达量达全菌蛋白30%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明表达产物主要以包涵体形式存在.Western blotting检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin B,具有较好的反应原性. 展开更多
关键词 纹皮蝇 hypodermin B 原核表达 WESTERN BLOTTING
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纹皮蝇Hypodermin C基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立
5
作者 王文龙 刘春霞 +1 位作者 阮风雷 呼和巴特尔 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期877-881,共5页
为建立牛皮蝇蛆病的抗体检测方法,本研究从纹皮蝇Ⅰ期幼虫中提取总RNA,采用RT-PCR扩增了Hypodermin C(HC)基因。将该基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中进行原核表达。获得了31 ku以包涵体形式表达的重组HC蛋白。Western blot结果... 为建立牛皮蝇蛆病的抗体检测方法,本研究从纹皮蝇Ⅰ期幼虫中提取总RNA,采用RT-PCR扩增了Hypodermin C(HC)基因。将该基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中进行原核表达。获得了31 ku以包涵体形式表达的重组HC蛋白。Western blot结果表明表达产物能够与阳性牛血清IgG特异性结合,具有良好的抗原活性。以纯化的重组HC作为包被抗原建立了牛皮蝇蛆病间接ELISA诊断方法,实验确定抗原最佳包被浓度为15.63μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,阳性标准判定为待检血清OD值>0.256。所建立的诊断方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性。应用该检测方法对230份临床血清进行检测,阳性率为20.6%。研究结果表明该间接ELISA方法是一种有效的牛皮蝇蛆病血清学检测方法。 展开更多
关键词 纹皮蝇 hypodermin C 原核表达 间接ELISA
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HypoderminC基因DNA疫苗的构建及其免疫原性试验
6
作者 刘春霞 白红岩 +2 位作者 娜仁高娃 呼和巴特尔 王文龙 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2013年第1期13-15,共3页
本试验以Hypodermin C(HC)基因原核表达载体pETHC为模板,PCR扩增HC基因,克隆测序后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了DNA疫苗pcDNA-HC。pcDNA-HC体外转染小鼠胎儿成纤维细胞后,间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表... 本试验以Hypodermin C(HC)基因原核表达载体pETHC为模板,PCR扩增HC基因,克隆测序后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了DNA疫苗pcDNA-HC。pcDNA-HC体外转染小鼠胎儿成纤维细胞后,间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达。以DNA疫苗pcDNA-HC免疫小鼠,对小鼠进行体液免疫水平检测。结果表明,所构建的DNA疫苗能转染到小鼠胎儿成纤维细胞中并正确表达,免疫小鼠血清IgG滴度随免疫次数的增加而升高。 展开更多
关键词 牛皮蝇蛆病 hypoderminC DNA疫苗
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纹皮蝇HypoderminC基因真核表达质粒构建及小鼠免疫试验
7
作者 白红岩 刘春霞 +1 位作者 呼和巴特尔 王文龙 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第8期1-5,共5页
根据GenBank发表的Hypodermin C(HC)基因序列设计引物,以原核表达载体pET-HC为模板,PCR扩增HC基因,将克隆基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-HC。将重组质粒pVAX1-HC转染小鼠胎儿成纤维细胞,以间接免疫荧光法检... 根据GenBank发表的Hypodermin C(HC)基因序列设计引物,以原核表达载体pET-HC为模板,PCR扩增HC基因,将克隆基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-HC。将重组质粒pVAX1-HC转染小鼠胎儿成纤维细胞,以间接免疫荧光法检测HC基因在细胞中表达。用真核表达质粒pVAX1-HC经双侧胫前肌注射昆明小鼠,对小鼠进行体液免疫和细胞免疫研究。结果表明,小鼠血清抗体水平和淋巴细胞增殖水平明显高于非免疫对照组。本研究成功构建了真核表达质粒pVAX1-HC,为纹皮蝇核酸疫苗研发奠定了基础。 展开更多
关键词 纹皮蝇 hypodermin C基因 真核表达质粒 免疫 小鼠
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皮蝇素A基因的克隆与序列分析
8
作者 王艳华 殷宏 +2 位作者 罗建勋 蒋锡仕 张德林 《畜牧兽医杂志》 2007年第6期1-3,共3页
首先提取采自甘肃玛曲的皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出Hypodermin A(HA)基因片段,将此片段与PGEM-T Easy载体连接,构建克隆载体PGEM-HA,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,进行测序与分析。结果表明... 首先提取采自甘肃玛曲的皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出Hypodermin A(HA)基因片段,将此片段与PGEM-T Easy载体连接,构建克隆载体PGEM-HA,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,进行测序与分析。结果表明,扩增的HA基因长678bp,编码229氨基酸。克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登陆的皮蝇HA基因序列核甘酸同源性为96.6%,推导氨基酸同源性达97.8%。该基因的成功克隆为其进一步表达打下了坚实的基础。 展开更多
关键词 皮蝇 hypodermin A基因 克隆 序列分析
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牛皮蝇幼虫抗原基因原核表达条件的优化 被引量:9
9
作者 娜仁高娃 呼和巴特尔 王文龙 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第3期32-36,共5页
分别对构建的3种牛皮蝇幼虫抗原(Hypodermin A,B,C)基因重组表达菌BL21(pETHA)、BL21(pETHB)、BL21(pETHC)在不同的诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度等条件下的表达情况进行了研究。结果表明,重组表达菌BL21(pETHA)、BL21(pETHB)、BL21(p... 分别对构建的3种牛皮蝇幼虫抗原(Hypodermin A,B,C)基因重组表达菌BL21(pETHA)、BL21(pETHB)、BL21(pETHC)在不同的诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度等条件下的表达情况进行了研究。结果表明,重组表达菌BL21(pETHA)、BL21(pETHB)、BL21(pETHC)最佳诱导时间均为4 h,最佳诱导剂浓度均为0.05 mmol/L,最佳诱导温度分别为37、37、30℃。研究结果为进一步获得大量重组抗原用于牛皮蝇蛆病的血清学诊断和免疫防控研究提供了依据。 展开更多
关键词 牛皮蝇蛆病 牛皮蝇幼虫抗原 原核表达 表达条件优化
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毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白 被引量:4
10
作者 孙怡 徐梅倩 +1 位作者 高兴春 何国声 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期296-299,共4页
建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A(Hypodermotin A,HA)的技术,并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上,构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G... 建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A(Hypodermotin A,HA)的技术,并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上,构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0.5%甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白,培养3d后收取上清,用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western—blotting表明,该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示,该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明,甲醇浓度在0.5%~1%、溶氧量在70%以上、诱导2~3d的情况下表达产量最高,达1500mg/L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆痛疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。 展开更多
关键词 皮蝇素A 毕赤酵母GS115 表达 优化 质粒pPIC9k
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牛皮蝇HA抗原基因转化紫花苜蓿的研究 被引量:2
11
作者 王红梅 朱艳 陈玉梁 《草业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1936-1940,共5页
以"甘农1号"紫花苜蓿(Medicago sativa)7d苗龄子叶和下胚轴为受体材料,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系,筛选出MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L和MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.03mg/L+GA32.0mg/L为苜蓿子叶愈伤组织诱导和分... 以"甘农1号"紫花苜蓿(Medicago sativa)7d苗龄子叶和下胚轴为受体材料,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系,筛选出MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L和MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.03mg/L+GA32.0mg/L为苜蓿子叶愈伤组织诱导和分化的适宜培养基;探讨了农杆菌浓度OD600约0.5、感染时间8~10min、共培养时间2d为适宜的转化条件。采用农杆菌介导法将Hyperdomin A(HA)基因导入紫花苜蓿,经PCR检测和Southern分子杂交分析,结果表明HA基因已经整合到苜蓿基因组中,可为牛皮蝇蛆病可食性疫苗的研究提供理论基础。 展开更多
关键词 紫花苜蓿 植株再生 HA基因 转化 分子鉴定
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皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建 被引量:2
12
作者 王艳华 殷宏 +1 位作者 罗建勋 蒋锡仕 《动物医学进展》 CSCD 2007年第9期15-18,共4页
提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用XhoⅠ、XbaⅠ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPICZa连接并转化,... 提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用XhoⅠ、XbaⅠ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确。 展开更多
关键词 皮蝇素A 克隆 毕赤酵母表达载体
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重组牛皮蝇素A蛋白的免疫试验 被引量:4
13
作者 孙怡 何国声 +4 位作者 徐梅倩 曹杰 朱顺海 黄燕 高兴春 《中国兽医寄生虫病》 2006年第2期1-5,共5页
用由毕赤酵母表达的皮蝇素A(Hypderm in A,HA)蛋白分别免疫新西兰大白兔和牦牛,了解该蛋白免疫效果。用两种不同分子量的重组HA蛋白分别免疫新西兰大白兔1次和2次,ELISA测其抗体消长规律。结果表明,3周后抗体水平达到峰值,后缓慢下降。5... 用由毕赤酵母表达的皮蝇素A(Hypderm in A,HA)蛋白分别免疫新西兰大白兔和牦牛,了解该蛋白免疫效果。用两种不同分子量的重组HA蛋白分别免疫新西兰大白兔1次和2次,ELISA测其抗体消长规律。结果表明,3周后抗体水平达到峰值,后缓慢下降。50KD蛋白免疫效果较30KD蛋白好,差异非常显著(P<0.01)。用其中50KD的重组HA蛋白分别在7月和9月免疫自然感染牛皮蝇蛆病牦牛,观察感染率和感染强度,ELISA测其抗体消长规律。结果表明,7月免疫组与9月免疫组感染率分别为83.3%和36.3%(对照组为55.5%);平均感染强度分别为6.5和4.2(对照组为13.0),差异不显著(P>0.05)。免疫后,抗体水平上升,3个月后缓慢下降。9月免疫组免疫效果较7月免疫组好,三组抗体水平差异非常显著(P<0.01)。上述研究结果为防治牛皮蝇蛆病疫苗的深入研究和实践运用提供了参考依据。 展开更多
关键词 皮蝇素A 毕赤酵母 免疫试验 抗体消长规律
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牛皮蝇Hypoderm in B基因的克隆及原核表达载体构建 被引量:1
14
作者 唐立刚 杨东英 +2 位作者 殷宏 罗建勋 欧阳五庆 《黄牛杂志》 2004年第2期4-6,共3页
参照牛皮蝇HypoderminB(HB)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以牛皮蝇总RNA为模板利用RT-PCR扩增牛皮蝇HB基因,并对扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,克隆的牛皮蝇HA基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.2%... 参照牛皮蝇HypoderminB(HB)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以牛皮蝇总RNA为模板利用RT-PCR扩增牛皮蝇HB基因,并对扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,克隆的牛皮蝇HA基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与原核表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。 展开更多
关键词 牛皮蝇 皮蝇蛆病 HB基因 基因克隆 原核表达载体 基因工程疫苗
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皮蝇素C蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化
15
作者 高兴春 徐梅倩 何国声 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期552-556,共5页
利用PCR技术从重组质粒pGEM-T/HC中扩增HCcDNA片段,克隆到pPIC9k毕赤酵母表达载体中,获得重组质粒pPIC9k-HC,重组质粒线性化后电激转化入毕赤酵母GS115菌株中,重组子经G418筛选、PCR鉴定得到含外源基因的重组子,然后在含0.5%甲醇的培养... 利用PCR技术从重组质粒pGEM-T/HC中扩增HCcDNA片段,克隆到pPIC9k毕赤酵母表达载体中,获得重组质粒pPIC9k-HC,重组质粒线性化后电激转化入毕赤酵母GS115菌株中,重组子经G418筛选、PCR鉴定得到含外源基因的重组子,然后在含0.5%甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白,经SDS-PAGE检测发现表达蛋白质的相对分子量约为28kD,表达量约为121mg/L,表达上清经超滤浓缩和阴离子交换层析初步纯化,所得纯化产物经Western-blot表明具有与兔抗HC血清特异性结合的能力;明胶电泳检测显示具有水解酶活性,为今后进行大规模的牛皮蝇蛆病的调查提供了一种生产大量廉价抗原的方法。 展开更多
关键词 HC 毕赤酵母 表达纯化
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