NtSKP1-GFP植物表达载体的构建及亚细胞定位 被引量：17

1

作者 张付云 陈士云 +2 位作者 赵小明 白雪芳 杜昱光 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期144-148,共5页

用PCR技术扩增NtSKP1基因的编码区,定向克隆至表达载体pCAMBIA1302上构建用于瞬时表达NtSKP1蛋白的重组质粒。重组质粒经PCR和测序鉴定后用冻融法转入农杆菌LBA4404,进而经农杆菌LBA4404介导转入烟草悬浮细胞,激光共聚焦显微镜观察确定... 用PCR技术扩增NtSKP1基因的编码区,定向克隆至表达载体pCAMBIA1302上构建用于瞬时表达NtSKP1蛋白的重组质粒。重组质粒经PCR和测序鉴定后用冻融法转入农杆菌LBA4404,进而经农杆菌LBA4404介导转入烟草悬浮细胞,激光共聚焦显微镜观察确定其亚细胞定位。测序结果表明,插入片段与预期序列完全一致,与载体形成了一个完整的基因表达盒;亚细胞定位结果表明NtSKP1蛋白在胞浆和核部位均有分布。 展开更多

关键词 NtSKP1基因 植物表达载体 亚细胞定位

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两种杆状病毒的限制性消化和p10基因的定位 被引量：3

2

作者 黄永秀 齐义鹏 +1 位作者 李凌云 金天全 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 1994年第3期191-197,共7页

以5和6种限制性内切酶分别消化昆虫杆状病毒SeNPV和LsNPV DNA,求出它们的基因组平均长133kb和164kb.为了定位这两种杆状病毒的p10基因,构建了含有AcNPVp10基因序列的两个探针载体pAcHP106和pAcEP102.从探针载体回收0.18kb和0.42kb的AcNP... 以5和6种限制性内切酶分别消化昆虫杆状病毒SeNPV和LsNPV DNA,求出它们的基因组平均长133kb和164kb.为了定位这两种杆状病毒的p10基因,构建了含有AcNPVp10基因序列的两个探针载体pAcHP106和pAcEP102.从探针载体回收0.18kb和0.42kb的AcNPV p10基因序列,制备探针,与SeNPV和LsNPV的酶切片段杂交,得到清晰的杂交图谱,准确的定位了这两种病毒的p10基因. 展开更多

关键词 杆状病毒 P10 基因 基因定位

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粗毛栓菌(Trametes gallic)基因启动子的分离与鉴定 被引量：5

3

作者 胡敏珊 张义正 曾凡亚 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期340-344,共5页

粗毛栓菌 (Trametesgallic)总DNA经Sau3AI酶切后插入到启动子探针型载体pSUPV8的BamHI位点 ,在含氨苄青霉素与潮霉素双抗平板上筛选到 8个潮霉素抗性(Hygr)重组子 (命名为 pTP1～ 8) ,其插入片段大小为 0 .5～ 1.7kb ,抗性水平为 0 .15&... 粗毛栓菌 (Trametesgallic)总DNA经Sau3AI酶切后插入到启动子探针型载体pSUPV8的BamHI位点 ,在含氨苄青霉素与潮霉素双抗平板上筛选到 8个潮霉素抗性(Hygr)重组子 (命名为 pTP1～ 8) ,其插入片段大小为 0 .5～ 1.7kb ,抗性水平为 0 .15× 10 - 3 ～0 .35× 10 - 3 g/mL .对 pTP6进行酶切分析表明 ,插入片段中含有KpnI ,XbaI和SacI位点各一个 ,用限制酶SacI和XbaI去掉其 5’端 0 .7kb和 1.2kb片段后 ,其潮霉素抗性由 0 .2 5×10 - 3 g/mL均降为 0 .15× 10 - 3 g/mL .将TP5片段与粗毛栓菌总DNA进行Southern杂交 ,结果证明 ,TP5片段来源于粗毛栓菌总DNA .对片段TP5的 3’端进行序列分析 。 展开更多

关键词 粗毛栓菌 基因启动子 Hyg^r基因 启动子探针型载体 基因分基 基因表达 潮霉素抗性 序列分析

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黄孢原毛平革菌基因启动子的分离与鉴定 被引量：8

4

作者 李维 张义正 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第5期599-602,共4页

利用启动子探针型载体 pSUPV8直接在大肠杆菌 (Escherichiacoli)中分离黄孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)基因启动子片段 ,获得 6个潮霉素抗性 (Hygr)重组子。对重组子CH2、CH6进行序列分析 ,结果发现它们都存在真核生物基... 利用启动子探针型载体 pSUPV8直接在大肠杆菌 (Escherichiacoli)中分离黄孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)基因启动子片段 ,获得 6个潮霉素抗性 (Hygr)重组子。对重组子CH2、CH6进行序列分析 ,结果发现它们都存在真核生物基因启动子的保守序列 ;用原生质体转化法将其转化黄孢原毛平革菌 ,仅 pCH6获得了潮霉素抗性转化子 ;PCR和斑点杂交分析表明 ,pCH6已成功导入黄孢原毛平革菌 ,并启动潮霉素抗性基因的表达。 展开更多

关键词 黄孢原毛平革菌 启动子 分离 鉴定 基因表达

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鸟枪法筛选枯草芽孢杆菌基因强启动子及对黄牛GHRL基因的表达 被引量：4

5

作者 张爱玲 张丽 +2 位作者 杨明明 张良志 陈宏 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期92-96,共5页

利用鸟枪法通过大肠埃希菌-枯草芽孢杆菌启动子探针载体分离到枯草芽孢杆菌168菌株的103个基因启动子片段,发现1个672 bp的启动子片段P3.4.23,能够在大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌高效启动报告基因β-半乳糖苷酶的表达,其酶活性分别达到3 41... 利用鸟枪法通过大肠埃希菌-枯草芽孢杆菌启动子探针载体分离到枯草芽孢杆菌168菌株的103个基因启动子片段,发现1个672 bp的启动子片段P3.4.23,能够在大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌高效启动报告基因β-半乳糖苷酶的表达,其酶活性分别达到3 418、2 877 U/mL.相似性分析表明P3.4.23启动子片段具有枯草芽孢杆菌基因启动子的保守序列,并确定其转录活性区域位于5～333 bp,为yxiE基因的调控序列.将黄牛GHRL基因导入到启动子亚克隆序列下游,使该基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达. 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 大肠埃希菌 启动子探针载体 GHRL基因 牛 鸟枪法

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乳酸菌启动子探针载体的构建及其功能验证 被引量：4

6

作者 张维 姚璐 +2 位作者 张世湘 罗云波 郝彦玲 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2010年第11期4-6,29,共4页

以β-葡萄糖醛酸酶基因gusA作为报告基因,在乳酸菌表达载体pMG36e基础上,利用平滑化技术删除表达载体自带启动子P32,构建了乳酸菌启动子探针载体pMGPP。将已知的嗜酸乳杆菌S-layer蛋白基因启动子slpA插入到pMGPP无启动子的gusA基因上游... 以β-葡萄糖醛酸酶基因gusA作为报告基因,在乳酸菌表达载体pMG36e基础上,利用平滑化技术删除表达载体自带启动子P32,构建了乳酸菌启动子探针载体pMGPP。将已知的嗜酸乳杆菌S-layer蛋白基因启动子slpA插入到pMGPP无启动子的gusA基因上游验证其功能,GUS染色结果表明:pMGPP在大肠杆菌KW1和植物乳杆菌WQ0815中皆具有启动子探针载体的功能。因此,具有自主知识产权的启动子探针载体pMGPP的构建不仅为筛选乳酸菌启动子提供了有效的工具,同时为高效乳酸菌表达载体的构建奠定基础。 展开更多

关键词 乳酸菌 启动子探针载体 报告基因gusA 功能验证

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诸葛菜基因启动子的分离 被引量：3

7

作者 梁明山 陶震 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 1997年第3期1-5,共5页

利用启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ２首次从诸葛菜总ＤＮＡ中克隆了７个具有启动功能的ＤＮＡ片段。转化Ｅ．ｃｏｌｉ表明最高卡那霉素（ｋｎａ）抗性为１４０μｇ／ｍｌ，最低为２０μｇ／ｍｌ。含启动子片段的７个重组质粒分别命名为ｐ... 利用启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ２首次从诸葛菜总ＤＮＡ中克隆了７个具有启动功能的ＤＮＡ片段。转化Ｅ．ｃｏｌｉ表明最高卡那霉素（ｋｎａ）抗性为１４０μｇ／ｍｌ，最低为２０μｇ／ｍｌ。含启动子片段的７个重组质粒分别命名为ｐＳＵＰＺ１－７。Ｓｏｕｔｈｒｅｎ印迹表明ｐＳＵＰＺ６对Ｋｎａ的抗性功能来源于诸葛菜的１０ｋｂ、５ｋｂ和３．９ｋｂ片段。 展开更多

关键词 油料 诸葛菜 基因启动子 pSUPV2 DNA重组

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以潮霉素B磷酸转移酶基因为遗传标记的启动子探针型载体的构建 被引量：4

8

作者 李维 张义正 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期736-740,共5页

用来自大肠杆菌的潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因（ｈｙｇｒ）作为遗传标记构建了启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ８，该基因的转录和翻译起始区以及５’－端编码区两个密码子均被除去，载体骨架为大肠杆菌质粒ｐＵＧＶ２。

关键词 启动子 探针型载体 潮霉素B 磷酸转移酶

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玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及其亚细胞定位 被引量：1

9

作者 张少方 王新涛 +4 位作者 吴连成 吴刘记 谢丽莉 郭书磊 陈彦惠 《玉米科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期12-16,共5页

以热带玉米自交系CML288为供试材料,根据拟南芥ELF4基因保守序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆了ELF4在玉米上同源基因的全长cDNA序列(GenBank上的登录号为HQ009862)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长683 bp,开放阅读框为432 bp,编码了... 以热带玉米自交系CML288为供试材料,根据拟南芥ELF4基因保守序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆了ELF4在玉米上同源基因的全长cDNA序列(GenBank上的登录号为HQ009862)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长683 bp,开放阅读框为432 bp,编码了144个氨基酸,与拟南芥、水稻的氨基酸序列同源性分别高达62%和75%,此外它们还共同包含一个高度保守的DUF1313未知功能结构域。利用基因重组技术分别构建了能够高效表达的过量表达载体pBI-ZmELF4和带有GFP标记的融合表达载体pGIT-ZmELF4-GFP,利用融合表达载体进行洋葱表皮瞬时表达实验,结果将ZmELF4定位于细胞核内,说明该基因在细胞核内起作用。 展开更多

关键词 玉米 ZmELF4基因 载体构建 亚细胞定位

原文传递

MIC3-EGFP融合蛋白真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达 被引量：1

10

作者 张琼 谭逵 +4 位作者 蒋立平 谢荣华 范久波 舒衡平 吴翔 《现代生物医学进展》 CAS 2008年第5期825-827,F0003,共4页

目的:构建以绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C2-MIC3并检测MIC3-EGFP融合蛋白其在COS-7细胞中的表达及定位。方法:通过基因重组的方法构建pEGFP-C2-MIC3重组真核表达质粒,并通过酶切和基因... 目的:构建以绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C2-MIC3并检测MIC3-EGFP融合蛋白其在COS-7细胞中的表达及定位。方法:通过基因重组的方法构建pEGFP-C2-MIC3重组真核表达质粒,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,转染后24h在活细胞状态下用倒置荧光显微镜直接观察MIC3-EGFP融合蛋白在COS-7细胞中的分布。结果:PCR检测,酶切鉴定及测序证实目的基因MIC3正确连接到pEGFP-C2的多克隆位点。pEGFP-C2-MIC3重组体转染COS-7后,在细胞质表达。结论:成功地构建了pEGFP-C2-MIC3融合蛋白真核表达质粒,在COS-7细胞中获得表达。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 MIC3 GFP表达载体 表达定位

暂未订购

海甘蓝基因启动子的分离和鉴定 被引量：2

11

作者 梁明山 曾宇 王幼平 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第1期1-6,共6页

海甘蓝总ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡⅠ部分酶切后，插入启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４的ＢａｍＨⅠ位点，转化大肠杆菌ＪＭ１０７，获得卡那霉素抗性重组质粒１３个，依次命名为ｐＲＰ１～ｐＲＰ１３。电泳分析表明它们均含有插入片段，大小为... 海甘蓝总ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡⅠ部分酶切后，插入启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４的ＢａｍＨⅠ位点，转化大肠杆菌ＪＭ１０７，获得卡那霉素抗性重组质粒１３个，依次命名为ｐＲＰ１～ｐＲＰ１３。电泳分析表明它们均含有插入片段，大小为０．５～１．８Ｋｂ。各基因启动子在大肠杆菌细胞中的启动效率采用卡那霉素抗性水平测定，最高者ｐＲＰ２达１８０μｇ／ｍｌ，选择ｐＲＰ２作进一步的分析和鉴定。以ｐＲＰ２插入片段为探针，与经ＢａｍＨⅠ，ＰｓｔⅠ酶切的海甘蓝总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证明该插入片段来源于海甘蓝基因组，推测其在基因组中很可能以单考贝形式存在，斑点杂交也证明其来源。选用海甘蓝无菌苗的子叶和下胚轴为起始材料，应用根癌农杆菌（ＬＢＡ４４０４）双元载体成功地建立了一种方法简单、速度快和频率高的遗传转化体系。将ｐＲＰ２重组质粒导入海甘蓝，在附加一定量的Ａｍｐ，Ｋａｎ的相应培养基上进行筛选，２～３周就产生出卡那抗性愈伤组织和抗性小芽。 展开更多

关键词 海甘蓝 基因启动子 油料作物 分离 鉴定

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在大肠杆菌中直接克隆白腐丝状真菌-黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因启动子 被引量：1

12

作者 宋旭 曾凡亚 张义正 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1999年第5期940-946,共7页

利用启动子探钍型载体ｐＳＵＰＶ４ 直接在大肠杆菌细胞中克隆到多个来自白腐丝状真菌－黄孢平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ）的基因启动子片段．这些基因启动子片段能在大肠杆菌细胞中启动重组卡那... 利用启动子探钍型载体ｐＳＵＰＶ４ 直接在大肠杆菌细胞中克隆到多个来自白腐丝状真菌－黄孢平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ）的基因启动子片段．这些基因启动子片段能在大肠杆菌细胞中启动重组卡那霉素抗性基因（ｒｋａｎｒ）的表达，不同片段赋予宿主细胞以不同的卡那霉素抗性水平，最高的可达１０００μｇ／ｍ Ｌ，最低的则为５０μｇ／ｍ Ｌ．琼脂糖凝胶电泳显示这些重组质粒ＤＮＡ 中均有不同大小的插入片段，其范围是０．５～６．０ｋｂ．选取一个插入３．９ｋｂ 的重组质粒ｐＰＣ３３ 所作的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交结果表明，插入片段以单拷贝形式存在于Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ 的基因组中．当此片段５′－端被除去１．８ｋｂ 后，余下的２．１ｋｂ 片段可使融合的Ｋａｎｒ 基因的表达效率提高６０％ ． 展开更多

关键词 黄孢平革菌 基因启动子 大肠杆菌 克隆 真菌

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版纳微型猪近交系CMAH基因克隆及亚细胞定位研究 被引量：1

13

作者 张霞 宋雪 +6 位作者 王配 王淑燕 霍海龙 潘伟荣 李罗刚 曾日彬 霍金龙 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期94-98,共5页

胞苷磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)在免疫应答、炎症及肿瘤转移过程中起着重要的作用。前期发现其在版纳微型猪近交系(BMI)颌下腺、脾脏和舌下腺中高表达,且均显著高于其他组织,提示该基因可能在免疫排斥反应中发挥作用。本研究通过... 胞苷磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)在免疫应答、炎症及肿瘤转移过程中起着重要的作用。前期发现其在版纳微型猪近交系(BMI)颌下腺、脾脏和舌下腺中高表达,且均显著高于其他组织,提示该基因可能在免疫排斥反应中发挥作用。本研究通过前期已成功扩增并且确定的编码区序列,设计带有酶切位点的引物并进行克隆,酶切连接法构建其真核表达载体,通过脂质体法转染猪肾上皮细胞系PK15,通过倒置荧光显微镜检测蛋白表达情况。获得BMI CMAH基因的包含有酶切位点的CDS序列1 746 bp,并且成功构建真核表达载体pEGFP-C1-CMAH。结果表明,该基因编码蛋白主要定位于PK15细胞的细胞质中,部分细胞核中也有表达。上述结果为进一步研究该基因编码蛋白的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 胞苷磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶 基因克隆 版纳微型猪近交系 载体构建 亚细胞定位

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苏云金芽胞杆菌cryI基因探针的制备及质粒基因定位 被引量：1

14

作者 关雄 黄志鹏 高日霞 《福建农业大学学报》 CSCD 1996年第3期329-333,共5页

将ｐＥＳＩ经ＥｃｏＲＩ酶解后回收纯化的含有苏云金芽胞杆菌ｃｒｙＩ基因高保守区的ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥＬＥＣＴ－１的ＥｃｏＲＩ位点，通过ＤＩＧ体外标记转录制备高灵敏度、背景清楚的ＲＮＡ探针，并利用该探针进行苏云... 将ｐＥＳＩ经ＥｃｏＲＩ酶解后回收纯化的含有苏云金芽胞杆菌ｃｒｙＩ基因高保守区的ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥＬＥＣＴ－１的ＥｃｏＲＩ位点，通过ＤＩＧ体外标记转录制备高灵敏度、背景清楚的ＲＮＡ探针，并利用该探针进行苏云金芽胞杆菌８０１０杀虫基因定位．结果表明。 展开更多

关键词 苏云金芽胞杆菌 cryI基因 RNA探针 基因定位

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版纳微型猪近交系ARRDC5基因亚细胞定位研究

15

作者 王配 王淑燕 +7 位作者 霍金龙 张霞 高林青 赵慧敏 霍海龙 曾日彬 李罗刚 滕晓红 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2020年第1期33-39,共7页

【目的】抑制蛋白5(ARRDC5)的功能尚不清楚,前期发现其可能与公猪繁殖力有关,本研究旨在克隆猪ARRDC5基因以及确定猪ARRDC5蛋白的亚细胞定位。【方法】通过NCBI下载猪近缘物种ARRDC5基因序列,在线BLAST比对获得猪EST序列,电子克隆猪ARR... 【目的】抑制蛋白5(ARRDC5)的功能尚不清楚,前期发现其可能与公猪繁殖力有关,本研究旨在克隆猪ARRDC5基因以及确定猪ARRDC5蛋白的亚细胞定位。【方法】通过NCBI下载猪近缘物种ARRDC5基因序列,在线BLAST比对获得猪EST序列,电子克隆猪ARRDC5基因编码区及部分侧翼序列。构建真核融合表达载体并瞬时转染猪睾丸细胞系ST,利用倒置荧光显微镜检测蛋白表达。【结果】获得版纳微型猪近交系(BMI)ARRDC5基因的cDNA序列1045 bp,包含1014 bp的CDS区,编码337个氨基酸,与牛及人的同源性高。成功构建了表达载体pEGFP-C1-ARRDC5,ARRDC5蛋白主要定位于细胞质中,部分细胞核中也有分布。【结论】研究结果为进一步研究该蛋白功能奠定基础。 展开更多

关键词 抑制蛋白5 基因克隆 版纳微型猪近交系 载体构建 亚细胞定位

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马立克氏病病毒（MDV）B抗原基因的克隆及鉴定

16

作者 吴贤福 蔡宝祥 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第3期99-103,共5页

将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增。用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体... 将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增。用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体。通过内切酶分析、地高辛（ＤＩＧ）—探针原位杂交、ＤＮＡ序列测定，确认克隆的Ｂ抗原基因正确。 展开更多

关键词 鸡病 马立克氏病 病毒 抗原基因 克隆载体

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以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4

17

作者 胡晓星 彭杰 +3 位作者 冯悦 刘丽 张阿梅 夏雪山 《生命科学研究》 CAS CSCD 2016年第3期189-195,共7页

在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,... 在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R^2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。 展开更多

关键词 肠道病毒71型 VP1基因 高保守区 TAQMAN探针 荧光定量PCR 检测

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链霉菌高拷贝质粒pIJ101 DNA的研究 Ⅱ.在大肠杆菌中具有终止子活性片段的克隆和分析

18

作者 邓子新 Tobias Kieser David A.Hopwood 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1990年第2期158-162,共5页

在大肠杆菌的终止子探针载体pIJ667上,neo基因的正常表达可使寄主产生较强的卡那霉索抗性。然而,把链霉菌高拷贝质粒pIJ101上的BclⅠ片段克隆到这个载体的BglⅡ位点,使neo的结构基因与其启动子隔开所做的克隆试验显示,有两个插入片段,Bc... 在大肠杆菌的终止子探针载体pIJ667上,neo基因的正常表达可使寄主产生较强的卡那霉索抗性。然而,把链霉菌高拷贝质粒pIJ101上的BclⅠ片段克隆到这个载体的BglⅡ位点,使neo的结构基因与其启动子隔开所做的克隆试验显示,有两个插入片段,BclⅠ-A和BclⅠ-E,可以有效地终止neo基因的转录,使大肠杆菌寄主对卡那霉素呈现敏感。这两个片段在pIJ101的限制性内切酶图谱上已得到了定位,其活性区域的大小分别为2.9和1.19kb。把pIJ101衍生的小质粒pIJ350上BclⅠ片段克隆到pIJ667中,不仅进一步暗示出pIJ101 BclⅠ-A片段上终止子功能的存在,而且把这个区域缩小到1.32kb的范围内。此外,这些终止子活性的表达显示出明显的方向性。 展开更多

关键词 链霉菌 质粒 大肠杆菌 终止子活性

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嗜热脂肪芽孢杆菌启动子克隆载体pFDC4和表达型载体pFDC11的构建 被引量：3

19

作者 何笑松 沈仁权 盛祖嘉 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 1990年第4期313-320,共8页

以pPL703的衍生质粒pPGV5为载体,从嗜热脂肪芽孢杆菌CU21总DNA的Sau 3A酶切产物中得到1个0.54kb的启动子片段,它能促进载体上的无启动子的cat-86基因在嗜热脂肪芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌中表达。这一片段以正、反向插入pPGV5载体,都能使... 以pPL703的衍生质粒pPGV5为载体,从嗜热脂肪芽孢杆菌CU21总DNA的Sau 3A酶切产物中得到1个0.54kb的启动子片段,它能促进载体上的无启动子的cat-86基因在嗜热脂肪芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌中表达。这一片段以正、反向插入pPGV5载体,都能使重组质粒转化CU21原生质体的效率提高10^(?)至10(?)倍。Southern杂交实验表明,这一启动子片段与Imanaka等报道的来自CU21中的隐蔽性质粒pBS02的能提高转化效率的1.6kb Eco RI片段是同源的。利用所得到的0.54kb Sau 3A片段构建了新的启动子克隆载体pFDC4和表达型载体pFDC11,二者都能以很高的效率转化CU21原生质体。 展开更多

关键词 嗜热脂肪杆菌 原生质体转化 载体

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利用桥梁载体策略构建水稻条斑病菌T3SS基因诱导表达检测体系 被引量：1

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作者 吾尼尔别克·美丽 杨小菲 +6 位作者 张翠萍 杨瑞环 李生樟 李逸朗 陈功友 陈晓斌 邹丽芳 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期846-856,共11页

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system,T3SS)将效应蛋白注入水稻细胞中,激发寄... 水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system,T3SS)将效应蛋白注入水稻细胞中,激发寄主水稻的感(抗)病性。为了准确在Xoc中进行T3SS基因表达调控的分析,本研究设计出桥梁载体策略,将目标基因的启动子或者功能片段构建在高拷贝的桥梁载体,获得融合表达元件,通过亚克隆的方式将融合元件转入骨架载体上,获得用于转录表达和蛋白表达分析的载体。为了验证该策略的可行性,选取hrpG、hrpX和hrcC基因构建了相应的启动子探针载体和蛋白表达载体,将这些载体导入毒性调控子基因trh、lrpX和zur的突变体中,GUS活性测定、荧光定量PCR以及蛋白免疫杂交结果显示:在trh、lrpX和zur的突变体中,hrpG、hrpX和hrcC的转录表达水平、mRNA水平和蛋白表达水平呈现一致。这表明这套桥梁载体策略能够有效应用于T3SS基因转录表达和蛋白表达的分析。综上所述,运用桥梁载体能够克服低拷贝载体DNA遗传操作效率低的缺陷,这一策略也适用于毒性相关基因调控机理的研究,这将为Xoc-水稻互作研究提供高效的工作系统。 展开更多

关键词 水稻条斑病菌 T3SS基因 启动子探针载体 蛋白表达载体

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