为了深入研究调控芥菜开花信号整合子的两个核心转录因子Flowering Locus C(FLC)和SHOTR VEGETATIVE PHASE(SVP)的作用机理和进行人工调控,以芥菜‘QJ’为材料,采用RT-PCR技术分别扩增FLC和SVP的编码序列,构建原核表达质粒pET43.1a-FLC...为了深入研究调控芥菜开花信号整合子的两个核心转录因子Flowering Locus C(FLC)和SHOTR VEGETATIVE PHASE(SVP)的作用机理和进行人工调控,以芥菜‘QJ’为材料,采用RT-PCR技术分别扩增FLC和SVP的编码序列,构建原核表达质粒pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP融合蛋白序列中的6×His标签能与Ni+结合的特点,对芥菜FLC与SVP的相互作用进行SDS-PAGE检测。结果表明:FLC与SVP能在体外相互作用并形成复合体,为深入分析FLC与SVP间的作用机理以及探讨其与下游开花信号整合子元件的相互作用提供了理论和技术基础。展开更多
为深入研究芥菜开花信号整合子的两个核心调节因子SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)与FLOWERING LOCUS C(FLC)相互作用的分子机理,通过PCR扩增,从芥菜材料‘QJ’中分别克隆含EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切位点的SVP和FLC编码区全长,并利用酵母双杂交...为深入研究芥菜开花信号整合子的两个核心调节因子SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)与FLOWERING LOCUS C(FLC)相互作用的分子机理,通过PCR扩增,从芥菜材料‘QJ’中分别克隆含EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切位点的SVP和FLC编码区全长,并利用酵母双杂交体系,将FLC与GAL4报告基因DNA激活域融合(pGADT7FLC),SVP与GAL4报告基因DNA结合域融合(pGBKT7SVP)。两种重组质粒分别转化酵母Y187和Y2HGold后未出现自激活和毒性现象。融合的二倍体酵母(pGADT7FLC×pGBKT7SVP)能在选择性固体培养基QDO/X/A(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)上生长,并且菌落呈蓝色。将诱饵质粒(pGBKT7SVP)与猎物质粒(pGADT7FLC)载体互换(pGADT7SVP、pGBKT7FLC),再次转化酵母后仍能融合成二倍体酵母(pGADT7SVP×pGBKT7FLC),并同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1,由此表明SVP与FLC蛋白能够相互结合。展开更多
为了深入研究芥菜开花整合子SOC1基因的表达调控机制,利用染色体步移法从芥菜‘QJ’中克隆了SOC1编码区上游782 bp的启动子,并构建SOC1基因启动子的酵母表达载体p Ab Ai-SOC1,与蛋白表达载体p GADT7-FLC、p GADT7-SVP共转化酵母Y1HGold...为了深入研究芥菜开花整合子SOC1基因的表达调控机制,利用染色体步移法从芥菜‘QJ’中克隆了SOC1编码区上游782 bp的启动子,并构建SOC1基因启动子的酵母表达载体p Ab Ai-SOC1,与蛋白表达载体p GADT7-FLC、p GADT7-SVP共转化酵母Y1HGold菌株。酵母单杂交表明:芥菜FLC和SVP蛋白均能与SOC1的启动子相互作用。进一步分析发现:SOC1启动子含3个CAr G-box表达调控基序。分别亚克隆这3个基因片段(SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3),并再次构建酵母重组质粒p Ab Ai-SOC1-1、pA b Ai-SOC1-2和p Ab Ai-SOC1-3,与p GADT7-FLC、p GADT7-SVP分别融合到Y1HGold菌株。融合菌株均能在相应SD/-Leu/Ab A培养基上生长,说明SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3都能被芥菜FLC、SVP蛋白识别并结合。再次构建SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3的CAr G-box删除突变体及A-T互换突变体,则均不能与FLC、SVP蛋白互作。由此说明:SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3的3个CAr G-box基序确实能特异性识别FLC、SVP,发生DNA—蛋白相互作用。这为利用启动子调控SOC1基因的转录表达等深入研究奠定了理论基础。展开更多
为深入研究甘蓝Flowering Locus C(FLC)家族与SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)蛋白互作的分子机理及其对开花的调控作用,从甘蓝‘ZQ-67’材料中克隆了5个FLC家族基因(记为BoFLCy1～BoFLCy5)。它们均编码MIKC型蛋白,按进化关系其编码蛋白可...为深入研究甘蓝Flowering Locus C(FLC)家族与SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)蛋白互作的分子机理及其对开花的调控作用,从甘蓝‘ZQ-67’材料中克隆了5个FLC家族基因(记为BoFLCy1～BoFLCy5)。它们均编码MIKC型蛋白,按进化关系其编码蛋白可分为两类:BoFLCy3和BoFLCy5为第Ⅰ类,仅在C域有1个位点变异;BoFLCy1、BoFLCy2和BoFLCy4为第Ⅱ类,仅在K、C域分别有1、2个位点变异。酵母双杂交显示:甘蓝BoFLC家族蛋白均可与BoSVP蛋白互作;但BoFLCy4蛋白最为敏感,其N端插入3个氨基酸TET会破坏该作用。β–半乳糖苷酶活性分析表明:BoFLCy1～BoFLCy5与BoSVP互作强度差异显著,强弱关系为:BoFLCy1>BoFLCy2>BoFLCy3>BoFLCy5>BoFLCy4,该家族蛋白KC域内的变异位点若为疏水氨基酸则有利于FLC/SVP聚合。进一步分析突变BoFLCy4蛋白IK域内的保守位点发现:蛋白作用强度可能不受I域的这些保守性亲(疏)水氨基酸(第63、77位)影响,而会受到K域保守氨基酸(第120、121、135、157位)的亲(疏)水性调节。展开更多
文摘为了深入研究调控芥菜开花信号整合子的两个核心转录因子Flowering Locus C(FLC)和SHOTR VEGETATIVE PHASE(SVP)的作用机理和进行人工调控,以芥菜‘QJ’为材料,采用RT-PCR技术分别扩增FLC和SVP的编码序列,构建原核表达质粒pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP融合蛋白序列中的6×His标签能与Ni+结合的特点,对芥菜FLC与SVP的相互作用进行SDS-PAGE检测。结果表明:FLC与SVP能在体外相互作用并形成复合体,为深入分析FLC与SVP间的作用机理以及探讨其与下游开花信号整合子元件的相互作用提供了理论和技术基础。
文摘为深入研究芥菜开花信号整合子的两个核心调节因子SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)与FLOWERING LOCUS C(FLC)相互作用的分子机理,通过PCR扩增,从芥菜材料‘QJ’中分别克隆含EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切位点的SVP和FLC编码区全长,并利用酵母双杂交体系,将FLC与GAL4报告基因DNA激活域融合(pGADT7FLC),SVP与GAL4报告基因DNA结合域融合(pGBKT7SVP)。两种重组质粒分别转化酵母Y187和Y2HGold后未出现自激活和毒性现象。融合的二倍体酵母(pGADT7FLC×pGBKT7SVP)能在选择性固体培养基QDO/X/A(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)上生长,并且菌落呈蓝色。将诱饵质粒(pGBKT7SVP)与猎物质粒(pGADT7FLC)载体互换(pGADT7SVP、pGBKT7FLC),再次转化酵母后仍能融合成二倍体酵母(pGADT7SVP×pGBKT7FLC),并同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1,由此表明SVP与FLC蛋白能够相互结合。
文摘为了深入研究芥菜开花整合子SOC1基因的表达调控机制,利用染色体步移法从芥菜‘QJ’中克隆了SOC1编码区上游782 bp的启动子,并构建SOC1基因启动子的酵母表达载体p Ab Ai-SOC1,与蛋白表达载体p GADT7-FLC、p GADT7-SVP共转化酵母Y1HGold菌株。酵母单杂交表明:芥菜FLC和SVP蛋白均能与SOC1的启动子相互作用。进一步分析发现:SOC1启动子含3个CAr G-box表达调控基序。分别亚克隆这3个基因片段(SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3),并再次构建酵母重组质粒p Ab Ai-SOC1-1、pA b Ai-SOC1-2和p Ab Ai-SOC1-3,与p GADT7-FLC、p GADT7-SVP分别融合到Y1HGold菌株。融合菌株均能在相应SD/-Leu/Ab A培养基上生长,说明SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3都能被芥菜FLC、SVP蛋白识别并结合。再次构建SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3的CAr G-box删除突变体及A-T互换突变体,则均不能与FLC、SVP蛋白互作。由此说明:SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3的3个CAr G-box基序确实能特异性识别FLC、SVP,发生DNA—蛋白相互作用。这为利用启动子调控SOC1基因的转录表达等深入研究奠定了理论基础。
文摘为深入研究甘蓝Flowering Locus C(FLC)家族与SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)蛋白互作的分子机理及其对开花的调控作用,从甘蓝‘ZQ-67’材料中克隆了5个FLC家族基因(记为BoFLCy1～BoFLCy5)。它们均编码MIKC型蛋白,按进化关系其编码蛋白可分为两类:BoFLCy3和BoFLCy5为第Ⅰ类,仅在C域有1个位点变异;BoFLCy1、BoFLCy2和BoFLCy4为第Ⅱ类,仅在K、C域分别有1、2个位点变异。酵母双杂交显示:甘蓝BoFLC家族蛋白均可与BoSVP蛋白互作;但BoFLCy4蛋白最为敏感,其N端插入3个氨基酸TET会破坏该作用。β–半乳糖苷酶活性分析表明:BoFLCy1～BoFLCy5与BoSVP互作强度差异显著,强弱关系为:BoFLCy1>BoFLCy2>BoFLCy3>BoFLCy5>BoFLCy4,该家族蛋白KC域内的变异位点若为疏水氨基酸则有利于FLC/SVP聚合。进一步分析突变BoFLCy4蛋白IK域内的保守位点发现:蛋白作用强度可能不受I域的这些保守性亲(疏)水氨基酸(第63、77位)影响,而会受到K域保守氨基酸(第120、121、135、157位)的亲(疏)水性调节。
