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棉铃虫中肠P450 CYP6B6基因5′上游序列的克隆及序列分析 被引量：2
1
作者 张雷 张学涛 +2 位作者 马纪 李芬 刘小宁 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期127-133,共7页
已证实2-十三烷酮等植物次生物质的胁迫会诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP6B6基因的过量表达[1]。为探明棉铃虫P450 CYP6B6基因的表达调控机制,根据棉铃虫中肠P450 CYP6B6基因cDNA序列(GenBank登录号:AY950636),运用基因组步移的... 已证实2-十三烷酮等植物次生物质的胁迫会诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP6B6基因的过量表达[1]。为探明棉铃虫P450 CYP6B6基因的表达调控机制,根据棉铃虫中肠P450 CYP6B6基因cDNA序列(GenBank登录号:AY950636),运用基因组步移的方法获得其5′上游区的序列,用启动子区的分析软件进行比对分析,结果得到棉铃虫P450 CYP6B6基因5′上游区域1 333 bp的基因片段。分别运用NNPP v.2.2和TRANSFAC v.6.0预测转录起始位点及分析了转录因子结合位点,结果显示,该序列不仅包括TATA盒等这一类核心结构序列,还含有多个转录因子的结合位点,如GATA-1、Dfd、C/EBP、HSF、cytR和AhR(芳香烃受体化合物应答元件)等。该结果为深入研究棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定分子基础。 展开更多
关键词 棉铃虫 细胞色素P450 cyp6b6基因 基因组步移 5′上游区域
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新疆一支蒿提取物诱导棉铃虫解毒酶P450 CYP6B6的表达规律 被引量：1
2
作者 何海 刘宁 +1 位作者 朱燕 刘小宁 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期130-135,共6页
旨在利用实时荧光定量PCR和Western blot分别研究新疆一枝蒿提取物黄酮及萜类对棉铃虫P450 CYP6B6在mRNA水平和蛋白水平上表达的影响。实时荧光定量PCR结果表明,P450 CYP6B6在mRNA水平的表达量受到诱导。时间效应为P450 CYP6B6在处理的1... 旨在利用实时荧光定量PCR和Western blot分别研究新疆一枝蒿提取物黄酮及萜类对棉铃虫P450 CYP6B6在mRNA水平和蛋白水平上表达的影响。实时荧光定量PCR结果表明,P450 CYP6B6在mRNA水平的表达量受到诱导。时间效应为P450 CYP6B6在处理的12 h时能够被黄酮和萜类提取物显著诱导表达,并且在24 h时表达受到抑制;浓度效应为处理24 h时,黄酮和萜类提取物浓度分别为20 mg/100 g和1 mg/100 g时显著诱导P450 CYP6B6的表达,并且在40 mg/100 g和2 mg/100 g时抑制P450 CYP6B6的表达;Western blot检测结果表明,萜类和黄酮在时间和浓度效应上都能显著诱导P450 CYP6B6蛋白表达,并且蛋白水平在时间与浓度效应中的表达趋势与mRNA水平相似。 展开更多
关键词 新疆一枝蒿提取物 棉铃虫 P450 cyp6b6 表达规律
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棉铃虫细胞色素P450CYP6B6基因启动子的活性分析 被引量：1
3
作者 李芬 马纪 刘小宁 《新疆大学学报（自然科学版）》 CAS 2012年第1期13-18,共6页
在昆虫细胞色素P450s超家族中,CYP6家族基因与杀虫剂抗性关系最为密切,其中CYP6B家族基因的表达在植物次生物质的代谢调节中发挥重要作用.为研究CYP6B6基因的表达调节机制,本文采用PCR的方法从棉铃虫中肠DNA序列中扩增了CYP6B6基因转录... 在昆虫细胞色素P450s超家族中,CYP6家族基因与杀虫剂抗性关系最为密切,其中CYP6B家族基因的表达在植物次生物质的代谢调节中发挥重要作用.为研究CYP6B6基因的表达调节机制,本文采用PCR的方法从棉铃虫中肠DNA序列中扩增了CYP6B6基因转录起始位点上游不同片段长度的5段序列,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒pGL3-CYP6B6-promoter,与内参载体pRL-TK同在脂质体的介导下转染昆虫Sf9细胞,体外分析该基因启动子的转录活性及与调控相关的因素.结果显示,5个报告质粒的荧光素酶相对活性分别是基本载体pGL3-Basic载体的0.95、1.95、1.21、1.17和1.01倍,其中p-791片段序列具有启动子活性,这段序列位于翻译起始位点上游400bp之间,生物信息学分析显示,该区间具有TATA box、CAAT box、CBFα、C/EBP等基本元件和AhR等异源物质响应的重要元件结合序列,暗示该序列可能具有与转录调控相关的元件,这为研究CYP6B6的调控机制奠定了基础. 展开更多
关键词 棉铃虫 细胞色素P450 cyp6b6基因启动子 活性分析
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棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6基因启动子活性检测条件的优化
4
作者 李芬 刘小宁 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期167-172,共6页
旨在用阳离子脂质体介导携带有pGL3-Basic报告基因的棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6启动子pGL-CYP6B6-promoter重组质粒转染Sf9细胞,对启动子活性的检测条件进行优化。将长度为999 bp的棉铃虫CYP6B6基因启动子亚克隆至荧光素酶报告载体pGL3-... 旨在用阳离子脂质体介导携带有pGL3-Basic报告基因的棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6启动子pGL-CYP6B6-promoter重组质粒转染Sf9细胞,对启动子活性的检测条件进行优化。将长度为999 bp的棉铃虫CYP6B6基因启动子亚克隆至荧光素酶报告载体pGL3-Basic上,提取无细胞内毒素的质粒,转染处于对数生长期的昆虫细胞Sf9,通过检测荧光素酶的表达量验证启动子的活性。对转染后的检测时间、加入转染质粒的量,转染质粒与内对照质粒pRL-TK的比例分别进行了优化,进而确定检测的最优条件。结果表明,转染后的最适检测时间为24 h,转染质粒的最适用量为3.2μg,报告质粒与内对照质粒用量的比例为10 1时转染效率最高。 展开更多
关键词 细胞色素P450 cyp6b6基因启动子 SF9细胞 脂质体 转染 活性检测
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棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6多克隆抗体的制备 被引量：3
5
作者 魏原杰 张雷 +2 位作者 程婷婷 马纪 刘小宁 《生命科学研究》 CAS CSCD 2015年第6期497-500,共4页
利用核酸免疫蛋白加强法制备兔抗棉铃虫CYP6B6的多克隆抗体。构建重组质粒pcDNA3-CYP6B6并测序验证序列的正确性后,采用皮下多点注射法将重组质粒注射到新西兰大白兔体内,免疫3次后,第4次使用融合蛋白MBP-CYP6B6加强免疫。用ELISA法检... 利用核酸免疫蛋白加强法制备兔抗棉铃虫CYP6B6的多克隆抗体。构建重组质粒pcDNA3-CYP6B6并测序验证序列的正确性后,采用皮下多点注射法将重组质粒注射到新西兰大白兔体内,免疫3次后,第4次使用融合蛋白MBP-CYP6B6加强免疫。用ELISA法检测抗体的效价,并利用免疫组化法对抗体的特异性进行检测,得到的兔抗CYP6B6血清的效价达到1︰50 000。免疫组化法检测显示此抗血清能与棉铃虫不同组织中存在的CYP6B6蛋白特异性结合,说明利用核酸免疫蛋白加强法制备了高滴度、特异性强的兔抗棉铃虫CYP6B6的多克隆抗体。 展开更多
关键词 棉铃虫 细胞色素P450 cyp6b6 核酸免疫蛋白加强 多克隆抗体
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2-十三烷酮诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera)细胞色素P450 CYP6B6时空表达规律的研究 被引量：5
6
作者 刘小宁 李芬 +1 位作者 张学涛 朱燕 《干旱区研究》 CSCD 北大核心 2014年第5期978-983,共6页
植物次生物质2-十三烷酮能够诱导棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6基因的过量表达,以6龄棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫为对象,研究2-十三烷酮对棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6的诱导作用,并对其表达规律进行了初探。分别采用实时荧光定量PCR(q... 植物次生物质2-十三烷酮能够诱导棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6基因的过量表达,以6龄棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫为对象,研究2-十三烷酮对棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6的诱导作用,并对其表达规律进行了初探。分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫组化的方法,分析棉铃虫在终浓度为10 mg·g-1的2-十三烷酮胁迫下,不同时间及不同组织部位CYP6B6基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达变化规律。qRTPCR结果显示:用添加了2-十三烷酮的人工饲料饲喂棉铃虫不同时间后,在头壳中CYP6B6 mRNA的表达量一直低于对照组,到48 h时与对照组具有显著差异(t4=15.32,P=0.000 1);在脂肪体中随着时间的推移,表达量呈升高趋势,在36 h已过量表达(t4=7.627,P=0.001 6);在24 h时体壁和中肠组织的表达量分别较对照组提高了2.06倍和7.16倍,之后表达量均呈现先降低后升高的趋势,且在48 h时达到最大。免疫组化结果显示:在棉铃虫幼虫组织中发现CYP6B6蛋白在体壁、脂肪体、中肠中均有表达,相比之下在体壁中表达量较高。该研究为深入了解棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 棉铃虫(Helicoverpa armigera) 细胞色素P450cyp6b6 2-十三烷酮 MRNA水平 蛋白水平 表达规律
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