[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞...[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞后用梯度稀释法得到阳性单克隆细胞;采用Western blotting和qRT-PCR检测CTNNB1及其下游基因的mRNA和蛋白质表达水平;采用实时无标记细胞分析实验检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验评估细胞迁移能力。[结果]成功构建稳定敲低CTNNB1的A549细胞系,与A549-shNC相比,A549-shCTNNB1细胞中CTNNB1的mRNA表达降低(1.01±0.05 vs 0.40±0.004,P<0.0001),β-catenin的蛋白表达降低(0.95±0.10 vs 0.47±0.16,P<0.05);细胞增殖有减缓的趋势,增殖相关基因COX2、CCND1、c-MYC的mRNA表达降低(0.978±0.02 vs 0.66±0.09,P<0.01);MMP2/9的mRNA表达降低(0.98±0.001 vs 0.20±0.08,P<0.0001),MMP2/9蛋白表达降低(0.96±0.05 vs 0.70±0.05,P<0.05),细胞迁移能力减弱(0.91±0.02 vs 0.69±0.05,P<0.01);CCL4的mRNA表达上调(1.87±0.39 vs 6.27±0.60,P<0.001)。[结论]敲低CTNNB1的A549细胞增殖速度减缓,迁移能力减弱,且趋化因子CCL4的mRNA表达上调。展开更多
文摘[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞后用梯度稀释法得到阳性单克隆细胞;采用Western blotting和qRT-PCR检测CTNNB1及其下游基因的mRNA和蛋白质表达水平;采用实时无标记细胞分析实验检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验评估细胞迁移能力。[结果]成功构建稳定敲低CTNNB1的A549细胞系,与A549-shNC相比,A549-shCTNNB1细胞中CTNNB1的mRNA表达降低(1.01±0.05 vs 0.40±0.004,P<0.0001),β-catenin的蛋白表达降低(0.95±0.10 vs 0.47±0.16,P<0.05);细胞增殖有减缓的趋势,增殖相关基因COX2、CCND1、c-MYC的mRNA表达降低(0.978±0.02 vs 0.66±0.09,P<0.01);MMP2/9的mRNA表达降低(0.98±0.001 vs 0.20±0.08,P<0.0001),MMP2/9蛋白表达降低(0.96±0.05 vs 0.70±0.05,P<0.05),细胞迁移能力减弱(0.91±0.02 vs 0.69±0.05,P<0.01);CCL4的mRNA表达上调(1.87±0.39 vs 6.27±0.60,P<0.001)。[结论]敲低CTNNB1的A549细胞增殖速度减缓,迁移能力减弱,且趋化因子CCL4的mRNA表达上调。
文摘【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1(catenin beta 1,CTNNB1)对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR(Quantitative real time PCR,qRT-PCR)等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小(≤3 mm)、中(3—6 mm)、大(≥6 mm)卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V-FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。
