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CRISPR-Cas9基因编辑系统及其在昆虫中的应用研究进展
1
作者 张秋朗 刘志飞 +2 位作者 张贝贝 钟军 张旺和 《生物灾害科学》 2025年第4期622-630,共9页
CRISPR-Cas9基因编辑系统自问世以来就在生命科学研究领域得到广泛应用。近年来,随着脱靶效应、显微注射等技术不断改良,该技术也被广泛应用于昆虫学领域的相关研究。通过对CRISPR-Cas9基因编辑系统在昆虫研究中的技术进展进行概述,并... CRISPR-Cas9基因编辑系统自问世以来就在生命科学研究领域得到广泛应用。近年来,随着脱靶效应、显微注射等技术不断改良,该技术也被广泛应用于昆虫学领域的相关研究。通过对CRISPR-Cas9基因编辑系统在昆虫研究中的技术进展进行概述,并就该技术在昆虫基因编辑及基因功能方面的研究进展进行总结,旨在为利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对昆虫基因功能的研究、害虫防治以及经济性昆虫分子改良等领域的相关研究提供参考。 展开更多
关键词 CRISP-Cas9 基因编辑 脱靶效应 昆虫
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基于CRISPR/Cas9系统的OsbHLH116基因编辑及其脱靶效应分析 被引量：4
2
作者 杜彦修 季新 +5 位作者 陈会杰 彭廷 张静 李俊周 孙红正 赵全志 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期577-586,共10页
以水稻OsbHLH116基因为编辑对象,根据基因编码区序列(CDS)在第一外显子区域设计长度为19bp的sgRNA,化学合成sgRNA的寡核苷酸序列,然后与CRISPR/Cas9系统表达载体pBUN411连接,再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系,最后利用酶切和测序相... 以水稻OsbHLH116基因为编辑对象,根据基因编码区序列(CDS)在第一外显子区域设计长度为19bp的sgRNA,化学合成sgRNA的寡核苷酸序列,然后与CRISPR/Cas9系统表达载体pBUN411连接,再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系,最后利用酶切和测序相结合的方法对OsbHLH116突变体进行了筛选鉴定和脱靶效应分析。结果表明,所构建的pBUN411-gRNA载体成功实现了对基因OsbHLH116的定向编辑。酶切分析表明在选取的10株T0代转基因苗中得到了6个OsbHLH116突变单株。对6个突变单株进行了TA克隆测序分析,发现了纯合突变、双等位突变和杂合突变3种类型。酶切分析表明2个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。 展开更多
关键词 水稻 基因编辑 CRISPR/Cas9 脱靶效应 OsbHLH116
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CRISPR/Cas9系统中的脱靶效应及检测技术研究进展 被引量：9
3
作者 张晨 雷展 +2 位作者 李凯 商颖 许文涛 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期78-87,共10页
聚类规则间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(Cas9蛋白)已经成为精确编辑基因组的强大工具。CRISPR/Cas9系统源自于细菌和古生菌的免疫机制,结构简单、易于设计,仅... 聚类规则间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(Cas9蛋白)已经成为精确编辑基因组的强大工具。CRISPR/Cas9系统源自于细菌和古生菌的免疫机制,结构简单、易于设计,仅需改变单引导RNA(single-guide RNA,sgRNA)上的一小段序列即可快速实现对不同基因位点的编辑。与锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技术相比,CRISPR/Cas9系统基因编辑效率更高、特异性更强。但在应用过程中不可避免的脱靶事件严重限制了CRISPR/Cas9系统的进一步发展,因此本篇文章就CRISPR/Cas9系统的脱靶类型、影响因素、降低策略以及脱靶检测技术进行综述。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 脱靶效应 影响因素 降低策略 检测技术
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非人灵长类动物基因编辑技术的应用及挑战 被引量：2
4
作者 毕延震 肖红卫 +9 位作者 张立苹 任红艳 华再东 华文君 王正 牛敏杰 林郑云 任习东 孙理华 郑新民 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期48-56,共9页
建立有效的动物模型是研究人类疾病演进、开发新型治疗手段的重要方法。非人灵长类动物在进化发育、生理生化及病理方面和人类最接近,是研究人类疾病的理想动物模型。随着基因编辑技术的发展,研究者已经成功建立了多种模仿人类疾病的非... 建立有效的动物模型是研究人类疾病演进、开发新型治疗手段的重要方法。非人灵长类动物在进化发育、生理生化及病理方面和人类最接近,是研究人类疾病的理想动物模型。随着基因编辑技术的发展,研究者已经成功建立了多种模仿人类疾病的非人灵长类动物模型。但是CRISPR/Cas9的脱靶效应、嵌合突变以及基因敲入效率较低等突出问题也逐渐引起重视。本文综述了基因编辑技术在建立非人灵长类动物模型中的应用现状,提出了目前亟需解决的难点和应对策略,以期为高效、准确构建非人灵长类动物模型提供借鉴与参考。 展开更多
关键词 非人灵长类动物模型 TALENs CRISPR/Cas9 脱靶效应 嵌合突变
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基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑 被引量：11
5
作者 季新 李飞 +6 位作者 晏云 孙红正 张静 李俊周 彭廷 杜彦修 赵全志 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第15期2861-2871,共11页
【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰... 【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。 展开更多
关键词 水稻 CRISPR/Cas9 基因编辑 OsPIL15 脱靶效应
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CRISPR/Cas系统在植物基因组编辑中的应用 被引量：28
6
作者 瞿礼嘉 郭冬姝 +1 位作者 张金喆 秦跟基 《生命科学》 CSCD 2015年第1期64-70,共7页
在基因组水平上进行植物基因人工改造对农作物的改良具有重要意义。一直以来,科学家都未发现有效的植物基因组编辑的方法。最近发现的CRISPR/Cas系统因其简易和有效性被广泛应用于包括植物在内的多种生物的基因组编辑中。CRISPR/Cas系... 在基因组水平上进行植物基因人工改造对农作物的改良具有重要意义。一直以来,科学家都未发现有效的植物基因组编辑的方法。最近发现的CRISPR/Cas系统因其简易和有效性被广泛应用于包括植物在内的多种生物的基因组编辑中。CRISPR/Cas系统仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变。目前CRISPR/Cas系统已成功在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、甜橙(Citrus sinensis)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)以及苔藓植物地钱(Marchantia polymorpha)等植物中实现了定点基因组编辑。综述将对CRISPR/Cas系统在植物中的最新研究进行全面的总结和讨论。 展开更多
关键词 CRISPR Cas9蛋白 单一引导RNA 植物 脱靶效应
原文传递
CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估 被引量：23
7
作者 谢胜松 张懿 +4 位作者 张利生 李广磊 赵长志 倪攀 赵书红 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1125-1136,共12页
基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small gu... 基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sg RNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sg RNA设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sg RNA进行了归纳总结。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9系统 基因组编辑 sgRNA 脱靶效应
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基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析 被引量：4
8
作者 陈丽香 彭秀华 +5 位作者 谭丹 韩铖潇 赵锐 王超 李顺 周晓辉 《中国实验动物学报》 CSCD 北大核心 2017年第6期587-593,共7页
目的建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到N... 目的建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 小鼠 MAD2L1 脱靶效应
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CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用 被引量：17
9
作者 幸宇云 杨强 任军 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期217-226,共10页
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中Ⅱ型... CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中Ⅱ型系统的组成较简单,由其改造成的CRISPR/Cas9技术已成为一种高效的基因组编辑工具。自2013年CRISPR/Cas9技术成功用于哺乳动物基因组定点编辑以来,应用该技术进行基因组编辑的报道呈现出爆发式的增长。农业动物不仅是重要的经济动物,也是人类疾病和生物医药研究的重要模式动物。本文综述了CRISPR/Cas9技术在农业动物中的研究和应用进展,简述了该技术的脱靶效应及减少脱靶的主要方法,并展望了该技术的应用前景。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因组编辑 农业动物 脱靶
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基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究 被引量：4
10
作者 李继洋 胡燕 +2 位作者 姚瑞 代培红 刘晓东 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1522-1534,共13页
CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这... CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明,2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。 展开更多
关键词 棉花 CRISPR/Cas9 编辑效率 脱靶效率 sgRNA类型
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CRISPR/Cas9系统的脱靶效应 被引量：10
11
作者 尹珅 贺桂芳 +2 位作者 赖方秾 谢凤云 马俊宇 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期31-37,共7页
在细菌中发现的免疫系统CRISPR/Cas9,已经成为最有效的基因工程编辑工具,甚至大有希望可以治疗人类遗传性疾病。但是CRISPR/Cas9系统在使用时会产生严重的脱靶问题,导致假表型和错误的解释。提高与靶点结合的高效率,同时减少脱靶效应,... 在细菌中发现的免疫系统CRISPR/Cas9,已经成为最有效的基因工程编辑工具,甚至大有希望可以治疗人类遗传性疾病。但是CRISPR/Cas9系统在使用时会产生严重的脱靶问题,导致假表型和错误的解释。提高与靶点结合的高效率,同时减少脱靶效应,将是今后CRISPR/Cas9技术的挑战。综述关注与CRISPR/Cas9脱靶效应相关的内容,总结了影响其靶点专一性的因素,减少CRISPR/Cas9脱靶效应的可行性方法和设计工具等,供大家学习讨论。 展开更多
关键词 脱靶 靶点专一性 CRISPR/Cas9
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CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展 被引量：19
12
作者 李聪 曹文广 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1531-1542,共12页
CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。CRISPR即成簇的、有规律的、间隔短回文重复序列,是人们在研究大肠杆菌编码的碱性... CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。CRISPR即成簇的、有规律的、间隔短回文重复序列,是人们在研究大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因时发现的,它原本是存在于细菌和古细菌基因组中含有多个短重复序列的基因位点,能够为自身提供一种特异性免疫保护机制,抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵。CRISPR系统主要依赖cr RNA(CRISPR RNA)和tracr RNA(Trans-activating chimeric RNA)结合并导向Cas(CRISPR-associated system)蛋白来对外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种类型的CRISPR/Cas系统:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型系统组分较为简单,主要依赖的是Cas9核心蛋白,在RNA的介导下,Cas9蛋白能够识别靶序列进行切割造成DNA的双链断裂(Double-strand breaks,DSB)。在此基础上,人们可以对基因组的特定位点进行基因打靶、基因定点插入、基因修复等各种遗传操作。这种新的基因组定点编辑技术比类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)技术设计更加简单、更容易操作,势必会有更广泛的应用。目前,利用该技术已在多个物种的细胞和个体水平上实现了遗传操作。文中将从CRISPR/Cas9的来源、结构、作用机理方面介绍其研究进展,为开展这一领域的研究工作提供参考。 展开更多
关键词 基因编辑 CRISPR/Cas9系统 单链向导RNA 脱靶效应
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CRISPR技术:一个新型基因编辑工具所引发的革命 被引量：3
13
作者 肖婧 张宗德 《华西医学》 CAS 2018年第8期943-949,共7页
作为目前最受欢迎的基因编辑工具,成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术正在基础生物学研究、医学、生物技术等多个领域引起一场新的变革。该文先简单介绍了CRISPR-CRISP... 作为目前最受欢迎的基因编辑工具,成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术正在基础生物学研究、医学、生物技术等多个领域引起一场新的变革。该文先简单介绍了CRISPR-CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)系统的发展历史,然后重点介绍了CRISPR工具箱中经典的CRISPR-Cas9工具、后续的CRISPR-Fn Cas9/RCas9工具以及新兴的CRISPR-Cas13和CRISPR-Cas12a工具,最后对这场技术革命背后值得思考的问题进行了评论。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas系统 基因编辑 脱靶效应
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中国科学家发现胞嘧啶单碱基编辑工具存在基因组范围的脱靶 被引量：1
14
作者 谢卡斌 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期296-299,共4页
基于CRISPR-Cas的单碱基编辑工具是近2年基因组编辑技术的重大突破之一,已经在人类(Homosapiens)细胞和动植物中得到了验证与应用。最近,中国科学家分析了胞嘧啶编辑器(CBE)BE3和HF1-BE3,以及腺嘌呤编辑器(ABE)等单碱基编辑工具在水稻(O... 基于CRISPR-Cas的单碱基编辑工具是近2年基因组编辑技术的重大突破之一,已经在人类(Homosapiens)细胞和动植物中得到了验证与应用。最近,中国科学家分析了胞嘧啶编辑器(CBE)BE3和HF1-BE3,以及腺嘌呤编辑器(ABE)等单碱基编辑工具在水稻(Oryza sativa)中的脱靶现象,发现BE3和HF1-BE3两个CBE在全基因组范围内存在脱靶编辑,而ABE则没有脱靶现象。这一发现对单碱基编辑工具的应用和进一步改进具有重要意义。 展开更多
关键词 单碱基编辑 CRISPR 脱靶
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慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析 被引量：3
15
作者 杨强 徐盼 +4 位作者 蒋凯 乔传民 任军 黄路生 幸宇云 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1378-1389,共12页
【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic pr... 【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sg RNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sg RNA与互补序列(包含接头)退火成双链后连接入线性化的lenti CRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒ps PAX2和p CMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6μg·m L-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5μg·m L-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑(打靶)细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%(2/20)的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、Cylin D2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降(P<0.01)。Western blotting结果显示,打靶细胞BMPR-IB基因的表达量较对照组细胞降低62%。CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞(P<0.01);打靶细胞中,随着传代的(P5、P7和P9)增加其增殖能力极显著下降(P<0.01),而对照组细胞不同代次间细胞增殖能力无显著差异(P>0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。 展开更多
关键词 慢病毒 CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞 BMPR-IB 脱靶 细胞增殖
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动物基因组编辑及其应用研究进展
16
作者 任红艳 华再东 +1 位作者 毕延震 郑新民 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期1594-1598,共5页
基因组编辑技术已成为研究人员进行生物和生物医学研究的强大武器。为了进一步改善和拓展其功能,科学家们在多种生物个体上进行了测试,优化了多种基因编辑工具递送策略,并且已经研发出了多种方案来确保基因组编辑的准确性。本研究回顾... 基因组编辑技术已成为研究人员进行生物和生物医学研究的强大武器。为了进一步改善和拓展其功能,科学家们在多种生物个体上进行了测试,优化了多种基因编辑工具递送策略,并且已经研发出了多种方案来确保基因组编辑的准确性。本研究回顾了基因组编辑技术的历史里程碑,讨论了出现的相关技术应用,最后,本研究还预测了未来基因组编辑技术的发展方向,为基因组编辑技术的未来发展提供了一个崭新的视角。 展开更多
关键词 基因组编辑 CRISPR-Cas9 脱靶效应
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CRISPR/Cas9系统——靶向基因组编辑的新策略 被引量：7
17
作者 赵海卫 吕欣 尹文 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第3期281-284,共4页
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统经人工改造为由Cas9核酸酶和特异的sgRNA构成的新型靶向基因组编辑技术,即CRISPR/Cas9系统。与锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因... CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统经人工改造为由Cas9核酸酶和特异的sgRNA构成的新型靶向基因组编辑技术,即CRISPR/Cas9系统。与锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9系统操作简单,花费低,编辑功能更强。本文综述了CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制和应用进展,并对其应用前景进行了展望。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9系统 靶向基因组编辑 分子靶向治疗 脱靶效应 综述
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利用CRISPR/Cas9系统改造酿酒酵母的研究进展 被引量：2
18
作者 陈小玲 廖东庆 +3 位作者 黄尚飞 陈英 芦志龙 陈东 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期148-158,共11页
酿酒酵母是常用的工业生产菌株,改造酿酒酵母以提高其生产性能极为重要。然而,传统的改造方法存在步骤繁琐、周期长等问题。CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌发现的自适应防御系统。目前CRISPR/Cas9系统已经成为基因组编辑的有力工具,... 酿酒酵母是常用的工业生产菌株,改造酿酒酵母以提高其生产性能极为重要。然而,传统的改造方法存在步骤繁琐、周期长等问题。CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌发现的自适应防御系统。目前CRISPR/Cas9系统已经成为基因组编辑的有力工具,能够同时改造酿酒酵母的多个基因。本文综述CRISPR/Cas9系统各组分的作用和系统的构建,介绍sgRNA靶序列的设计原则和代表性设计工具,总结对酿酒酵母进行多基因编辑的策略,以及CRISPR/Cas9系统存在脱靶和编辑效率低的问题和应对展望,为更好地应用CRISPR/Cas9系统改造酿酒酵母提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9系统的构建 多基因编辑 靶序列的设计 脱靶
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CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略 被引量：15
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作者 郭全娟 韩秋菊 张建 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2018年第8期798-807,共10页
近年,CRISPR/Cas9系统已经迅速成为医学领域最具潜力的基因编辑工具,它是继锌指核酸内切酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)之后的第三代人工改造... 近年,CRISPR/Cas9系统已经迅速成为医学领域最具潜力的基因编辑工具,它是继锌指核酸内切酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)之后的第三代人工改造的核酸内切酶,被喻为"基因魔剪".该基因编辑系统最大优势在于只需要设计一个靶向目标序列的sgRNA(single-guide RNA)就能引导Cas9核酸酶结合到特定的基因序列,并指导Cas9核酸酶切割相应的结合位点,进而完成对靶基因的编辑.由于其设计简单、实施快捷、成本低廉,突变效率高等优点,这一系统在基因组功能鉴定、抗病毒、抗肿瘤、免疫治疗等众多领域已广泛研究.虽然CRISPR/Cas9系统具有如此多的优点,但是其可能存在的脱靶风险影响了该基因编辑技术的深入研究,增加了用于疾病治疗的风险,阻碍了临床的进一步应用.如何保证CRISPR/Cas9基因编辑技术高编辑效率,同时也能降低脱靶效应,这将是未来科学研究者深入研究CRISPR/Cas9技术并开拓其临床应用亟待解决的问题.为此我们在文章中对CRISPR/Cas9系统组成、作用机制及应用进展进行简要综述,着重介绍目前这一领域广受关注的脱靶效应,并归纳优化策略,以期为更多的研究者提供参考. 展开更多
关键词 基因编辑 CRISPR/Cas9 脱靶效应 向导RNA
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基因组编辑新技术:CRISPR/Cas系统在生物基因组学中的研究进展 被引量：4
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作者 吴彩云 罗秉轮 孙玉强 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2063-2069,共7页
近两年,CRISPR/Cas技术的发现和应用,迅速丰富和发展了基因组编辑技术,并以此演化更多基因组研究的手段。基因组编辑是指将外源DNA元件导入到细胞染色体特定位点,定点改造基因组,获得预期的生物体基因组序列发生遗传改变的技术,包括通... 近两年,CRISPR/Cas技术的发现和应用,迅速丰富和发展了基因组编辑技术,并以此演化更多基因组研究的手段。基因组编辑是指将外源DNA元件导入到细胞染色体特定位点,定点改造基因组,获得预期的生物体基因组序列发生遗传改变的技术,包括通过基因敲入(knock-in)、基因敲除(knock-out)定点改造基因组从而改变基因组中的特定基因、基因表达方式或调控其它基因表达模式等,达到研究基因功能的目的。目前,基因组编辑技术主要有锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)和CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统是细菌及古细菌在进化过程中形成,主要针对侵入的噬菌体等生物外源基因在体内整合或切除从而产生获得性免疫系统。根据出现特定CRISPR蛋白编码基因相邻位点重复数,CRISPR/Cas系统分为三种类型,系统Ⅰ和Ⅲ目前不适合应用。而系统Ⅱ最为简单,应用最广泛,由crRNA、tracrRNA以及Cas9蛋白组成。本文主要讨论最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas系统的结构特点、作用原理及在基因组定点修饰方面的应用,并对该技术运用中所遇到或可能遇到的脱靶等问题及潜在的应用前景进行分析。 展开更多
关键词 基因组编辑 同源重组 CRISPR/Cas 脱靶效应
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