鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失株(△CD2v/MGF)三重荧光定量PCR检测方法的建立

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作者 李梅 徐丽媛 +4 位作者 张博 谢振华 李劼 关平原 刘玉梅 《兽医导刊》 2025年第3期54-60,共7页

为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失株(△CD2v/MGF)的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒的p72、CD2v、MGF360_14L基因序列分别设计PCR引物和TaqMan探针,构建标准品,绘制标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复... 为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失株(△CD2v/MGF)的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒的p72、CD2v、MGF360_14L基因序列分别设计PCR引物和TaqMan探针,构建标准品,绘制标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验以及样品检测。结果显示,以p72、CD2v、MGF360_14L重组质粒为标准品绘制的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数(R2)分别为1.000、0.998和0.999;p72、CD2v与MGF360_14L基因的检测下限均为5拷贝/μL;与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等常见混感病原不存在交叉反应,特异性强;检测3个基因重复性变异系数均小于2%;与OIE推荐的荧光定量PCR方法对比,检测样品结果符合率100%。综上,该方法检测样品灵敏、特异和准确,可鉴别非洲猪瘟野毒株与CD2v、MGF360_14L基因缺失株,可作为一种快速、灵敏、准确的检测手段应用到实际生产及疫情监测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72基因 cd2v基因缺失 MGF360_14L基因缺失 荧光定量PCR

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非洲猪瘟CD2v截短蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立 被引量：3

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作者 胡巧云 黄小久 +7 位作者 唐小明 何世成 林源 彭志 石建 王卫国 刘道新 王昌建 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1103-1108,共6页

为建立非洲猪瘟(ASF)抗体检测方法,本研究根据ASFV HLJ18株基因组序列合成CD2v蛋白的胞外区段基因序列,连接至原核表达载体pET28a,构建表达质粒pET28a-CD2v。经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS,构建表达菌株p ET28a... 为建立非洲猪瘟(ASF)抗体检测方法,本研究根据ASFV HLJ18株基因组序列合成CD2v蛋白的胞外区段基因序列,连接至原核表达载体pET28a,构建表达质粒pET28a-CD2v。经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS,构建表达菌株p ET28a-CD2v/BL21(DE3)PLysS。经IPTG诱导和镍柱纯化后,获得纯化的CD2v蛋白并经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。以纯化的CD2v蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立检测CD2v抗体的间接ELISA方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性及在临床血清中的应用。结果显示,经测序构建的表达质粒序列正确,CD2v蛋白表达经SDS-PAGE可见略小于25k Da的条带,Westernblot显示能与ASFV感染血清发生特异性反应。建立了ASFCD2v蛋白抗体检测方法CD2v-ELISA,抗原包被质量浓度为50μg/L,血清稀释倍数为1∶100,羊抗猪HRP-IgG稀释倍数为1∶100000,阴阳性临界值为0.26;与PRRSV、CSFV、PRV(g I)、PRV(gb)、FMDV血清不发生反应,具有良好的特异性;ASF阳性血清稀释至128000倍后仍检测为阳性,具有较高的敏感性;重复性结果显示,批间和批内变异系数均小于10%。使用CD2v-ELISA检测154份临床血清,阳性结果74份,阳性率为48.05%。与2个国产、2个进口商品化ASFV抗体试剂盒的检测结果比较,CD2v-ELISA方法跟其他方法的符合率较高,分别为95.45%,94.16%,88.31%,93.51%。因此,本研究成功建立了基于CD2v胞外区段抗原的ELISA方法,可用于ASF临床抗体的检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 cd2v截短蛋白 间接cd2v-ELISA

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非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立 被引量：7

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作者 王彩霞 吴绍强 +4 位作者 王勤 陈冬杰 张舟 冯春燕 林祥梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1083-1089,共7页

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本... 为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性,以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.988,斜率为-3.025 4,最低检测限可达到10 copies/μL,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于2%。综上,本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 实时荧光PCR cd2v基因 检测

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表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白重组腺病毒的构建及其吸附红细胞特性的研究 被引量：6

4

作者 常星 胡永新 +5 位作者 周昊 赵永刚 张永强 戈胜强 王建琳 吴晓东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期1252-1257,共6页

为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,本研究将ASFV EP402R基因融合猪泛素(Ub)基因,并经密码子优化后整合至人复制缺陷性5型腺病毒(Ad5)骨架质粒,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,拯救重组腺病毒(Ad5-CD2vUb-Y... 为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,本研究将ASFV EP402R基因融合猪泛素(Ub)基因,并经密码子优化后整合至人复制缺陷性5型腺病毒(Ad5)骨架质粒,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,拯救重组腺病毒(Ad5-CD2vUb-YH),结果显示,在转染8 d后出现典型细胞病变,且经测序鉴定显示插入片段与预期一致,表明拯救出一株重组腺病毒Ad5-CD2vUb-YH。利用Adeno-X快速滴度试剂盒测定F1~F3代Ad5-CD2vUb-YH的滴度,结果显示F1~F3代Ad5-CD2vUb-YH的滴度分别为1.36×10^(8)IFU/mL、1.47×10^(8)IFU/mL、2.16×10^(8)IFU/mL。利用直接免疫荧光试验(DFA)和western blot对F3代Ad5-CD2vUb-YH在Vero细胞中CD2v蛋白的表达进行鉴定,DFA鉴定结果显示感染Vero细胞的Ad5-CD2vUb-YH能与V5-FITC抗体特异性结合,细胞质内呈现特异性绿色荧光信号;Western blot鉴定结果显示感染Vero细胞的Ad5-CD2vUb-YH能与V5-HRP抗体和ASFV阳性血清均可进行特异性反应,在约102 ku和31 ku处均可见两条特异性条带,以上结果均表明CD2v蛋白得到了有效表达;进一步利用蛋白质谱对CD2v蛋白位置的胶块进行肽段序列测定并分析,结果显示其肽段序列与数据库中ASFV CD2v蛋白氨基酸序列匹配度为11%。对F3代Ad5-CD2vUb-YH感染293A细胞后吸附猪红细胞的能力进行鉴定,结果显示,Ad5-CD2vUb-YH表达的CD2v蛋白具有吸附红细胞的特性。本研究首次获得了一株重组腺病毒Ad5-CD2vUb-YH,其表达的CD2v蛋白与ASFV的CD2v蛋白特性完全一致,为ASFV CD2v蛋白吸附红细胞功能域的研究和ASFV重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 腺病毒载体 cd2v蛋白

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非洲猪瘟病毒CD2v阻断ELISA检测方法的初步建立与应用 被引量：2

5

作者 王彩霞 于浩洋 +7 位作者 吴佳俊 杨振 贾红 仇松寅 刘晓飞 吴绍强 冯春燕 林祥梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1050-1055,共6页

为了建立特异性检测CD2v抗体的非洲猪瘟病毒(ASFV)阻断ELISA方法,以杆状病毒表达的CD2v蛋白作为包被抗原,以抗ASFV CD2v蛋白的特异性阻断单克隆抗体为检测抗体,经过条件优化以及敏感性和特异性检测,建立了特异性检测CD2v抗体的ASFV阻断E... 为了建立特异性检测CD2v抗体的非洲猪瘟病毒(ASFV)阻断ELISA方法,以杆状病毒表达的CD2v蛋白作为包被抗原,以抗ASFV CD2v蛋白的特异性阻断单克隆抗体为检测抗体,经过条件优化以及敏感性和特异性检测,建立了特异性检测CD2v抗体的ASFV阻断ELISA方法。结果显示,建立的阻断ELISA的最佳抗原包被量为20 ng/孔,待检血清样本最佳稀释度为1∶1,酶标抗体最佳稀释度为1∶10000。当血清样品的PI≥41.23%时,判定结果为CD2v抗体阳性,当血清样品的PI<41.23%时,判定结果为CD2v抗体阴性。特异性试验结果显示,该方法仅能与ASFV阳性血清反应,与伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪瘟病毒等猪病病毒疫苗毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低能检测出128倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;对64份猪血清样品盘样品进行检测,结果显示符合率为96.88%。上述结果表明,本研究中建立的基于CD2v蛋白的ASFV阻断ELISA方法,联合p30等ASFV抗原血清学诊断方法可以用于CD2v缺失毒株的鉴别检测,为我国出现的ASFV CD2v缺失毒株的流行病学调查及疫情监测提供有效的检测技术。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 cd2v蛋白 阻断ELISA 敏感性 特异性

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非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定 被引量：2

6

作者 王彩霞 史喜菊 +7 位作者 冯春燕 于浩洋 仇松寅 刘晓飞 陈冬杰 贾红 吴绍强 林祥梅 《中国动物检疫》 CAS 2023年第7期95-102,共8页

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合... 为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG_(1)/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10^(5)。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和常数(Ka)为9.68×10^(8)L/mol。初步建立的阻断ELISA试验显示,36A3能够有效区分阴阳性血清,N/P高达12.53,提示其为非常有效的阻断ELISA候选抗体。本试验结果为深入研究非洲猪瘟病毒CD2v蛋白功能及研发非洲猪瘟病毒阻断ELISA血清学检测试剂盒奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 cd2v蛋白 动物免疫 单克隆抗体 阻断ELISA

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基于ASFV EP402R编码蛋白CD2v的生物信息学分析 被引量：1

7

作者 张帅 顾文源 +3 位作者 赵云环 刘莹 左玉柱 范京惠 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期92-98,共7页

为深入了解非洲猪瘟病毒(ASFV)的EP402R编码蛋白CD2v结构与功能的关系和病毒-宿主作用机制,本研究通过在线工具对Pig/HLJ/2018中国分离株CD2v蛋白进行了遗传进化和生物信息学分析。结果显示:Pig/HLJ/2018株与格鲁吉亚Georgia 2007、Geor... 为深入了解非洲猪瘟病毒(ASFV)的EP402R编码蛋白CD2v结构与功能的关系和病毒-宿主作用机制,本研究通过在线工具对Pig/HLJ/2018中国分离株CD2v蛋白进行了遗传进化和生物信息学分析。结果显示:Pig/HLJ/2018株与格鲁吉亚Georgia 2007、Georgia 2008以及其他中国毒株处于同一分支,基因型同为Ⅱ型;同一基因型CD2v蛋白氨基酸序列一致性高达100%,不同基因型间蛋白氨基酸序列表现出差异,氨基酸一致性在76.8%~81.7%之间;该CD2v蛋白表达的蛋白大小为41.00889 kD;蛋白结构主要以无规卷曲为主;存在信号肽和跨膜区;存在4个优势B细胞表位和5个T细胞表位。结果表明:当前中国流行株为基因Ⅱ型;CD2v蛋白在ASFV入侵机体、免疫逃逸等过程中扮演重要角色,为ASFV的深入研究和ASF的防治奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 cd2v 作用机制 生物信息学

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表达非洲猪瘟病毒外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株的构建 被引量：1

8

作者 李鸿鑫 邵洋洋 +3 位作者 蔺文成 陈伟国 张祥斌 谢青梅 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第15期93-97,共5页

为了构建表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株并研究其生物学特性,试验利用RED/ET同源重组技术和ccdB反向筛选技术将EP402R pUC57-CMV-Flag-EP402R-BGH质粒(EP402R序列来源Georgia 2007/1株... 为了构建表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株并研究其生物学特性,试验利用RED/ET同源重组技术和ccdB反向筛选技术将EP402R pUC57-CMV-Flag-EP402R-BGH质粒(EP402R序列来源Georgia 2007/1株,GenBank登录号为FR682468)的EP402R基因片段替换掉pBeloBAC11-Bartha-K61载体中的TK基因片段,构建pBeloBAC11-Bartha-K61-(TK)CMV-Flag-EP402R-BGH重组质粒;再将该重组质粒转染至Vero细胞中进行病毒拯救,通过观察细胞病变、PCR方法和Western-blot鉴定得到重组伪狂犬毒株rBartha-K61-EP402R,并对其稳定性和增殖特性进行研究。结果表明:构建的重组伪狂犬毒株连续传代20次后仍能检测到EP402R基因和Flag标签蛋白;重组伪狂犬毒株与亲本毒株的增殖曲线保持一致,且病毒效价峰值可达到1×10^(5.6)TCID_(50)/mL。说明试验成功构建了表达ASFV外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株,且该毒株具有良好遗传稳定性和增殖性能。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 伪狂犬病毒 外膜蛋白cd2v TK基因 同源重组 载体疫苗

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非洲猪瘟CD2v胞外区基因片段的真核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：8

9

作者 于浩洋 吴绍强 +6 位作者 王彩霞 Grzegorz WOZNIAKOWSKI 刘晓飞 仇松寅 李新实 冯春燕 林祥梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期45-52,共8页

本研究利用真核表达系统表达非洲猪瘟病毒的CD2v胞外区蛋白,研究其免疫特性,制备多克隆抗体并研究其性质,为研发特异性单抗奠定数据基础。以非洲猪瘟病毒Wuhan2019-1株(GenBank:MN393476.1)为模板,合成CD2v胞外区基因序列,并将其克隆至... 本研究利用真核表达系统表达非洲猪瘟病毒的CD2v胞外区蛋白,研究其免疫特性,制备多克隆抗体并研究其性质,为研发特异性单抗奠定数据基础。以非洲猪瘟病毒Wuhan2019-1株(GenBank:MN393476.1)为模板,合成CD2v胞外区基因序列,并将其克隆至真核表达载体pCAGGS载体中,获得pCAGGS-CD2v胞外区重组质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染293F细胞,获得重组胞外CD2v蛋白(简称His-CD2v)。用Ni-NTA柱纯化His-CD2v,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用ELISA和间接免疫荧光对多克隆抗体进行鉴定。结果显示,(1)His-CD2v融合蛋白在293F中以可溶形式表达,SDS结果显示,相对分子质量约为35~80 ku的弥散带;(2)融合表达的His-CD2v能与阳性血清反应,与对照不反应;(3)HisCD2v制备的多抗效价最高达1∶218700,且能与阳性血清竞争性结合CD2v抗原。上述结果表明,His-CD2v融合蛋白的表达及其多抗的成功制备,为进一步筛选CD2v特异性单抗及研制竞争ELISA试剂盒,为非洲猪瘟感染与免疫鉴别方法的建立奠定了坚实的基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 cd2v 真核表达 多克隆抗体 竞争ELISA

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非洲猪瘟病毒强免疫原性重组CD2v抗原的制备与初步应用 被引量：11

10

作者 周晓慧 肖景景 +3 位作者 张鑫宇 张泉 夏晓莉 孙怀昌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期2472-2480,共9页

旨在获得非洲猪瘟病毒(ASFV)强免疫原性重组CD2v抗原,利用生物信息学软件进行CD2v抗原指数分析,将其细胞质内免疫显性区与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,对ELP-CD2v融合蛋白的相变循环(ITC)条件进行优化,在优化条件... 旨在获得非洲猪瘟病毒(ASFV)强免疫原性重组CD2v抗原,利用生物信息学软件进行CD2v抗原指数分析,将其细胞质内免疫显性区与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,对ELP-CD2v融合蛋白的相变循环(ITC)条件进行优化,在优化条件下进行融合蛋白纯化,利用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,通过免疫转印法对重组CD2v抗原进行鉴定,利用重组CD2v抗原建立ELISA抗体检测方法,与多抗原ELISA对ASFV抗体阳性和阴性血清进行平行检测。结果显示,ELP-CD2v融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC条件为28℃和1.5 mol·L^-1 NaCl,在0.2%Triton X-100存在下进行ITC,纯化的融合蛋白纯度为76.3%;TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,再次ITC回收的重组CD2v抗原纯度为91.7%,能被ASFV抗体识别;根据多抗原ELISA检测结果选择血清样品,用重组CD2v抗原ELISA进行检测,结果显示,15份ASFV抗体阴性血清均为CD2v抗体检测阴性,15份ASFV抗体阳性血清均为CD2v抗体检测阳性。这些研究结果表明,ASFV的CD2v蛋白胞内区存在强免疫原性表位,其重组抗原有望用于CD2v的抗体检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 cd2v蛋白 强免疫原性抗原 初步应用

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非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：11

11

作者 任肖 吴竞 +4 位作者 于海男 林伟东 侯绍华 郭晓宇 朱鸿飞 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第12期3698-3706,共9页

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP 402 R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP 402 R全长基因进行密码子优化后连入pET-28... 本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP 402 R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP 402 R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP 402 R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) EP 402 R基因 cd2v重组蛋白 原核表达 多克隆抗体

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基于非洲猪瘟病毒CD2v基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：10

12

作者 韩玉 王涛 +7 位作者 潘力 孙茂文 周萍萍 王冰 王翌 罗玉子 仇华吉 孙元 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期847-852,共6页

为用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CD2v基因功能研究及区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株,本研究根据ASFV中国流行株(MK333180.1)的CD2v基因序列设计了1对特异性引物和探针,经过条件优化建立了一种以ASFV CD2v基因... 为用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CD2v基因功能研究及区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株,本研究根据ASFV中国流行株(MK333180.1)的CD2v基因序列设计了1对特异性引物和探针,经过条件优化建立了一种以ASFV CD2v基因为靶标的能够鉴别ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.6×101~1.6×10^(8)拷贝/μL时,线性关系良好,线性相关系数R^(2)为0.998;该方法可以特异性检测ASFV,不与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型发生交叉反应;最低检测限为16拷贝/μL,比常规PCR的敏感性高出3个数量级;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%;能够有效地区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株;该方法与本实验室建立的针对ASFV p72基因的荧光定量PCR方法在检测临床样品时无统计学差异且符合率高。本研究所建立的TaqMan荧光定量PCR方法为ASFV的快速检测提供了新靶标,同时也为ASFV CD2v基因功能的研究、野毒株与CD2v基因缺失毒株的鉴别提供了有力的技术支持。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 cd2v基因 荧光定量PCR 鉴别诊断

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非洲猪瘟病毒外膜蛋白CD2v的原核表达及其免疫特性的研究 被引量：7

13

作者 钟秋萍 于婉琪 +8 位作者 薄宗义 吕璐 谢振华 王振忠 郑龙三 张志芳 扈荣良 钱莺娟 陈鸿军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期689-695,共7页

本研究参考非洲猪瘟病毒(ASFV)国内分离株SY18株的EP402R基因(编码CD2v蛋白),优化其序列,设计特异性引物扩增。将去除跨膜保留胞外区或胞内区的两种截短体克隆到原核表达载体p ET-28a中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱... 本研究参考非洲猪瘟病毒(ASFV)国内分离株SY18株的EP402R基因(编码CD2v蛋白),优化其序列,设计特异性引物扩增。将去除跨膜保留胞外区或胞内区的两种截短体克隆到原核表达载体p ET-28a中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导,铁蛋白融合CD2v胞外区(CD2vN-Fe)和铁蛋白融合CD2v胞外-胞内区(CD2v-NC-Fe)均获得高效表达。以该融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和间接免疫荧光(IFA)方法检测其灵敏度和特异性。结果表明:CD2vN-Fe多抗特异性较强。本研究为建立ASFV的血清学鉴别检测方法奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 cd2v 原核表达 抗体

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非洲猪瘟病毒跨膜蛋白CD2v的结构与功能研究进展 被引量：5

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作者 何庆 邹亚文 +3 位作者 王东亮 秦艺文 刘翔燕 王乃东 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期1244-1251,共8页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪,引起的高度传染性和致死性动物传染病,不同品种和年龄阶段的猪均易感,发病率和死亡率可高达100%。ASFV是全球生猪产业的重点疫病之... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪,引起的高度传染性和致死性动物传染病,不同品种和年龄阶段的猪均易感,发病率和死亡率可高达100%。ASFV是全球生猪产业的重点疫病之一,目前无商品化疫苗。ASFV是一种大而复杂的双链DNA双层囊膜病毒。ASFV主要跨膜蛋白CD2v是介导血细胞吸附(Hemadsorption,HAD)和鉴定病毒血清型的关键蛋白,它参与ASFV宿主免疫应答、免疫逃逸和病毒复制等生理生化过程,且是ASFV疫苗和抗病毒分子研发的潜在重要靶点。探究CD2v在ASFV感染中的作用及机制渐成热点。因此,本文对ASFV CD2v的结构及其生物学功能研究报道进行分析综述,将为阐明ASFV致病机理和疫苗研发等提供重要参考。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) cd2v 疫苗 生物学功能

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非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的生物信息学分析及多表位疫苗的设计 被引量：5

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作者 田盼盼 秦晓东 +7 位作者 宋金星 万博 韩悦 姬鹏超 杜永坤 蒋大伟 吴亚楠 张改平 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第9期1-5,共5页

本试验运用各种生物信息学技术对非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株CD2v蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、抗原决定簇、抗原性、二级及三级空间结构进行初步分析并预测其B、T淋巴细胞的优势表位,从而设计以pET28a为载体的重组CD2v蛋... 本试验运用各种生物信息学技术对非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株CD2v蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、抗原决定簇、抗原性、二级及三级空间结构进行初步分析并预测其B、T淋巴细胞的优势表位,从而设计以pET28a为载体的重组CD2v蛋白的多表位疫苗。评估结果表明,CD2v蛋白是亲水性的分泌蛋白,含有11个抗原决定簇,其α螺旋、β转角、无规则卷曲和延伸链的比例为17.22%、5.28%、50.00%和25.70%。基于CD2v蛋白的多表位疫苗稳定性强,具有免疫原性且为非过敏原,有望成为防控非洲猪瘟的一种有效手段。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 cd2v蛋白 多表位疫苗 抗原表位 生物信息学

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CpG和ICTYOLANE^(TM)31佐剂对ASFV-CD2v蛋白免疫效果的影响 被引量：2

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作者 庞忠宝 黄颖 +4 位作者 冯春燕 翟文竹 吉日木图 朱鸿飞 贾红 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期2418-2424,共7页

探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)和ICTYOLANE^(TM)31微乳佐剂对重组表达的ASFV-CD2v蛋白在小鼠体内免疫效果的影响。以杆状病毒表达的CD2v蛋白为抗原,分别配伍CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide,CPG ODN)... 探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)和ICTYOLANE^(TM)31微乳佐剂对重组表达的ASFV-CD2v蛋白在小鼠体内免疫效果的影响。以杆状病毒表达的CD2v蛋白为抗原,分别配伍CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide,CPG ODN)和ICTYOLANE^(TM)31微乳佐剂,皮下免疫BALB/c小鼠。首次免疫后14 d进行二免,采集首免后0、14 d以及二免后7、14及28 d血清,通过间接ELISA检测血清中CD2v抗体水平;采集二免后35 d小鼠分离脾脏淋巴细胞,通过流式细胞术分析IFN-γ水平。结果显示,间接ELISA结果显示在二免后7 d可检测到较高水平的CD2v抗体,ICTYOLANE^(TM)31佐剂和CPG ODN佐剂组抗体水平明显高于蛋白组。T细胞亚群分析结果显示,在二免后35 d,CpG ODN佐剂组的CD4^(+)T淋巴细胞的比例最高,达到81.34%,ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD8^(+)T淋巴细胞的比例最低,仅为11.37%。ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD4^(+)/CD8^(+)比值最高,ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD4^(+)T细胞IFN-γ分泌水平最高,可达9.07%,但CpG ODN佐剂组、ICTYOLANE^(TM)31佐剂组及蛋白组间差异不显著。推断,小鼠在第二次免疫后7 d产生了较高水平的抗体,CpG ODN、ICTYOLANE^(TM)31佐剂对ASFV-CD2v蛋白均可增强免疫小鼠产生CD2v抗体的水平,其中CpG ODN佐剂作用更强。ICTYOLANE^(TM)31佐剂及CpG ODN佐剂可以增强机体细胞免疫,其中ICTYOLANE^(TM)31佐剂作用更强。该研究为非洲猪瘟亚单位疫苗相关佐剂的筛选提供了一定参考。 展开更多

关键词 CpG佐剂 非洲猪瘟 cd2v 免疫抗体 IFN-Γ ICTYOLANETM31

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非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单链抗体的制备及鉴定 被引量：1

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作者 杜晨暄 邹亚文 +8 位作者 张颜 王智勇 李丹彤 喻蓓蕾 蒋一凡 王瑀琦 何庆 杨毅 王乃东 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期1465-1472,共8页

为了获得特异性针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白单链抗体(scFv),本研究以CD2v阳性单克隆抗体杂交瘤细胞为模板,通过PCR扩增得到抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap-PCR在VH和VL基因间引入短... 为了获得特异性针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白单链抗体(scFv),本研究以CD2v阳性单克隆抗体杂交瘤细胞为模板,通过PCR扩增得到抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap-PCR在VH和VL基因间引入短肽(Gly4Ser)2连接形成scFv。将其插入原核表达载体p ET28a(+)中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达,通过ELISA对复性scFv蛋白进行反应活性评价。结果显示,通过CD2v蛋白的阻断ELISA筛选出分泌阻断效果良好的单抗杂交瘤细胞株4B8,并成功扩增获得单克隆抗体4B8的重链可变区(VH,399 bp)、轻链可变区(VL,369 bp)及由GS Linker连接而成的4B8-scFv基因(744 bp);SDS-PAGE结果显示,4B8-scFv在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,通过尿素变性及透析复性,得到纯度较高的4B8-scFv(相对分子质量约为34 ku);间接ELISA结果表明,4B8-scFv与CD2v蛋白具有良好的反应活性。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 单克隆抗体 单链抗体 cd2v蛋白

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表达非洲猪瘟病毒CD2v与P12蛋白的重组伪狂犬病毒的构建 被引量：2

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作者 梁旺旺 李成龙 +3 位作者 陈文智 丰志华 蔡少丽 陈骐 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期132-140,共9页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)与伪狂犬病(pseudorabies,PR)分别由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)与伪狂犬病毒感染(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪(或部分猪)高致死、传染性疾病。目前非洲猪瘟无商业化疫苗,两... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)与伪狂犬病(pseudorabies,PR)分别由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)与伪狂犬病毒感染(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪(或部分猪)高致死、传染性疾病。目前非洲猪瘟无商业化疫苗,两种疾病均给养猪业造成了巨大的经济损失。本研究以PRV-Fa经典毒株为载体通过CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)基因编辑技术将ASFV(Pig/HLJ/18)CD2v(EP402R)与p12(O61R)基因分别插入PRV-Fa株TK(UL23)及gI(US7)基因位点中,成功构建TK及gI缺失且重组表达ASFV CD2v与P12的重组弱毒株PRV-∆gI(P12)-∆TK(CD2v)。通过基因测序、蛋白质免疫印迹(Western blot)与免疫荧光表明重组毒株遗传性状稳定且CD2v与P12在Vero细胞中稳定表达。通过一步生长曲线、噬斑生长测定、小鼠毒力测试及小鼠病理学评估表明与野生型毒株PRV-Fa相比重组毒株毒力明显减弱,对小鼠不具致死能力,该重组毒株为研究预防PR及ASF的新型疫苗提供了新的选择。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 伪狂犬病毒 cd2v P12 疫苗 重组疫苗

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不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白可溶性表达及免疫反应性比较 被引量：1

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作者 冯梦珂 王星博 +3 位作者 林璐璐 崔明仙 颜焰 周继勇 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期873-880,共8页

本研究旨在系统性地探究不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的可溶性表达差别,并利用临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清比较包涵体和可溶性CD2v蛋白的免疫反应性。利用5种原核表达载体pCold-TF、pET28a、pMAL-C6T、pGEX-4T-1、pET32a... 本研究旨在系统性地探究不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的可溶性表达差别,并利用临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清比较包涵体和可溶性CD2v蛋白的免疫反应性。利用5种原核表达载体pCold-TF、pET28a、pMAL-C6T、pGEX-4T-1、pET32a分别表达去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白,利用镍-氨三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)亲和层析法分别纯化源自pET28a和pCold-TF表达载体的包涵体和可溶性CD2v蛋白,并用间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法比较纯化蛋白的免疫反应性。结果显示,pCold-TF载体以表达可溶性蛋白为主,pMAL-C6T载体同时表达包涵体和可溶性蛋白,而其他载体主要表达包涵体蛋白。临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清检测数据显示,可溶性蛋白的免疫反应性显著优于包涵体蛋白(P<0.05)。pCold-TF载体的触发因子(trigger factor,TF)标签可促进CD2v蛋白的可溶性表达,其表达蛋白的免疫反应性优于包涵体蛋白。本研究结果为CD2v蛋白的免疫原性研究奠定了基础,亦为其他重要抗原的可溶性表达提供了思路。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 cd2v蛋白 原核表达 可溶性表达 免疫反应性

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非洲猪瘟病毒及其衣壳蛋白CD2v研究进展 被引量：3

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作者 郑天豪 涂凯 +2 位作者 蔡望伟 肖曼 王晶 《生命的化学》 CAS 2021年第6期1277-1281,共5页

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起的严重急性、出血性、烈性传染病,病死率可达100%。2018年我国发生首例非洲猪瘟疫情,并迅... 非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起的严重急性、出血性、烈性传染病,病死率可达100%。2018年我国发生首例非洲猪瘟疫情,并迅速蔓延,给我国生猪产业造成数百亿元的经济损失,至今依然严重影响着我国农业发展和食品安全。非洲猪瘟病毒是一种核质双链DNA大病毒,在其基因组编码的约200种蛋白质中,有一种由EP402R基因编码的糖蛋白CD2v在ASFV病毒入侵宿主和传播扩散中发挥重要作用。本文对近年来非洲猪瘟病毒及其衣壳CD2v蛋白的研究现状作一综述。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 衣壳蛋白 cd2v 疫苗

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