猪CD1d蛋白多克隆抗体的制备及应用

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作者 刘传霞 陈欣 +4 位作者 王晓 李雪雯 李婷婷 翁长江 郑君 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1620-1628,共9页

[目的]制备猪源CD1d的多克隆抗体,为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染过程中的功能奠定基础。[方法]利用PCR方法扩增了猪CD1d基因,并将其同源重组至pGEX-6p1载体中,构建了原核重组表达质粒pGEX-6p1-C... [目的]制备猪源CD1d的多克隆抗体,为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染过程中的功能奠定基础。[方法]利用PCR方法扩增了猪CD1d基因,并将其同源重组至pGEX-6p1载体中,构建了原核重组表达质粒pGEX-6p1-CD1d。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,表达的GST-CD1d重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot(WB)方法鉴定,SDS-PAGE结果显示约50 ku处有一条明显的条带,该蛋白以包涵体形式表达。然后利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法进行蛋白纯化,将纯化的GST-CD1d蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后,将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,采用颈背部多点皮下注射,免疫剂量为200μg/只,首免后第3周和第5周分别进行二免和三免,均采用弗氏不完全佐剂乳化,方法和剂量与首免相同。三免后第7天,通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫,一周后心脏采血。该抗体经Protein G亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过WB和间接免疫荧光(IFA)鉴定瞬时转染表达的外源CD1d蛋白和猪原代巨噬细胞(PAMs)表达的内源CD1d蛋白的表达与细胞定位情况。同样,制备的CD1d抗体可以将外源瞬时转染表达的CD1d通过IP拉下。为了探究CD1d在ASFV感染早期的情况,将ASFV接种于PAMs,制备ASFV感染0、15、30、60 min的样品,以CD1d为一抗,通过WB检测了CD1d蛋白的表达情况。在HEK293T细胞共转pCAGGS-HA-CD1d和pCAGGS-Flag-CD2v质粒,24 h后收取细胞裂解,加入Flag beads过夜结合蛋白,通过WB检测互作情况染,同时,质粒共转染于共聚焦小皿中的HEK293T细胞,用标签抗体对其进行孵育,选择相应的荧光二抗,通过激光共聚焦显微镜观察CD1d与CD2v在细胞中共定位情况。采用Co-IP验证CD1d与ASFV外囊膜蛋白CD2v的相互作用。[结果]原核表达的GST-CD1d蛋白以包涵体形式表达在感受态细胞中,分子质量约为35 ku;实验兔4次免疫CD1d重组蛋白后采血并分离血清,纯化的抗体经SDS-PAGE检测在45和25 ku处各出现一条特异性条带,分别为CD1d抗体的重链与轻链。以纯化的CD1d蛋白作为免疫原制备的兔抗CD1d抗体包含重链和轻链,且具有较好纯度;该抗体能够通过WB和IFA鉴定瞬时转染的外源以及PAMs内源CD1d蛋白的表达和细胞定位。进一步检测结果显示,ASFV感染PAMs后,CD1d蛋白表达水平明显增加,并且WB和IFA结果显示CD1d与ASFV编码的外囊膜蛋白CD2v存在相互作用和共定位。[结论]通过原核表达技术制备了CD1d的抗体,为进一步探究CD1d蛋白在ASFV感染过程中的生物学功能打下了基础。 展开更多

关键词 cd1d蛋白 原核表达 多克隆抗体 非洲猪瘟病毒 Cd2v蛋白

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黄芩苷抑制沙眼衣原体宿主细胞MHCⅠ、CD1d下调的机制 被引量：5

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作者 黄浩 田黎黎 +1 位作者 黄汉菊 石春薇 《中国医院药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第21期1750-1754,共5页

目的:研究黄芩苷对沙眼衣原体体外生长的影响,并探究其对感染细胞MHC分子表达影响的可能机制。方法:用HeLa细胞培养沙眼衣原体Ct,选取不同的时间点及不同浓度的黄芩苷干预,免疫荧光检测包涵体数目及大小;Western blot检测空白组、对照... 目的:研究黄芩苷对沙眼衣原体体外生长的影响,并探究其对感染细胞MHC分子表达影响的可能机制。方法:用HeLa细胞培养沙眼衣原体Ct,选取不同的时间点及不同浓度的黄芩苷干预,免疫荧光检测包涵体数目及大小;Western blot检测空白组、对照组及不同黄芩苷浓度干预组CPAF、RFX5和USF-1蛋白表达水平;流式细胞术分别检测各组细胞表面MHCⅠ类分子(HeLa细胞)及CD1d分子(PURL原代细胞)表达情况。结果:黄芩苷明显抑制包涵体形成的数目及大小,降低活化的CPAF含量及抑制RFX5、USF-1的降解,抑制感染细胞表面MHCⅠ、CD1d表达下调。结论:黄芩苷能抑制沙眼衣原体体外生长,而CPAF很可能是黄芩苷抑制感染细胞表面MHC分子及CD1d分子下调的干预靶点。 展开更多

关键词 黄芩苷 沙眼衣原体 CPAF MHCⅠ cd1d

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硫酸脑苷酯负载的CD1d四聚体检测小鼠Ⅱ型NKT细胞 被引量：3

3

作者 张固琴 聂汉祥 +1 位作者 杨炯 余红樱 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期696-698,共3页

目的:建立一种检测小鼠Ⅱ型NKT细胞的方法。方法:将硫酸脑苷酯(sulfatide)与生物素连接的CD1d单体按摩尔比3∶1混合室温静置过夜,之后加入PE标记的链酶亲和素,室温孵育4 h制成sulfatide/CD1d四聚体。然后应用流式细胞术(FCM)检测正常小... 目的:建立一种检测小鼠Ⅱ型NKT细胞的方法。方法:将硫酸脑苷酯(sulfatide)与生物素连接的CD1d单体按摩尔比3∶1混合室温静置过夜,之后加入PE标记的链酶亲和素,室温孵育4 h制成sulfatide/CD1d四聚体。然后应用流式细胞术(FCM)检测正常小鼠脾脏及肺脏单个核细胞中Ⅱ型NKT细胞的百分比(TCR-β+sulfatide/CDld四聚体+),以及小鼠脾细胞经sulfatide刺激后单个核细胞中的Ⅱ型NKT细胞的百分比。结果:正常小鼠脾脏及肺脏单个核细胞中Ⅱ型NKT细胞的比例分别为(0.875±0.096)%和(1.175±0.263)%;小鼠脾细胞经sulfatide刺激后的Ⅱ型NKT细胞的比例为(2.75±0.603)%,与正常相比明显增加(P<0.01)。结论:硫酸脑苷酯负载的CDld四聚体是检测小鼠Ⅱ型NKT细胞的有效方法。 展开更多

关键词 cd1d四聚体 Ⅱ型NKT细胞 硫酸脑苷酯

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抗CD1d单克隆抗体的制备及其识别结构域的鉴定 被引量：2

4

作者 刘莹 李德敏 +2 位作者 徐小宁 刘雪松 金伯泉 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期959-960,共2页

目的:制备抗人CD1d单克隆抗体(mAb)并研究其结合特性。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠源性抗人CD1d mAb。用免疫荧光染色和流式细胞术鉴定其识别位点。结果:获得1株分泌抗CD1d mAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水ELISA效价达10-6,为IgG1... 目的:制备抗人CD1d单克隆抗体(mAb)并研究其结合特性。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠源性抗人CD1d mAb。用免疫荧光染色和流式细胞术鉴定其识别位点。结果:获得1株分泌抗CD1d mAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水ELISA效价达10-6,为IgG1亚类,可识别293T细胞转染的CD1d分子的α1结构域。结论:获得1株可特异性识别CD1dα1结构域的mAb,为进一步研究CD1d的结构及功能提供了手段。 展开更多

关键词 cd1d 单克隆抗体 结合位点

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CD1d四聚体检测NKT细胞 被引量：2

5

作者 刘景华 窦立萍 +1 位作者 王莉莉 于力 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期82-83,共2页

目的:建立一种检测小鼠NKT细胞的方法。方法:首先将α-GalCer负载于空的CD1d四聚体上。将α-GalCer溶于1000mL/L的DMSO中,配成浓度为0.1g/L,之后震荡α-GalCer液,37℃,12h,用之前超声水浴37℃,10min,取12mol/L的上述α-GalCer液加入到1m... 目的:建立一种检测小鼠NKT细胞的方法。方法:首先将α-GalCer负载于空的CD1d四聚体上。将α-GalCer溶于1000mL/L的DMSO中,配成浓度为0.1g/L,之后震荡α-GalCer液,37℃,12h,用之前超声水浴37℃,10min,取12mol/L的上述α-GalCer液加入到1mol/L的四聚体溶液中,将上述二者的混合液37℃,避光,孵育24～48h。然后应用流式细胞术(FCM)检测正常的和腹腔注射α-GalCer5μg3d后的小鼠的脾脏及骨髓中共表达α-GalCer/CD1d四聚体及CD3的NKT细胞。结果:在正常小鼠脾脏及骨髓的淋巴细胞中NKT细胞的比例分别为1.2%和1.6%;腹腔注射α-GalCer5μg3d后小鼠脾脏的淋巴细胞中NKT细胞有轻度的增加,比例为2%和2.7%。结论:CD1d四聚体是检测小鼠NKT细胞的有效工具。 展开更多

关键词 cd1d四聚体 NKT细胞 Α-GALCER

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CD1d分子的结构与功能 被引量：3

6

作者 陆田田 黄震 陈章权 《生命的化学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期159-161,共3页

CD1d是CD1家族中的一员,其结构类似MHCI类分子,主要表达于抗原提呈细胞、肝细胞和肠道上皮细胞等细胞表面。CD1d分子提呈糖脂抗原,在抗原装载、胞内运输及其加工处理等方面独具特色,并在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的发生... CD1d是CD1家族中的一员,其结构类似MHCI类分子,主要表达于抗原提呈细胞、肝细胞和肠道上皮细胞等细胞表面。CD1d分子提呈糖脂抗原,在抗原装载、胞内运输及其加工处理等方面独具特色,并在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的发生发展过程中具有重要作用。 展开更多

关键词 cd1d cd1 抗原提呈

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兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定 被引量：1

7

作者 陈章权 黄震 +2 位作者 梁晓东 何天文 陆田田 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期250-252,共3页

目的:制备兔抗人CD1d分子α3结构域(hCD1d-α3)多克隆抗体。方法:PCR法扩增出人hCD1d-α3编码区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用Ni2+-NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白,以之... 目的:制备兔抗人CD1d分子α3结构域(hCD1d-α3)多克隆抗体。方法:PCR法扩增出人hCD1d-α3编码区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用Ni2+-NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA、Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果:成功构建了hCD1d-α3原核表达载体pET28/h CD1d-α3,高效表达并纯化hCD1d-α3蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1∶6400,Western blot显示该抗体能与hCD1d特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCD1d。结论:通过制备重组hCD1d-α3蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗hCD1d-α3多克隆抗体。 展开更多

关键词 cd1d α3结构域 表达 抗体 制备

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CD1_D基因与B7-1基因共转染胰腺癌细胞及其抗癌作用的实验研究 被引量：1

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作者 王昆华 龚昆梅 +8 位作者 张勇学 钟鸣 欧阳一鸣 凌平 黄映光 张剑 朱宇 刘为军 赵喜荣 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 2007年第5期442-445,共4页

目的观察共转染小鼠B7-1和CD1D基因对小鼠胰腺癌细胞的免疫应答。方法将表达B7-1和CD1D基因的逆转录病毒载体导入包装细胞系,然后转染入胰腺癌细胞。用PCR和Western方法鉴定细胞表达;用B7-1和CD1D阳性的细胞在体内诱导抗肿瘤免疫反应。... 目的观察共转染小鼠B7-1和CD1D基因对小鼠胰腺癌细胞的免疫应答。方法将表达B7-1和CD1D基因的逆转录病毒载体导入包装细胞系,然后转染入胰腺癌细胞。用PCR和Western方法鉴定细胞表达;用B7-1和CD1D阳性的细胞在体内诱导抗肿瘤免疫反应。结果B7-1和CD1D阳性的细胞在同基因小鼠体内能诱导抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。结论B7-1基因和CD1D基因共转染肿瘤细胞,能抑制肿瘤生长,可能为肿瘤的基因治疗开辟一条新途径。 展开更多

关键词 基因 cd1d 基因 B7-1 转染 胰腺癌细胞

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伴抗心磷脂抗体阳性的SLE患者外周血CD1c和CD1d表达增高 被引量：1

9

作者 芮红兵 郑玲 +2 位作者 康日辉 林珺芳 郑晓强 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2014年第11期1558-1559,共2页

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者机体能产生多种抗非肽类自身抗体,如抗双链DNA（antidsDNA autoantibody）抗体及抗心磷脂抗体（anti-cardiolipin antibody,ACA））.ACA在约60％的SLE患者中高表达,与动静脉栓... 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者机体能产生多种抗非肽类自身抗体,如抗双链DNA（antidsDNA autoantibody）抗体及抗心磷脂抗体（anti-cardiolipin antibody,ACA））.ACA在约60％的SLE患者中高表达,与动静脉栓塞、血小板减少及狼疮抗凝因子（lupus anticoagulant,LA））显著相关.作为抗原递呈分子,CD1c和CD1d分子在SLE自身非肽类抗体的发生发展中可能发挥着重要作用.本实验对伴ACA阳性的SLE患者外周血CD1c及CD1d的表达及相关细胞因子进行了研究. 展开更多

关键词 抗心磷脂抗体阳性 cd1d分子 SLE患者 cd1c 外周血 ERYTHEMATOSUS 系统性红斑狼疮 狼疮抗凝因子

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CD1d/NKT在抗HBV和HCV中的作用 被引量：1

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作者 陈建勇 沈学文 张吉翔 《生命的化学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期246-248,共3页

CDld是人类自细胞表面的抗原分子,它可以将脂质抗原递呈给天然杀伤T细胞(NKT),使其激活。而NKT是近年来发现的一类特殊的T细胞,它既可以表达T细胞表面标志,又可以表达天然杀伤细胞(NK)表面标志,能识别由CD1d递呈的抗原,广泛参与自身免... CDld是人类自细胞表面的抗原分子,它可以将脂质抗原递呈给天然杀伤T细胞(NKT),使其激活。而NKT是近年来发现的一类特殊的T细胞,它既可以表达T细胞表面标志,又可以表达天然杀伤细胞(NK)表面标志,能识别由CD1d递呈的抗原,广泛参与自身免疫调节。近年来,许多研究发现,CD1d/NKT可以有效抑制肝炎病毒的复制。 展开更多

关键词 cd1d 天然杀伤T细胞(NKT) 乙型肝炎病毒(HBV) 丙型肝炎病毒(HCV)

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人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

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作者 陈章权 黄震 +2 位作者 梁晓东 陆田田 何天文 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期348-350,共3页

目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体。方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠... 目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体。方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并以ELISA、Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果:在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白,用其免疫小鼠,获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体,免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。结论:成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体,为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础。 展开更多

关键词 cd1d 基因 表达 抗体 制备

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CD1d基因稳定转染Panc-1细胞系的建立

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作者 陈贤玉 刘为军 +3 位作者 王昆华 龙亚新 龚方友 师义 《昆明理工大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2013年第5期85-89,共5页

实验采用PCR法获得CD1d基因片段,将其插入慢病毒pReceiver-Lv201载体(带GFP荧光)中获得EX-S0249-LV201重组质粒,经转染试剂EndoFectin-Lenti转染到293T细胞中获得慢病毒LP-S0249-LV201,用包装获得的慢病毒感染胰腺癌Panc-1细胞,在不同... 实验采用PCR法获得CD1d基因片段,将其插入慢病毒pReceiver-Lv201载体(带GFP荧光)中获得EX-S0249-LV201重组质粒,经转染试剂EndoFectin-Lenti转染到293T细胞中获得慢病毒LP-S0249-LV201,用包装获得的慢病毒感染胰腺癌Panc-1细胞,在不同时间段用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,并用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法验证获得的表达细胞株.实验结果显示经RT-PCR和Western blotting检测证实慢病毒LP-S0249-LV201转染至Panc-1细胞株后,该细胞株表达CD1d基因和蛋白,成功建立了稳定表达CD1d基因的Panc-1细胞系,为进一步研究CD1d基因在胰腺癌免疫基因治疗中的作用奠定基础. 展开更多

关键词 cd1d 慢病毒重组质粒 嘌呤霉素 胰腺癌 PANC-1细胞

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CD1_D基因与B7-1基因真核表达载体的构建

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作者 王昆华 张杰 +7 位作者 龚昆梅 肖乐 欧阳一鸣 刘为军 凌平 黄映光 龙亚新 郭世奎 《中国肿瘤外科杂志》 CAS 2010年第4期199-201,206,共4页

目的构建表达小鼠CD1_D基因和B7-1基因的真核表达载体。方法用PCR方法获得基因,定向克隆连接到真核表达载体上,得到重组真核表达载体,使用酶切方法加以鉴定。结果酶切得到的片段与所需相符,得到重组的逆转录病毒载体。结论重组小鼠CD1_... 目的构建表达小鼠CD1_D基因和B7-1基因的真核表达载体。方法用PCR方法获得基因,定向克隆连接到真核表达载体上,得到重组真核表达载体,使用酶切方法加以鉴定。结果酶切得到的片段与所需相符,得到重组的逆转录病毒载体。结论重组小鼠CD1_D基因和B7-1基因真核表达载体的构建为今后进一步的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 cd1d基因 B7—1基因 真核表达载体 RNA提取 重组载体的构建

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慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究

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作者 刘为军 王昆华 +3 位作者 师义 陈贤玉 郭世奎 徐玉 《昆明医科大学学报》 CAS 2013年第3期31-34,共4页

目的构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体... 目的构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞. 展开更多

关键词 cd1d基因 GFP基因 慢病毒 转染

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miR-155、CD1d在胃腺癌患者外周血中的表达及其预后相关性研究 被引量：1

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作者 涂春明 董庆申 柳建垒 《中国处方药》 2021年第7期1-4,共4页

目的检测微小RNA-155(miR-155)和抗原递呈分子CD1d在胃腺癌患者外周血中表达情况,探讨二者的表达关系及临床意义。方法选择2016年1月~2017年6月就诊并进行胃腺癌手术治疗患者55例作为观察组,另选取同期进行健康体检人员56例作为对照组... 目的检测微小RNA-155(miR-155)和抗原递呈分子CD1d在胃腺癌患者外周血中表达情况,探讨二者的表达关系及临床意义。方法选择2016年1月~2017年6月就诊并进行胃腺癌手术治疗患者55例作为观察组,另选取同期进行健康体检人员56例作为对照组。采用qRTPCR法检测各研究对象外周血单个核细胞(PBMCs)miR-155表达水平,流式细胞仪检测表达CD1d的淋巴细胞百分数,分析二者与胃腺癌临床病理特征的关系,Pearson分析胃腺癌患者PBMCs中miR-155与CD1d表达水平的相关性,Kaplan-Meier分析胃腺癌患者术后3年生存情况,Cox分析影响胃腺癌患者预后的危险因素。结果miR-155在胃腺癌患者PBMCs中表达水平显著高于对照组;胃腺癌患者PBMCs中CD1d分子表达的细胞百分数显著低于对照组(P<0.05);miR-155、CD1d表达与肿瘤分化程度、TNM分期淋巴转移及浸润深度有关(P<0.05);胃腺癌患者PBMCs中miR-155和CD1d表达水平呈负相关(r=-0.585,P=0.000);miR-155高表达组患者的3年生存率显著低于miR-155低表达组,CD1d高表达组胃腺癌患者3年累积生存率显著高于低表达组患者(P<0.05);低分化、TNM分期、淋巴结转移、miR-155高表达、CD1d低表达是影响胃腺癌患者不良预后危险因素(P<0.05)。结论胃腺癌患者PBMCs中miR-155高表达、CD1d低表达,与患者生存质量有关,或可作为胃腺癌患者潜在的预后标志物。 展开更多

关键词 微小RNA-155 cd1d 胃腺癌 预后 相关性

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免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

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作者 刘为军 任庆莹 +5 位作者 师义 陈贤玉 郭世奎 雷毅 徐玉 王昆华 《中国现代普通外科进展》 CAS 2013年第3期169-172,共4页

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装... 目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。 展开更多

关键词 cd1d基因 慢病毒 绿色荧光蛋白 基因构建

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CD1d融合蛋白的表达及其在自然杀伤T细胞原代培养中的作用

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作者 刘计荣 赵冰 韩化敏 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期155-160,共6页

目的构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-CD1d-hIgG1-BriA tag,建立稳定表达CD1d融合蛋白的细胞系,并检测该蛋白对体外培养人原代自然杀伤T(natural killing T,NKT)细胞的活化刺激功能,为肿瘤过继性免疫治疗提供新方法。方法从健康人外周... 目的构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-CD1d-hIgG1-BriA tag,建立稳定表达CD1d融合蛋白的细胞系,并检测该蛋白对体外培养人原代自然杀伤T(natural killing T,NKT)细胞的活化刺激功能,为肿瘤过继性免疫治疗提供新方法。方法从健康人外周血提取CD1d全长基因作为目的 DNA片段,与真核表达载体pcDNA3.1(-)分别经双酶切后,酶切产物用T4 DNA连接酶连接,获得重组表达载体,经转染293T细胞、抗性筛选、质粒提取等步骤获得融合的重组质粒。将双酶切鉴定正确的质粒采用磷酸钙转染法导入CHO-K1细胞,经Western blot和ELISA法检测CD1d蛋白的表达,连续培养获得稳定表达CD1d的细胞系,经扩增培养收获培养液后,进行Protien A柱纯化。将纯化的CD1d蛋白用于人外周血经体外分离获得的单个核细胞的连续培养后,进行流式细胞术检测。结果质粒pcDNA3.1(-)-CD1d-hIgG1-BriA tag经双酶切鉴定构建正确。获得1株稳定表达CD1d蛋白的细胞株。纯化后的CD1d蛋白相对分子质量约196 000,能够激活单个核细胞中NKT细胞的扩增,培养第8天,CD3+CD56+NKT细胞显著增加,由培养前的0.30%扩增至4.99%。结论成功构建了pcDNA3.1(-)-CD1d-hIgG1-BriA tag真核表达质粒,建立了高效稳定表达CD1d蛋白的CHO-K1细胞株,为深入研究CD1d蛋白刺激活化NKT细胞奠定了实验基础,进一步证实了CD1d分子体外刺激NKT活化的功能,为最终免疫治疗提供了细胞。 展开更多

关键词 cd1d基因 基因重组 真核表达载体 自然杀伤T细胞

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小鼠CD1d1编码区基因的克隆与鉴定

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作者 黄震 梁晓东 +2 位作者 陈章权 吕世静 迟秀文 《九江学院学报（自然科学版）》 CAS 2008年第3期9-11,共3页

目的:克隆小鼠CD1d1编码区基因。方法:提取小鼠小肠组织总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠CD1d1编码基因,PCR产物连接pGEM-T载体,转化大肠杆菌,用限制性酶切和DNA序列测定对阳性克隆进行鉴定。结果:扩增出一条与预期片段大小相符的特异DNA条带... 目的:克隆小鼠CD1d1编码区基因。方法:提取小鼠小肠组织总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠CD1d1编码基因,PCR产物连接pGEM-T载体,转化大肠杆菌,用限制性酶切和DNA序列测定对阳性克隆进行鉴定。结果:扩增出一条与预期片段大小相符的特异DNA条带,限制性酶切应显示目的基因片段插入T载体,序列测定表明所获取的基因大小为1011bp。结论:成功克隆了小鼠CD1d1编码基因,为进一步重组蛋白及其抗体的制备奠定了基础。 展开更多

关键词 cd1d 基因 克隆 鉴定

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小鼠CD1d2编码区基因的克隆与鉴定

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作者 陈章权 黄震 梁晓东 《现代医药卫生》 2008年第7期953-954,共2页

目的:克隆小鼠CD1d2编码区基因。方法:提取小鼠胸腺组织总RNA,用RT-PCR技术扩增CD1d2cDNA,PCR产物连接pGEM-T载体,转化大肠杆菌,用限制性酶切反应和DNA测序对阳性克隆进行鉴定,用BLAST软件进行序列分析。结果:扩增出一条特异DNA条带,DN... 目的:克隆小鼠CD1d2编码区基因。方法:提取小鼠胸腺组织总RNA,用RT-PCR技术扩增CD1d2cDNA,PCR产物连接pGEM-T载体,转化大肠杆菌,用限制性酶切反应和DNA测序对阳性克隆进行鉴定,用BLAST软件进行序列分析。结果:扩增出一条特异DNA条带,DNA序列测定表明获取了大小为1008bp的小鼠CD1d2基因编码区基因。结论:成功克隆了小鼠CD1d2编码区基因。 展开更多

关键词 小鼠 cd1d2 基因 克隆 鉴定

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恒河猴CD1d基因的克隆及其组织表达差异性分析 被引量：1

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作者 张萍 周慧芳 +3 位作者 孙正华 邵晓丽 张华堂 徐小宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期581-583,共3页

目的:克隆非人灵长类疾病动物模型-恒河猴的CD1d基因并检测其在不同组织中的表达差异情况。方法:提取恒河猴血液及各组织的RNA,以反转录得到的cDNA为模板,用特异性引物扩增CD1d;以管家基因GAPDH为内参,用半定量RT-PCR的方法对CD1d的组... 目的:克隆非人灵长类疾病动物模型-恒河猴的CD1d基因并检测其在不同组织中的表达差异情况。方法:提取恒河猴血液及各组织的RNA,以反转录得到的cDNA为模板,用特异性引物扩增CD1d;以管家基因GAPDH为内参,用半定量RT-PCR的方法对CD1d的组织表达差异性进行分析。结果:成功扩增了恒河猴CD1d基因的编码区序列;首次用半定量RT-PCR的方法检测了CD1d mRNA在恒河猴部分组织中的表达情况,发现其表达水平存在明显的组织差异性,其中,在肝脏、脾脏和心脏中的表达水平较高,在血液、小肠和肺中次之,在脑中表达最少。结论:研究结果为今后表达恒河猴CD1d蛋白并制备其四聚体进而研究恒河猴NKT细胞在众多疾病中的作用奠定了基础;组织表达差异的研究结果提示其在相关疾病的发生发展过程中可能扮演着重要的角色,具体作用还有待深入研究。 展开更多

关键词 cd1d NKT细胞 恒河猴 组织分布

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