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2株云南源BVDV-1b亚型毒株的分离和鉴定 被引量：1
1
作者 崔垚鑫 李聃 +6 位作者 谢佳芮 朱沛 徐心明 岩锐 陈其云 李文贵 姚俊 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第2期40-46,共7页
为探明云南省牛病毒性腹泻黏膜病(BVD-MD)的发生、流行态势及其流行毒株的生物学特征,本试验于2022年12月—2023年11月从云南省10个州市规模化养牛场随机采集667份牛粪便样品,进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检... 为探明云南省牛病毒性腹泻黏膜病(BVD-MD)的发生、流行态势及其流行毒株的生物学特征,本试验于2022年12月—2023年11月从云南省10个州市规模化养牛场随机采集667份牛粪便样品,进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测,针对阳性样品选用牛肾细胞(MDBK)进行毒株的分离和鉴定,结合间接免疫荧光试验(IFA)观察病毒增殖情况,并使用Reed-Muench法计算病毒滴度;阳性样品经全基因组测序后,分别对全基因组和5′非翻译区(5′-UTR)序列进行系统发育分析。结果显示,经RT-PCR和MDBK细胞分离鉴定获得2株BVDV,分别命名为BVDV YN.1(GenBank登录号:PP488512.1)和BVDV YN.2(GenBank登录号:PP770551.1),病毒滴度分别为105.81和104.93 TCID50/mL。系统发育分析结果显示,2株BVDV分离株与美国分离的BVDV-1b亚型参考毒株HP-KY-RK13(GenBank登录号:KT355592.1)的核苷酸相似度分别为99.6%和99.5%,与日本分离的BVDV-1b亚型参考毒株END(GenBank登录号:JX419397.1)的核苷酸相似度均为99.7%,且处于同一进化分支(BVDV-1b亚型)。本试验可为云南省BVDV流行病学调查及对其防控提供理论参考依据。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(bvdv) bvdv-1b亚型 云南 分离和鉴定
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一株牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分离鉴定与全基因序列分析 被引量：1
2
作者 吕香玉 温树波 +6 位作者 赵丽霞 林浩 韩健健 杨芳 郭帅 翟景波 刘锴 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第6期210-215,共6页
探究内蒙古自治区通辽市牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染毒株主要基因型,为BVDV流行病学及防控提供参考依据。试验前期在内蒙古通辽市某牛场采集腹泻犊牛粪便样品经PCR检测,将BVDV阳性的粪便样品处理后接种到牛肾细胞(MDBK)中进行分离,通过R... 探究内蒙古自治区通辽市牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染毒株主要基因型,为BVDV流行病学及防控提供参考依据。试验前期在内蒙古通辽市某牛场采集腹泻犊牛粪便样品经PCR检测,将BVDV阳性的粪便样品处理后接种到牛肾细胞(MDBK)中进行分离,通过RT-PCR、间接免疫荧光染色对分离株进行鉴定,并对其基因组全长进行测序,根据5′UTR、N pro和E2基因序列进行遗传进化分析和基因分型鉴定。结果表明,试验成功分离到一株BVDV毒株,将其命名为NM-21,接种NM-21的MDBK未产生细胞病变,说明该毒株为非细胞病变型(NCP),RT-PCR、间接免疫荧光染色鉴定均为阳性,病毒滴度为10-3 TCID 50/mL。基于基因组全长序列、5′UTR、N pro和E2基因序列的同源性和遗传进化分析,分离株NM-21与中国内蒙古自治区毒株NM2103(GenBank登录号ON337882.1)核苷酸同源性最高,为BVDV-1c亚型。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 bvdv-1c亚型 分离 鉴定 遗传进化分析
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BVDV-2d毒株的分离鉴定及同义密码子使用模式分析
3
作者 杨宣叶 高明阳 +5 位作者 胡欣妍 王进千 王慧慧 丁玉林 曹小安 马晓霞 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期2111-2121,共11页
本研究通过对腹泻犊牛肠道内容物中分离到的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)毒株进行分析,首次确认该毒株为BVDV-2d亚型,命名为22-Gansu-F3。通过病毒分离、鉴定及全基因组测序,本研究不仅探讨了腹泻犊牛肠道的病理变化,还分析了其同义密码子使... 本研究通过对腹泻犊牛肠道内容物中分离到的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)毒株进行分析,首次确认该毒株为BVDV-2d亚型,命名为22-Gansu-F3。通过病毒分离、鉴定及全基因组测序,本研究不仅探讨了腹泻犊牛肠道的病理变化,还分析了其同义密码子使用模式的遗传特征。结果表明,在开放阅读框中,CpG二核苷酸的使用频率显著降低,并且在选择同义密码子的过程中,精氨酸对含CpG同义密码子的使用具有显著抑制作用。为了进一步明确不同功能性蛋白质编码序列的同义密码子使用模式的遗传学特征,本研究比较了不同编码序列的同义密码子使用差异,发现N^(pro)和NS4A的编码区在同义密码子使用上与其他蛋白质显著不同。此外,BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株的不同蛋白质编码区在适应猪、羊和骆驼的同义密码子使用模式上表现出良好的适应性,为这些动物体内病毒蛋白的翻译提供了潜在的物质基础。本研究结果为中国BVDV-2型的进化动态提供了新的理论依据,并为预防该亚型成为中国主要流行亚型提供了早期预警。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 bvdv-2d 病理变化 同义密码子 遗传
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不同生物型BVDV感染宿主细胞后差异基因分析 被引量：2
4
作者 程凯慧 朱彤 +6 位作者 侯佩莉 王洪梅 苗自利 张亮 解晓莉 杨宏军 何洪彬 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第11期3113-3120,共8页
为深入研究牛场中普遍存在的持续性感染,探讨不同生物型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)转化的分子机制,本试验将致细胞病变型BVDV(CP型BVDV)和非致细胞病变型BVDV(NCP型BVDV)感染MDBK细胞,观察细胞变化,感染后12~... 为深入研究牛场中普遍存在的持续性感染,探讨不同生物型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)转化的分子机制,本试验将致细胞病变型BVDV(CP型BVDV)和非致细胞病变型BVDV(NCP型BVDV)感染MDBK细胞,观察细胞变化,感染后12~72h期间每间隔12h收集1次细胞,同时对24、48h收集的细胞进行转录组学分析。结果显示,不同生物型BVDV感染宿主细胞24h后,与感染NCP型BVDV的细胞相比,感染CP型BVDV的MDBK细胞中上调差异表达的基因2 849个,下调差异表达的基因3 347个,48h后,上调差异表达的基因2 933个,下调差异表达的基因2 831个。对差异基因的GO功能分析结果表明,差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性、酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等;Pathway显著性富集分析结果显示,差异表达基因主要参与细胞自噬、细胞凋亡、免疫调节因子等相关的信号通路。本试验结果可为进一步揭示病毒致病的分子机制、控制BVDV和研制其候选疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 致细胞病变型bvdv 非致细胞病变型bvdv 差异基因 GO功能分析 Pathway显著性分析
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人参皂苷Rb1 PLGA纳米颗粒对BVDV灭活疫苗的免疫佐剂作用研究 被引量：1
5
作者 崔珍珍 王晓琳 +10 位作者 凌倩 刘莹玉 胡婷婷 许立慧 范欣莹 梁健 时坤 李建明 宫庆龙 刁乃超 冷雪 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期1183-1190,1195,共9页
为研究聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹人参皂苷Rb1后对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)灭活疫苗的免疫佐剂作用,本实验采用乳化溶剂挥发法制备人参皂苷Rb1 PLGA纳米颗粒(Rb1 PLGA NP),通过透射电镜观察纳米颗粒的形态,采用纳米粒度分析仪分别... 为研究聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹人参皂苷Rb1后对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)灭活疫苗的免疫佐剂作用,本实验采用乳化溶剂挥发法制备人参皂苷Rb1 PLGA纳米颗粒(Rb1 PLGA NP),通过透射电镜观察纳米颗粒的形态,采用纳米粒度分析仪分别测定该纳米颗粒的粒径、分散性指数(PDI)和Zeta电位。结果显示,Rb1 PLGA NP呈表面光滑的球形,粒径分布较窄,平均粒径为287.06 nm,PDI为0.192,Zeta电位为-31.9 mV。分别以Rb1 PLGA NP、Rb1、空白纳米颗粒(BP)及ISA206(对照佐剂)为佐剂制备BVDV灭活疫苗(NP/BVDV、Rb1/BVDV、BP/BVDV及ISA206/BVDV)以及无佐剂的BVDV灭活疫苗,设未免疫的空白对照组。各疫苗均经皮下注射方式免疫小鼠两次。首免后14 d与28 d分别采血并剖杀小鼠分离各组小鼠脾淋巴细胞,采用间接ELISA检测各组小鼠血清中细胞因子以及特异性抗体水平,采用MTT法检测各组小鼠脾淋巴细胞的增殖指数(SI),通过流式细胞术测定CD4^(+)T、CD8^(+)T淋巴细胞的含量并计算二者的比值。细胞因子与抗体水平检测结果显示,免疫后,Rb1 PLGA NP/BVDV组小鼠产生的IL-1β、IL-4和IFN-γ水平均显著高于其余各组,但与ISA206/BVDV组无显著差异(免疫后14 d);免疫后28 d,该组小鼠血清中IL-4和IFN-γ的分泌水平显著低于ISA206/BVDV组,IL-1β的分泌水平与ISA206/BVDV组无显著差异。抗体检测结果显示,Rb1 PLGA NP/BVDV组小鼠的总IgG和IgG1抗体水平显著高于其余各组,但与Rb1/BVDV组和ISA206/BVDV组均无显著差异(免疫后14 d),之后仅与ISA206/BVDV组无显著差异(免疫后28 d)。免疫后PLGA NP/BVDV组小鼠IgG2抗体水平显著高于其余各组,但显著低于ISA206/BVDV组。SI结果显示,在ConA和LPS分别刺激后,Rb1 PLGA NP/BVDV组小鼠脾淋巴细胞的SI均显著高于其余各组,与ISA206/BVDV组无显著差异(ConA刺激)和免疫后14 d显著低于ISA206/BVDV组至免疫后28 d与该组无显著差异(LPS刺激)。流式细胞术结果显示,免疫后Rb1 PLGA NP/BVDV组小鼠CD4^(+)T和CD8^(+)T淋巴细胞的比值均显著高于其余各组,但与ISA 206/BVDV组无显著差异。二免后14 d,采用BVDV JL15强毒株(107.0TCID50/mL)以200μL/只对各组小鼠经腹腔注射方式攻毒,21 d后采用qPCR法检测各组小鼠各脏器的病毒载量,结果显示,Rb1 PLGA NP/BVDV组和ISA 206/BVDV组小鼠各脏器的病毒载量均显著低于其余3组及PBS阴性对照组,但与ISA 206/BVDV组相当,空白对照组小鼠各脏器均未检测到病毒。上述结果表明,Rb1 PLGA NP可以诱导BVDV免疫小鼠产生较强的体液免疫及细胞免疫反应及小鼠脾淋巴细胞的增殖与分化,显著增强BVDV灭活疫苗的免疫保护效力,具有较好的免疫佐剂作用。本研究首次以Rb1 PLGA NP为BVDV灭活疫苗佐剂,为新型疫苗佐剂和BVDV灭活疫苗的研制提供新的思路。 展开更多
关键词 人参皂苷RB1 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 牛病毒性腹泻病毒 佐剂
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川西高原地区牦牛BVDV的检测及遗传进化分析 被引量：4
6
作者 朱杰 罗迪丹 +2 位作者 李彬 王贵平 贾爱卿 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期1196-1202,共7页
为了解川西高原地区牦牛BVDV的感染情况及其遗传进化特征,本研究在川西高原4个牦牛场采集120份表观健康的牦牛鼻拭子,采用RT-PCR方法扩增其BVDV 5'-UTR基因后测序。采用MEGA 7.0软件构建扩增的牦牛源BVDV与GenBank中53株BVDV参考株5... 为了解川西高原地区牦牛BVDV的感染情况及其遗传进化特征,本研究在川西高原4个牦牛场采集120份表观健康的牦牛鼻拭子,采用RT-PCR方法扩增其BVDV 5'-UTR基因后测序。采用MEGA 7.0软件构建扩增的牦牛源BVDV与GenBank中53株BVDV参考株5'-UTR基因的进化树,分析牦牛源BVDV的基因型。采用MegAlign软件分析牦牛源BVDV与上述BVDV参考株5'-UTR基因的同源性。结果显示,120份鼻拭子中,有7份样品扩增到310 bp的5'-UTR基因片段,BVDV的检出率为5.8%(7/120)。7份BVDV阳性样品中测序获得5株BVDV 5'-UTR基因序列。进化树结果显示,5株牦牛源BVDV均为BVDV-1型,且分为3种基因亚型,分别是BVDV-1a 1株、BVDV-1b 3株和BVDV-1v 1株。同源性分析结果显示,1株牦牛源BVDV-1a SCAB01株、3株牦牛源BVDV-1b、1株牦牛源BVDV-1v均与相应基因型BVDV参考株5'-UTR基因的同源性最高,分别为99.8%、97.4%~97.6%及96.8%。采用RT-PCR分段扩增牦牛源BVDV-1a SCAB01株的全基因组序列,采用SeqMan软件拼接获得全长12201 bp的SCAB01株全基因组序列,且具有典型的BVDV基因组结构。利用MEGA 7.0软件构建牦牛源BVDV与37株BVDV参考株全基因组及51株BVDV参考株N^(pro)基因的进化树。采用MegAlign软件分析牦牛源BVDV与BVDV参考株14个基因及全基因组序列的同源性。通过RDP4软件中的7种方法分析牦牛源BVDV全基因组中的重组信号。全基因组和与N^(pro)基因的进化树结果均显示,牦牛源BVDV SCAB03株属于BVDV-1b分支,分别与BVDV-1b IBSP4ncp株(全基因组)及BVDV-1b Osloss株(N^(pro)基因)聚为同一分支;SCAB03株的全基因组序列与12个基因序列均与美国BVDV-1b AV69株的同源性最高达98.2%(全基因组),最低为92.3%(E2)。且SCAB03株与来自我国西南地区的广西和西藏BVDV-1b代表株GX4、XZ02、GXSS01全基因组序列的同源性较高,分别为96.9%、96.7%、96.6%。且在SCAB03株的基因组中未检测到重组信号。本研究首次调查了川西高原表观健康牦牛中BVDV的流行情况,证实BVDV可以存在于健康牦牛的呼吸道中,牦牛源BVDV存在多种基因亚型,具有遗传多样性。本研究有助于了解我国牦牛源BVDV的流行状况,也为研制牦牛BVDV疫苗提供参考依据。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 川西高原 牦牛 流行病学 遗传进化
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一步法RT-PCR检测大缸奶在BVDV清除计划中的应用
7
作者 黄凯 邵晓磊 李锡智 《中国奶牛》 2011年第18期4-7,共4页
本文利用一步法RT-PCR对28个牛场共计50份大缸奶样进行了BVDV核酸检测。在与全群抗原检测结果对比后发现,9个已知存有PI牛的泌乳牛群,其大缸奶核酸检测均为阳性,其余41个已知无PI牛的泌乳牛群,除1个因为存在急性感染牛造成阳性结果外,其... 本文利用一步法RT-PCR对28个牛场共计50份大缸奶样进行了BVDV核酸检测。在与全群抗原检测结果对比后发现,9个已知存有PI牛的泌乳牛群,其大缸奶核酸检测均为阳性,其余41个已知无PI牛的泌乳牛群,除1个因为存在急性感染牛造成阳性结果外,其余40个均为阴性。由此可见,本方法对与泌乳牛群内是否存在PI牛可以做出准确判断,其检测灵敏度和特异性均为100%,阳性预测结果可信度为0.9(9/10),阴性预测结果可信度为0.98(40/41)。此外,针对50个大缸奶样进行的抗体检测表明,对于已感染牛场,泌乳牛群是否存在PI牛,抗体水平没有明显差异(OD1.12±0.12vsOD1.34±0.23,P>0.05)。实验室条件下,本试验使用的RT-PCR方法对于阳性乳的最低检出限为50μL/头,因此理论上,最多可从1000份样品中检出阳性乳成分(总体积为50mL)。综上可知,本试验确立的RT-PCR方法灵敏度高、特异性强,可对泌乳牛群是否存在PI牛进行准确预测,相比大缸奶抗体检测更具实际指导意义,联合ELISA-Ag使用时还可大幅度降低泌乳牛群BVDV清除计划的检测成本,因而值得推广使用。 展开更多
关键词 RT—PCR bvdv—PI牛 大缸奶核酸检测 大缸奶抗体检测 bvdv清除计划
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北京地区规模化牛场BVDV持续感染牛清除方案的初步实施 被引量：16
8
作者 黄凯 张俊杰 +6 位作者 刘英霞 齐长明 邵小磊 马宏磊 马翀 张振新 曹杰 《中国动物检疫》 CAS 2010年第5期34-35,共2页
BVDV持续感染牛(persistently infected,PI)是造成牛群内BVD难以根除的重要原因。为摸清北京地区BVDV-PI牛分布情况,探索BVD清除方案,本次筛查利用抗原捕获ELISA,对北京地区7个规模化奶牛场共14028头荷斯坦奶牛进行BVDV抗原检测。共检... BVDV持续感染牛(persistently infected,PI)是造成牛群内BVD难以根除的重要原因。为摸清北京地区BVDV-PI牛分布情况,探索BVD清除方案,本次筛查利用抗原捕获ELISA,对北京地区7个规模化奶牛场共14028头荷斯坦奶牛进行BVDV抗原检测。共检出PI牛58头,其中成母牛9头,后备牛49头;场内阳性率0.04～1.02%;PI牛与健康牛相比,平均出生体重相差5.9kg(P<0.05),15月龄时体重相差94.6kg(P<0.05),平均初配月龄和首次怀孕月龄分别延迟2.9个月和4.9个月(P<0.05)。结果表明,PI牛个体发育缓慢且繁殖性能低下,但部分牛临床表现正常。以抗原捕获ELISA为主要检测手段的清除方案是控制BVD的有效方法。 展开更多
关键词 bvdv PI牛 抗原捕获ELISA 清除方案
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牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV/MDV)的分子生物学研究进展 被引量：6
9
作者 姜宇 刘亚刚 +2 位作者 吴皎 张金灵 贾清 《西南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2006年第3期559-563,共5页
牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(Bovineviraldiarrheavirus/mucosaldiseasevirus,BVDV/MDV)是引起牛病毒性腹泻/粘膜病的病原,与猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(BDV)同属.其基因组由5′非翻译区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3′非编码... 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(Bovineviraldiarrheavirus/mucosaldiseasevirus,BVDV/MDV)是引起牛病毒性腹泻/粘膜病的病原,与猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(BDV)同属.其基因组由5′非翻译区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3′非编码区(3′NCR)组成,编码结构蛋白P14、gP48、gP25、gP53及几种非结构蛋白.下面就BVD/MD的分子生物学研究进展做一综述,以便给该病的进一步防制奠定理论基础. 展开更多
关键词 bvdv/MDV 基因组 蛋白 NCP/CP
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利用重组E2蛋白检测BVDV血清抗体间接Dot-ELISA方法的建立 被引量：6
10
作者 赵月兰 王建永 +4 位作者 左玉柱 张磊 郭红斌 秦建华 杨汉春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期1093-1096,共4页
利用大肠杆菌表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白作为抗原,建立了检测BVDV血清抗体的间接Dot-ELISA。最佳工作条件为:E2蛋白抗原的最适包被质量浓度2.0 mg/L(2.0 ng/点),酶标抗体的工作浓度为1∶500,血清稀释度为1∶100,3%明胶-TB... 利用大肠杆菌表达的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白作为抗原,建立了检测BVDV血清抗体的间接Dot-ELISA。最佳工作条件为:E2蛋白抗原的最适包被质量浓度2.0 mg/L(2.0 ng/点),酶标抗体的工作浓度为1∶500,血清稀释度为1∶100,3%明胶-TBS作为封闭液,封闭45 min效果最佳。通过重复性试验、交叉试验、特异性试验和稳定性试验等证明,该方法重复性好、特异性强、灵敏度高;与用BVDV全病毒为抗原的IDEXX ELISA试剂盒相比,特异性96.67%,灵敏度90%,符合率95%。应用建立的检测方法对河北省4个奶牛场采集的178份腹泻奶牛血清样本进行检测,结果BVDV血清抗体阳性率40.45%,与IDEXX ELISA试剂盒的检出率无明显差异。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(bvdv) E2重组蛋白 间接Dot—ELISA
原文传递
荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测BVDV方法的建立及应用比较 被引量：7
11
作者 段进刚 樊新丽 +5 位作者 葛婷 卞赛赛 高窦 代婧 阿热阿依.海依拉提 雷程红 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第10期170-174,179,共6页
为建立一种快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的方法,试验采用RT-LAMP和荧光定量RT-PCR两种检测方法,与通用RT-PCR方法在特异性、灵敏性、样品检出率、试验设计复杂程度、扩增反应效率、使用仪器简单... 为建立一种快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的方法,试验采用RT-LAMP和荧光定量RT-PCR两种检测方法,与通用RT-PCR方法在特异性、灵敏性、样品检出率、试验设计复杂程度、扩增反应效率、使用仪器简单程度和检测成本高低七个方面对BVDV进行了综合性比较分析。结果表明:试验建立的RT-LAMP方法与荧光定量RT-PCR、通用RTPCR方法相比具有特异性强、灵敏度高、样品检出率和扩增反应效率高、操作简便快速、低成本等特点。说明RT-LAMP方法对快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病、防止疫情的扩散具有重要意义。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral DIARRHEA virus bvdv) 牛病毒性腹泻病 荧光定量RT-PCR RT-LAMP 通用RT-PCR 快速检测
原文传递
BVDV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法与RT-PCR方法的建立与应用 被引量：4
12
作者 马鹏 李林杰 +5 位作者 常秋燕 王悦萦 郭富城 刘萍 马晓霞 马忠仁 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2017年第A01期49-53,共5页
利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的R... 利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(bvdv) RT-PCR SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 应用
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分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立 被引量：4
13
作者 王新华 沈敏 +2 位作者 周鹏飞 钟发刚 温建新 《西北农业学报》 CAS CSCD 1999年第3期1-4,共4页
用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ） 感染ＭＤＢＫ 细胞，将感染细胞培养物冻融后离心取上清经ＰＥＧ 沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取血清抗体效价高的免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ 细胞在ＰＥＧ作用下融合，产生杂交瘤细胞，用间接... 用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ） 感染ＭＤＢＫ 细胞，将感染细胞培养物冻融后离心取上清经ＰＥＧ 沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取血清抗体效价高的免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ 细胞在ＰＥＧ作用下融合，产生杂交瘤细胞，用间接ＥＬＩＳＡ 法检测杂交瘤细胞生长孔上清，筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀释法克隆２ ～３次，得到８ 株分泌抗ＢＶＤＶ 的单克隆抗体（ＭｃＡｂ） 杂交瘤细胞株。８ 株ＭｃＡｂ 对ＢＶＤＶ、猪瘟（ＣＳＦＶ） 均呈阳性反应。杂交瘤细胞核内染色体数为９８～１０５ 条。ＭｃＡｂ 属性为：６ 株属ＩｇＧ１ ，２ 株属ＩｇＧ２ａ 。经抗原结合位点分析，８ 株ＭｃＡｂ 可识别３ 个不同的抗原决定位点。将杂交瘤细胞注射ＢＡＬＢ／Ｃ 小鼠腹腔诱生腹水，其抗体效价提高３ ２００ 倍以上，有３ 株腹水单抗的ＥＬＩＳＡ 效价在１∶１０ 万以上，最高ＭｃＡｂ 株达１∶２０ 万。杂交瘤在液氮中保存１～２ ａ 后复苏仍能稳定地分泌抗ＢＶＤ 病毒的ＭｃＡｂ 。所有腹水ＭｃＡｂ 对ＢＶＤＶ 的中和指数均大于５０（ｌｏｇ１０１ ．７），最高达５０１１８（ｌｏｇ１０４．７） 。ＭｃＡｂ 展开更多
关键词 单克隆抗体 bvdv BDV CSFV
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BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究 被引量：4
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作者 刘昱成 孟庆玲 +5 位作者 乔军 王国超 张倩 贺志昊 杨海波 陈创夫 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2013年第6期680-683,共4页
为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SW E2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21(DE3)表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化入大肠埃希氏菌中。用IPT... 为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SW E2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21(DE3)表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化入大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDSPAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。 展开更多
关键词 bvdv E2基因 载体构建 原核表达
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抗BVDV卵黄抗体的制备 被引量：5
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作者 邓宇 王新华 +4 位作者 郭燕 钟发刚 荣光 夏伦斌 陈琛 《家畜生态学报》 2007年第1期75-78,共4页
采用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)免疫产蛋母鸡,然后用水稀释法成功地从卵黄中分离出抗BVDV免疫球蛋白(抗-BVDV IgY)。建立起测定鸡蛋中特异性抗BVDV活性的间接ELISA方法,并采用此方法检测每次免疫后第10天的抗体滴度。结果表明,蛋鸡在首次... 采用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)免疫产蛋母鸡,然后用水稀释法成功地从卵黄中分离出抗BVDV免疫球蛋白(抗-BVDV IgY)。建立起测定鸡蛋中特异性抗BVDV活性的间接ELISA方法,并采用此方法检测每次免疫后第10天的抗体滴度。结果表明,蛋鸡在首次免疫后第10天,卵黄中可以检测到抗-BVDV IgY;5次免疫后,抗体效价达到1:6400,半年后仍能维持在该水平。 展开更多
关键词 bvdv IGY 间接ELISA
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BVDV-2 E2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 被引量：2
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作者 刘昱成 王国超 +6 位作者 孟庆玲 乔军 才学鹏 贺志昊 杨海波 万鹏 陈创夫 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期30-34,共5页
根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆SW分离株E2基因进行RT-PCR扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入华赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-E2。用SalⅠ酶切线性化重组质粒pPIC9K-E2,电... 根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆SW分离株E2基因进行RT-PCR扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入华赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-E2。用SalⅠ酶切线性化重组质粒pPIC9K-E2,电转化酵母GS115,通过G418筛选重组酵母菌GS115-pPIC9K-E2,用φ=1.5%甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为23.2ku;Western blot分析表明,该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 bvdv E2基因 载体构建 真核表达
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人参皂苷抗梅花鹿源BVDV研究 被引量：4
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作者 李玉赜 张连学 +2 位作者 姚允怡 齐宪辉 郜玉钢 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第23期14036-14036,14044,共2页
[目的]研究人参皂苷抗BVDV作用,为人参的开发与利用提供参考。[方法]采用中性红染料法,研究了人参皂苷的抗BVDV作用。[结果]人参皂苷对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是12.80μg/m l,在1.60～12.80μg/m l范围内人参皂苷抗BVDV效果显著。... [目的]研究人参皂苷抗BVDV作用,为人参的开发与利用提供参考。[方法]采用中性红染料法,研究了人参皂苷的抗BVDV作用。[结果]人参皂苷对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是12.80μg/m l,在1.60～12.80μg/m l范围内人参皂苷抗BVDV效果显著。[结论]人参皂苷具有显著的抗BVDV病毒作用,在安全浓度范围内,人参皂苷抗病毒的作用随浓度的提高而增强。 展开更多
关键词 人参皂苷 梅花鹿 抗病毒 bvdv
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BVDV基因E_0在人参发根的转化及其分子检测 被引量：2
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作者 李然 臧埔 +5 位作者 郜玉钢 马琳 王亚星 李学 李萍 张连学 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2011年第10期239-242,共4页
将重组鹿源BVDV基因E0植物表达载体(pBI121/E0),通过发根农杆菌Ri介导,用叶盘法转化得到人参发根,分别用PCR、RT-PCR检测其转化情况。结果表明:获得了转鹿源BVDV基因E0人参发根,鹿源BVDV基因E0已整合到人参发根基因组中并得到了转录,为... 将重组鹿源BVDV基因E0植物表达载体(pBI121/E0),通过发根农杆菌Ri介导,用叶盘法转化得到人参发根,分别用PCR、RT-PCR检测其转化情况。结果表明:获得了转鹿源BVDV基因E0人参发根,鹿源BVDV基因E0已整合到人参发根基因组中并得到了转录,为研制转基因人参发根疫苗提供了科学依据和材料。 展开更多
关键词 bvdv E0基因 人参发根 RT-PCR
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青海牦牛BVDV E0基因的表达与抗原性检测 被引量：2
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作者 王光华 叶成玉 +5 位作者 蔡其刚 王戈平 陆艳 张芳芳 马利青 周继章 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2013年第4期12-14,共3页
将青海牦牛病毒性腹泻病毒(BVDV)QHZK株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(α),构建了重组表达载体pET-32(α)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,West... 将青海牦牛病毒性腹泻病毒(BVDV)QHZK株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(α),构建了重组表达载体pET-32(α)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠杆菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为BVDV亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 bvdv E0基因 原核表达 抗原性
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五味子乙素抗梅花鹿源BVDV的实验研究 被引量：7
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作者 王英范 郜玉钢 +2 位作者 刘雅婧 马立春 张连学 《特产研究》 2006年第2期5-8,共4页
采用中性红染料法,测定了五味子乙素对MDBK细胞的最大安全浓度,探讨了五味子乙素抗梅花鹿源BVDV病毒的作用。结果表明:五味子乙素对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是19.53μg/mL;五味子乙素具有显著抗梅花鹿源BVDV作用,且有一定的量效关... 采用中性红染料法,测定了五味子乙素对MDBK细胞的最大安全浓度,探讨了五味子乙素抗梅花鹿源BVDV病毒的作用。结果表明:五味子乙素对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是19.53μg/mL;五味子乙素具有显著抗梅花鹿源BVDV作用,且有一定的量效关系,在安全浓度范围内,随浓度的提高,五味子乙素抗病毒的作用增强。 展开更多
关键词 五味子乙素 梅花鹿 抗病毒 bvdv
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