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基于Sf9细胞培养表达鸭短喙侏儒综合征病毒VP2蛋白的工艺优化
1
作者 甘辉群 王永娟 +3 位作者 吴双 傅宏庆 谭菊 刘明生 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第9期87-92,共6页
旨在获得高表达的鸭短喙侏儒综合征病毒VP2抗原蛋白。本试验通过对接毒与表达工艺中pH值、Sf9细胞密度、接毒量、收获时间、搅拌转速和溶氧值等参数进行优化,考察VP2重组杆状病毒的增殖情况,收获病毒液,测定病毒含量变化;同时,对培养物... 旨在获得高表达的鸭短喙侏儒综合征病毒VP2抗原蛋白。本试验通过对接毒与表达工艺中pH值、Sf9细胞密度、接毒量、收获时间、搅拌转速和溶氧值等参数进行优化,考察VP2重组杆状病毒的增殖情况,收获病毒液,测定病毒含量变化;同时,对培养物进行VP2蛋白SDS-PAGE和Western blot分析,并采用SDS-PAGE灰度扫描测定蛋白含量。结果:在pH值维持6.8~7.2,接毒密度为1.0×10^(6)~2.0×10^(6)个/mL,感染复数(MOI)值为0.01~0.1,收获时间为接种后5~7 d,转速100~140 r/min,溶氧度控制在40%~80%时,重组杆状病毒生长较好,含量较高,达10^(7.7)~10^(8.5) TCID_(50)/mL;均出现约65 kDa目的条带,蛋白表达量基本一致,达57μg/mL以上。根据优化的工艺参数在5 L反应器进行5批抗原生产验证,VP2蛋白表达量达58~63μg/mL,蛋白生产稳定,表达量高。 展开更多
关键词 鸭短喙侏儒综合征 重组杆状病毒 sf9细胞 接毒工艺 表达生产工艺
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家蝇乙酰胆碱酯酶在杆状病毒介导的Sf9细胞中表达
2
作者 伍全根 张秀娟 孙英健 《中国农学通报》 2025年第32期109-115,共7页
本研究旨在利用基因重组技术与杆状病毒介导的Sf9昆虫细胞表达系统,实现家蝇乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性表达,为将其开发为杀虫剂残留检测试剂及昆虫抗药性分析提供基础。以含家蝇AChE基因(Md-ache)的pcDNA3.1-Md-ache质粒为模板,通过PCR... 本研究旨在利用基因重组技术与杆状病毒介导的Sf9昆虫细胞表达系统,实现家蝇乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性表达,为将其开发为杀虫剂残留检测试剂及昆虫抗药性分析提供基础。以含家蝇AChE基因(Md-ache)的pcDNA3.1-Md-ache质粒为模板,通过PCR扩增引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,构建重组质粒Peasy-T1-Md-ache,进一步与pFastBac1载体连接获得重组质粒pFastBac1-Md-ache,转染DH10Bac感受态细胞后筛选得到重组bacmid质粒,再转染Sf9细胞进行蛋白表达与鉴定。结果表明:(1)重组bacmid质粒在Sf9细胞中成功包装,转染后细胞出现体积增大、增殖抑制等典型病变;(2)重组家蝇AChE具有催化活性,细胞裂解液中酶活性达44.7±2.3 nmol/(min·mg protein),培养液中检测到10.1±2.1 nmol/(min·mL)的酶活性,提示存在分泌性表达;(3)经Lineweaver-Burk双倒数作图法测定,重组AChE的Km值为15.69±1.75µmol/L,对底物亲和力较高;(4)有机磷杀虫剂毒死蜱可体外抑制该重组AChE活性,经改良寇氏法计算半数抑制浓度(IC_(50))为11.18±0.68µmol/L。本研究证实,杆状病毒介导的Sf9细胞表达系统可高效表达具有催化活性与杀虫剂敏感性的家蝇AChE,其表达产物为杀虫剂残留检测试剂开发及昆虫抗药性机理分析提供了关键材料。 展开更多
关键词 家蝇 乙酰胆碱酯酶 ache基因 基因重组 杆状病毒表达系统 sf9细胞 有机磷杀虫剂 氨基甲酸酯杀虫剂
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草地贪夜蛾Sf9细胞外泌体microRNA调控AcMNPV增殖的研究
3
作者 田伟彬 张以农 +2 位作者 任菲菲 严寄铭 孙京臣 《华南农业大学学报》 北大核心 2025年第2期133-140,共8页
【目的】探究草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9细胞外泌体microRNA(miRNA)对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)增殖的影响。【方法】通过不连续蔗糖质量分数梯度超速离心纯... 【目的】探究草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9细胞外泌体microRNA(miRNA)对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)增殖的影响。【方法】通过不连续蔗糖质量分数梯度超速离心纯化外泌体,随后利用透射电镜观察和纳米颗粒跟踪分析技术对纯化产物进行颗粒直径分析。运用sRNA高通量测序技术筛选AcMNPV感染Sf9细胞后外泌体差异表达的miRNA并预测其潜在靶基因对应的生物学通路。通过转染模拟物(mimic)和病毒感染等细胞试验以及qPCR验证外泌体miRNA的差异表达,并检测差异表达miRNA——sfr-miR-1a-3p对AcMNPV增殖的影响。【结果】成功纯化Sf9细胞外泌体,且AcMNPV感染有效刺激Sf9细胞外泌体的分泌量增加。AcMNPV感染Sf9细胞72 h后,经与Rfam数据库比对,筛选出11个差异表达的外泌体miRNAs,其中,8个miRNAs的转录水平与测序结果趋势一致。通过预测miRNAs靶基因和KEGG富集分析,发现潜在的靶基因主要富集在cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症通路、人乳头瘤病毒信号通路等,这表明差异表达外泌体miRNA可能参与昆虫天然免疫反应。过表达sfrmiR-1a-3p能显著提高AcMNPV病毒vp39基因的表达。【结论】本研究通过sRNA测序筛选了AcMNPV感染后Sf9细胞外泌体的差异表达miRNA,证明了AcMNPV通过促进外泌体分泌,协助被感染细胞传递miRNA−sfr-miR-1a-3p来影响周围未感染细胞,以促进自身增殖。以上结果为昆虫外泌体传递miRNA以调控病毒增殖的机制研究提供了重要的理论依据。 展开更多
关键词 草地贪夜蛾 sf9细胞 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 外泌体 microRNA sfr-miR-1a-3p
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喜树碱诱导的草地贪夜蛾Sf9细胞凋亡 被引量：7
4
作者 王文祥 钟国华 +2 位作者 胡美英 黄劲飞 葛萃萃 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期894-901,共8页
传统植物源杀虫剂喜树碱具有优异的抑制昆虫生长发育活性,其诱导昆虫细胞凋亡的作用方式和机制尚不明确,极大地限制了喜树碱在植物保护领域的应用开发。本研究以1μmol/L喜树碱诱导草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda Sf9细胞呈现细胞皱缩... 传统植物源杀虫剂喜树碱具有优异的抑制昆虫生长发育活性,其诱导昆虫细胞凋亡的作用方式和机制尚不明确,极大地限制了喜树碱在植物保护领域的应用开发。本研究以1μmol/L喜树碱诱导草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda Sf9细胞呈现细胞皱缩、微绒毛消失和染色质边集等典型细胞凋亡早期超微结构形态特征,中期凋亡小体逐渐出现并急剧增多,DNA电泳分析可见清晰DNA片段化凋亡特征。流式细胞术分析表明1μmol/L喜树碱诱导Sf9细胞12h凋亡率达到最大值39.67%,是对照的13.13倍,随后减小。喜树碱诱导Sf9细胞凋亡在12h和24h时Sf caspase-1分别出现两个活性高峰,表明其作为效应因子在细胞凋亡级联反应过程中具有影响作用。喜树碱显著抑制Sf9细胞拓扑异构酶Ⅰ活性,阻断解旋负超螺旋pBR322DNA,导致DNA损伤进而启动细胞凋亡级联反应使Sfcaspase-1活性增加,提示其信号转导过程是细胞凋亡诱导机制之一。本研究通过分析喜树碱的诱导昆虫Sf9细胞凋亡,对揭示喜树碱诱导昆虫细胞凋亡的作用机制具有重要启示和帮助。 展开更多
关键词 草地贪夜蛾 喜树碱 sf9细胞 细胞凋亡 级联反应 流式细胞术
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不同杀虫成分对Sf9细胞凋亡的影响 被引量：6
5
作者 贾建文 黄劲飞 +2 位作者 王文祥 胡美英 钟国华 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期29-35,共7页
通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15-1.50μg/mL... 通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15-1.50μg/mL处理后72 h内、喜树碱0.35-3.50μg/mL处理后36 h,Sf9细胞产生大量典型凋亡小体,处理时间延长或剂量加大则以造成细胞坏死为主;DNA电泳产生典型的DNA Ladder,表明印楝素和喜树碱对Sf9具有明显的细胞凋亡诱导作用.印楝素1.5μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后24-48 h,喜树碱0.35-3.50μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后12 h.苦参碱、氟铃脲、毒死蜱、灭多威、氯氰菊酯以0.1-10.0μg/mL及昆虫蜕皮激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone）以0.048-4.800μg/mL处理后72 h内对Sf9均无明显的细胞凋亡诱导作用.杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导效应随供试化合物、细胞种类、处理剂量、处理时间而异. 展开更多
关键词 细胞凋亡 草地贪夜蛾细胞系sf9 印楝素 喜树碱
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印楝素A诱导Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化 被引量：4
6
作者 程杏安 黄劲飞 +2 位作者 胡美英 胡黎明 张颜博 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期52-58,共7页
利用倒置显微镜和透射电子显微镜技术观察印楝素A诱导草地贪夜蛾Spodoptera frugperda蛹卵巢Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化.结果表明：1.5μg.mL-1印楝素A对Sf9细胞具有显著的凋亡诱导作用,从凋亡小体和贴壁细胞数量变化判断,印楝素... 利用倒置显微镜和透射电子显微镜技术观察印楝素A诱导草地贪夜蛾Spodoptera frugperda蛹卵巢Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化.结果表明：1.5μg.mL-1印楝素A对Sf9细胞具有显著的凋亡诱导作用,从凋亡小体和贴壁细胞数量变化判断,印楝素A处理12 h,细胞开始出现少量凋亡小体,12~24 h凋亡小体逐渐增多,但贴壁细胞未见明显减少,因此24 h之前（0~24 h）属于凋亡早期阶段;24~36 h凋亡小体大量出现,贴壁细胞逐渐减少,属于凋亡中期;处理36 h以上,凋亡小体和贴壁细胞急剧减少,细胞凋亡进入晚期.观察诱导24 h的细胞超微结构发现,胞内的主要细胞器在数量或形态上发生了显著变化,包括溶酶体数量显著增加,线粒体内部嵴变模糊,内质网从囊泡状变成线管状,细胞核出现分页、皱缩以及区域性膨大等. 展开更多
关键词 细胞凋亡 凋亡小体 印楝素A 超微结构 sf9细胞系
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Sf9昆虫细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立 被引量：6
7
作者 王宁 佟雪莲 +4 位作者 边雅静 周思杭 李静 王奔 唐玉龙 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第5期716-719,共4页
目的建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白（host cell protein,HCP）含量双抗体夹心ELISA检测方法。方法从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间... 目的建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白（host cell protein,HCP）含量双抗体夹心ELISA检测方法。方法从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的最适工作条件。确定该方法的最佳线性范围及最低检测限,验证该方法的准确度及精密度。将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性。与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性。结果纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶10 000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心法ELSA方法最佳抗体包被浓度为20μg/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值。该方法的最佳线性范围为50～1 600 ng/ml,最低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8%～117%之间,变异系数均小于10%;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品。结论已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量。 展开更多
关键词 sf9昆虫细胞 宿主蛋白 双抗体夹心酶联免疫吸附测定
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抗黄曲霉毒素B1单链抗体在Sf9昆虫细胞中的表达与性质分析 被引量：3
8
作者 刘爱平 李诚 +2 位作者 刘书亮 王小红 陈福生 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期40-45,共6页
目的:在原核表达抗黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)单链抗体(single chain Fv fragment,sc Fv)研究的基础上,为进一步了解和提高抗AFB1 sc Fv的活性,利用Sf9昆虫细胞表达抗AFB1sc Fv,并对其活性进行探索研究。方法:构建p Fast Bac 1-sc... 目的:在原核表达抗黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)单链抗体(single chain Fv fragment,sc Fv)研究的基础上,为进一步了解和提高抗AFB1 sc Fv的活性,利用Sf9昆虫细胞表达抗AFB1sc Fv,并对其活性进行探索研究。方法:构建p Fast Bac 1-sc Fv2E6VHVL重组质粒,将重组质粒转化Escherichia coli(E.coli)DH10Bac细胞,进行蓝白斑筛选,挑取阳性克隆。提取相应的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid侵染Sf9昆虫细胞,表达sc Fv,利用镍亲和层析法纯化sc Fv,并以ELISA检测sc Fv活性。结果:蓝白斑筛选后,经菌落PCR和测序验证挑取的白斑阳性单克隆含有正确的单链抗体基因。提取相应的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid侵染Sf9昆虫细胞,通过Western blot检测得知抗AFB1 sc Fv在Sf9昆虫细胞中成功表达。AFB1对sc Fv的抑制中浓度(IC50)为30μg/ml。结论:与E.coli BL21(DE3)表达系统相比,sc Fv灵敏度转好,但仍有较大提升空间。 展开更多
关键词 AFB1 ELISA sf9细胞 SCFV
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昆虫细胞Sf9在四种生物反应器中的培养 被引量：5
9
作者 谢秋玲 郑云程 廖美德 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期96-100,共5页
昆虫细胞表达系统已广泛的应用于表达各种重组蛋白,研究昆虫细胞Sf9分别在4种生物反应器:转瓶、摇瓶、Bellocell反应器、发酵罐中进行悬浮培养.转瓶、摇瓶、Bellocell和发酵罐的细胞接种密度都是5×105/mL.对细胞数量、葡萄糖浓度... 昆虫细胞表达系统已广泛的应用于表达各种重组蛋白,研究昆虫细胞Sf9分别在4种生物反应器:转瓶、摇瓶、Bellocell反应器、发酵罐中进行悬浮培养.转瓶、摇瓶、Bellocell和发酵罐的细胞接种密度都是5×105/mL.对细胞数量、葡萄糖浓度以及主要代谢产物乳酸、氨的浓度进行检测.昆虫细胞经转瓶和摇瓶培养,细胞密度达到最高分别为:5.5×106、7.3×106/mL,是起始密度的11倍和14.6倍.昆虫细胞经Bellocell和发酵罐培养,细胞密度达到最高分别为:8.01×106、1.52×107/mL,是起始密度的16.02倍和30.4倍.昆虫细胞经四种生物反应器中的悬浮培养之后,都达到了很高的密度,尤其是经发酵罐培养达到如此高密度,为高效大规模表达药物蛋白,奠定重要的基础. 展开更多
关键词 昆虫细胞sf9 转瓶 摇瓶 Bellocell反应器 发酵罐
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30种吗啉化合物对昆虫细胞Spodoptera frugiperda(Sf9)的毒力筛选 被引量：3
10
作者 张新刚 史冠莹 +2 位作者 何利钦 陶科 侯太平 《农药》 CAS 北大核心 2012年第4期301-303,共3页
[目的]利用Spodoptera frugiperda(Sf9)细胞,测定30种吗啉化合物的毒力,研究化合物对细胞周期的影响。[方法]毒力测定采用MTT法,用流式细胞仪进行细胞周期测定。[结果]30种化合物中有27种化合物对Sf9细胞有抑制效果,其中吗啉丙烯酮类化... [目的]利用Spodoptera frugiperda(Sf9)细胞,测定30种吗啉化合物的毒力,研究化合物对细胞周期的影响。[方法]毒力测定采用MTT法,用流式细胞仪进行细胞周期测定。[结果]30种化合物中有27种化合物对Sf9细胞有抑制效果,其中吗啉丙烯酮类化合物A3、A4、A6的抑制率超过50%,分别为(69.5±1.54)%、(67.9±1.87)%与(53.6±0.98)%。用50μmol/L的化合物A3处理Sf9细胞后,有凋亡小体出现。同时,化合物A3能干扰细胞正常的增殖周期,使部分细胞被阻滞在DNA合成期(S期)。[结论]化合物A3、A4、A6对Sf9细胞有较强的抑制作用,化合物A3可以干扰正常的细胞周期,并引发细胞凋亡。 展开更多
关键词 sf9 毒力 MTT法 细胞周期
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FOXO基因对印楝素诱导sf9细胞凋亡的影响 被引量：3
11
作者 邵雪花 赖多 匡石滋 《广东农业科学》 CAS 2021年第11期96-102,共7页
【目的】探讨印楝素(azadirachtin,AZA)通过转录因子FOXO诱导草地贪夜蛾卵巢细胞sf9凋亡的分子机制。【方法】将体外培养的草地贪夜蛾卵巢细胞分为AZA处理组和未处理组,采用CCK-8法检测AZA对sf9细胞增殖的影响;透射电镜观察sf9细胞的超... 【目的】探讨印楝素(azadirachtin,AZA)通过转录因子FOXO诱导草地贪夜蛾卵巢细胞sf9凋亡的分子机制。【方法】将体外培养的草地贪夜蛾卵巢细胞分为AZA处理组和未处理组,采用CCK-8法检测AZA对sf9细胞增殖的影响;透射电镜观察sf9细胞的超微结构变化;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞;Western blot检测p-FOXO及凋亡相关蛋白的表达情况;RNAi FOXO后,检测FOXO基因表达量与Caspase-3的酶活性变化。【结果】CCK-8检测发现AZA可显著抑制sf9细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;通过透射电镜检测到5 mmol/L AZA可破坏sf9细胞的微观结构,导致细胞核收缩,染色质聚集,细胞质空泡状;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞,发现AZA诱导sf9细胞凋亡与时间呈正相关;进一步通过Western blot检测凋亡相关蛋白,发现AZA可诱导凋亡相关蛋白Bim和Cleaved Caspase-3的表达水平显著增加,而P-FOXO蛋白表达量降低,FOXO总蛋白表达无明显差异;利用qRT-PCR进一步检测发现,FOXO基因表达量与AZA处理时间呈正相关,在此基础上通过RNAi技术沉默FOXO后,经AZA处理发现Caspase-3的酶活性显著降低。【结论】AZA可通过上调FOXO基因抑制草地贪夜蛾卵巢细胞sf9的增殖并诱导其凋亡。 展开更多
关键词 印楝素 sf9细胞 细胞增殖 细胞凋亡 FOXO基因
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斑蝥素诱导草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9凋亡的临界条件 被引量：9
12
作者 张来喜 杨宝东 +3 位作者 张民照 王进忠 张爱环 张志勇 《北京农学院学报》 2011年第2期14-17,共4页
为进一步利用昆虫细胞研究斑蝥素对鳞翅目昆虫的毒杀机理,采用细胞形态学观察法和DNA凝胶电泳法研究斑蝥素诱导草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9细胞凋亡的临界条件。结果表明:供试细胞凋亡率与斑蝥素处理剂量、时间呈... 为进一步利用昆虫细胞研究斑蝥素对鳞翅目昆虫的毒杀机理,采用细胞形态学观察法和DNA凝胶电泳法研究斑蝥素诱导草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9细胞凋亡的临界条件。结果表明:供试细胞凋亡率与斑蝥素处理剂量、时间呈现密切相关性;在较低剂量处理下,可观察到细胞凋亡。当斑蝥素质量浓度达到6.25μg/mL,处理细胞3 h或3.125μg/mL处理细胞12 h时,斑蝥素处理Sf9导致细胞出现明显畸形、形成凋亡小体等凋亡症状。DNA Ladder条件要求严格,在冰浴条件下,当斑蝥素处理质量浓度达到6.25μg/mL处理细胞24 h时,或者12.5μg/mL处理细胞12 h时,可观察到明显的DNA梯度条带。 展开更多
关键词 斑蝥素 草地贪夜蛾 凋亡 临界条件 sf9
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白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞Sf9中的表达 被引量：2
13
作者 亓倩 于淑惠 +4 位作者 孙涛 王雪庆 刘博文 杨璞 陈晓鸣 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2016年第2期191-195,共5页
[目的]本研究欲利用Bac-to-Bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS。[方法]将WS编码序列克隆到质粒p FastBac^(TM)HT B后,转化大肠杆菌DH10Bac^(TM),经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒r Bacmid/Epel WS。将r Bacmid/EpelWS转染Sf9细胞。[结果]... [目的]本研究欲利用Bac-to-Bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS。[方法]将WS编码序列克隆到质粒p FastBac^(TM)HT B后,转化大肠杆菌DH10Bac^(TM),经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒r Bacmid/Epel WS。将r Bacmid/EpelWS转染Sf9细胞。[结果]免疫荧光标记检测表明:WS在受感染细胞的细胞质中表达。[结论]本研究成功表达了白蜡虫WS,为白蜡虫WS的生化特性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 白蜡虫 蜡酯合酶 载体构建 Bac-to-Bac表达系统 sf9细胞系
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草地贪夜蛾Sf9细胞对饥饿诱导自噬的响应 被引量：1
14
作者 谢昆 王丽仙 +4 位作者 王靖 朱灵明 尹建华 叶青霞 孙艳 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2017年第3期91-95,共5页
为研究草地贪夜蛾对饥饿诱导自噬的响应。从草地贪夜蛾EST数据库中筛选到一段核苷酸序列,设计特异性引物,RT-PCR技术从草地贪夜蛾Sf9细胞中扩增该核苷酸序列,经过生物信息学分析该序列与昆虫自噬相关基因ATG8同源性最高,命名为SfATG8基... 为研究草地贪夜蛾对饥饿诱导自噬的响应。从草地贪夜蛾EST数据库中筛选到一段核苷酸序列,设计特异性引物,RT-PCR技术从草地贪夜蛾Sf9细胞中扩增该核苷酸序列,经过生物信息学分析该序列与昆虫自噬相关基因ATG8同源性最高,命名为SfATG8基因,并构建了pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8载体转染Sf9细胞。Sf9细胞经饥饿(PBS)诱导4 h后,Lyso-Tracker染色、Western Blotting、共聚焦显微镜检测细胞对自噬的响应程度。结果表明,经饥饿(PBS)诱导4 h的Sf9细胞中出现Sf Atg8-PE的表达,共聚焦显微镜检测到Sf9细胞膜上的自噬小体。以上证据证实饥饿(PBS)能诱导Sf9细胞发生自噬,为深入研究Sf9细胞对自噬的响应奠定了基础。 展开更多
关键词 草地贪夜蛾 sf9 饥饿 自噬
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昆虫细胞(Sf9)培养中葡萄糖、乳酸的影响 被引量：1
15
作者 徐殿胜 陈国豪 +1 位作者 陆兵 俞俊棠 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第4期508-510,共3页
昆虫细胞培养已经在小儿灰髓炎、乙肝表面抗原等研究中得到系统应用,此外,许多高值的治疗性蛋白药物,如tPA、白细胞介素-2、β-干扰素和促红细胞生成素等的研究过程中昆虫细胞及杆状病毒的培养已成为新的生物工程手段。在美国、荷兰等... 昆虫细胞培养已经在小儿灰髓炎、乙肝表面抗原等研究中得到系统应用,此外,许多高值的治疗性蛋白药物,如tPA、白细胞介素-2、β-干扰素和促红细胞生成素等的研究过程中昆虫细胞及杆状病毒的培养已成为新的生物工程手段。在美国、荷兰等国已成功地得到了外源基因大量表达的药物。在我国也已成功构建了人-α干扰素的昆虫细胞/杆状病毒表达系统。同时昆虫杆状病毒本身可以制备成各种专一性较强的广谱、无公害、无毒性的的农用杀虫剂。 展开更多
关键词 昆虫 细胞培养 葡萄糖 乳酸
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猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达 被引量：1
16
作者 王文秀 沈志强 +3 位作者 王善辉 张松林 池贤凤 夏小静 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第10期53-57,共5页
本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆... 本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 ORF2基因 sf9昆虫细胞 表达
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Autotaxin在sf9昆虫细胞的表达及纯化研究 被引量：1
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作者 赵峰梅 潘薇薇 +3 位作者 曹鹏程 赵亚蕊 何永吉 赵邑 《中国生化药物杂志》 CAS 2017年第1期34-38,共5页
目的 通过sf9昆虫细胞表达人Autotaxin（ATX）,获得具有生物学活性的目的蛋白。方法 采用TRIzol法提取人的黑色素瘤细胞总RNA,通过RT-PCR获得人ATX基因,构建p Fast BacTMHTA-ATX,Bacmid-ATX重组质粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获重组ATX... 目的 通过sf9昆虫细胞表达人Autotaxin（ATX）,获得具有生物学活性的目的蛋白。方法 采用TRIzol法提取人的黑色素瘤细胞总RNA,通过RT-PCR获得人ATX基因,构建p Fast BacTMHTA-ATX,Bacmid-ATX重组质粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获重组ATX病毒;重组病毒侵染sf9昆虫细胞表达人ATX;通过His TrapTMHP和Hi Load 16/600 Superdex 200pg柱两部纯化获得目的蛋白并测定其磷脂酶D（lysophospholipase D,lyso PLD）活性。结果 用Bam H I和Xho I双酶切鉴定PCR产物及重组载体的正确性,重组病毒能够侵染sf9细胞表达人ATX,柱层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳纯度95%以上,每升表达液可得到纯化蛋白6mg,其明显具有溶血磷脂酶D（lysophospholipase D,lyso PLD）活性。结论 通过Bac-to-Bac表达系统构建的重组病毒杆粒能够感染sf9昆虫细胞,并正确表达具有生物学活性的人ATX,为开展ATX结晶与结构分析研究提供材料,为开发高效的ATX小分子药物抑制剂提供帮助。 展开更多
关键词 自分泌运动因子 sf9昆虫细胞 Bac-to-Bac表达系统 lysoPLD活性
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果糖缬氨酸氧化酶在sf9细胞中的表达 被引量：1
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作者 徐影 赵雪 于源华 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期160-164,共5页
利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞sf9中表达果糖缬氨酸氧化酶基因(FVO)。人工合成FVO基因,与载体pFastBac1连接,转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,进行同源重组。经筛选得到重组杆状病毒载体Bacmid-pFastBac1-FVO,PCR鉴定得到单一条带;... 利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞sf9中表达果糖缬氨酸氧化酶基因(FVO)。人工合成FVO基因,与载体pFastBac1连接,转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,进行同源重组。经筛选得到重组杆状病毒载体Bacmid-pFastBac1-FVO,PCR鉴定得到单一条带;用该重组载体转染sf9细胞,收获毒种并进行表达;对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot检测。成功构建了FVO的杆状病毒表达载体,并在sf9细胞中得到了表达,Western blot检测出现1条约40 kD的带。 展开更多
关键词 果糖缬氨酸氧化酶 杆状病毒表达系统 同源重组 sf9细胞 真核表达
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CdCl_2诱导秋粘虫细胞(Sf9)凋亡的初步研究 被引量：1
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作者 朱玉芳 朱江 《苏州大学学报（自然科学版）》 CAS 2005年第3期74-77,共4页
以秋粘虫(Spodoptera frugiperda Sf9)的细胞为材料,用不同浓度的CdCl2,通过 Giemsa染色的形态学方法,研究其细胞凋亡.结果表明,在重金属离子的胁迫作用下,不同浓度的重金属离子致使细胞死亡率不同;其急性损伤域为1～36μmol/L;20μmol/... 以秋粘虫(Spodoptera frugiperda Sf9)的细胞为材料,用不同浓度的CdCl2,通过 Giemsa染色的形态学方法,研究其细胞凋亡.结果表明,在重金属离子的胁迫作用下,不同浓度的重金属离子致使细胞死亡率不同;其急性损伤域为1～36μmol/L;20μmol/L CdCl2作用6 h后, Sf9细胞出现了凋亡小体. 展开更多
关键词 sf9细胞 CDCL2 凋亡
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人碱性成纤维细胞生长因子在昆虫细胞sf9中的表达
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作者 王雅梅 孙丽翠 +4 位作者 祁雅慧 司杨 闫豫东 殷红 张静宜 《首都医科大学学报》 CAS 2004年第4期431-434,共4页
将人碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)基因cDNA克隆到pFastBacI转移载体中 ,重组质粒转化到感受态细胞DH1 0Bac中 ,使目的基因转座入BacmidDNA中 ,纯化DNA后 ,利用病毒噬斑实验筛选重组的杆状病毒。重组杆状... 将人碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)基因cDNA克隆到pFastBacI转移载体中 ,重组质粒转化到感受态细胞DH1 0Bac中 ,使目的基因转座入BacmidDNA中 ,纯化DNA后 ,利用病毒噬斑实验筛选重组的杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞 ,在Sf9细胞中进行表达。Western印迹结果表明 :表达产物为相对分子质量约 1 70 0 0的蛋白 ,与预计的重组蛋白相对分子质量相同 ,并具有较好的免疫学活性。MTT检测证实表达产物能明显促进人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的分裂增生 。 展开更多
关键词 表达 FGF 昆虫细胞 HUVEC MTT检测 增生 人脐静脉内皮细胞 人碱性成纤维细胞生长因子 感受态细胞 目的基因
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