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基于小RNA深度测序的甜椒内源RNA病毒鉴定与全基因组克隆
1
作者 舒琴 温枭雄 +1 位作者 鲍梦楠 闫佳会 《西北农业学报》 北大核心 2026年第3期560-570,共11页
为明确青海省不同地区辣椒病毒病的种类,采集来自该省循化县和尖扎县的疑似病毒病样品,并利用小RNA深度测序技术结合RT-PCR验证对具有典型病毒病症状的样品进行病毒检测。小RNA测序结果表明,青海省辣椒上存在多个病毒,包括蚕豆萎蔫病毒2... 为明确青海省不同地区辣椒病毒病的种类,采集来自该省循化县和尖扎县的疑似病毒病样品,并利用小RNA深度测序技术结合RT-PCR验证对具有典型病毒病症状的样品进行病毒检测。小RNA测序结果表明,青海省辣椒上存在多个病毒,包括蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus2, BBWV2)、辣椒隐症病毒1(Pepper cryptic virus1, PCV1)、辣椒隐症病毒2(Pepper cryptic virus2, PCV2)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus, BPEV)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)及辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)。将7月、9月分别采集的11份和16份辣椒病样用BPEV特异性引物进行RT-PCR检测,其中7月份4个样品检测结果为阳性,9月份7个样品检测结果为阳性。对于BPEV病毒进行全基因组序列的分段克隆及序列拼接分析,序列比对结果表明,青海分离物与其他国家或地区的分离物具有78.63%~97.51%的序列一致性,尤其与哥伦比亚、巴西和意大利的BPEV分离物亲缘关系较为接近。本研究首次在青海地区检测到BPEV,并获得其全基因组序列。 展开更多
关键词 青海省 辣椒 小RNA测序 RT-PCR
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甘肃天水葡萄病毒病病原鉴定及GPGV和GFabV基因序列分析
2
作者 徐亨昊 土建虎 +5 位作者 王永林 冯田田 牛二波 薛应钰 徐秉良 王嘉荟 《西北农业学报》 北大核心 2026年第3期548-559,共12页
为明确引起天水地区葡萄病毒病的主要病毒类型,采用高通量测序和反转录PCR技术对葡萄病毒进行鉴定和分析。高通量测序结果表明,葡萄病叶中存在5种病毒,分别为葡萄灰皮诺病毒(Grapevine Pinot Gris Virus, GPGV)、葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grape... 为明确引起天水地区葡萄病毒病的主要病毒类型,采用高通量测序和反转录PCR技术对葡萄病毒进行鉴定和分析。高通量测序结果表明,葡萄病叶中存在5种病毒,分别为葡萄灰皮诺病毒(Grapevine Pinot Gris Virus, GPGV)、葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine Fabavirus, GFabV)、啤酒花矮化类病毒(Hop Stunt Viroid, HSVd)、葡萄黄斑类病毒1(Grapevine Yellow Speckle Viroid 1,GYSVd1)和葡萄黄斑类病毒2(Grapevine Yellow Speckle Viroid 2,GYSVd2)。其中,GFabV病毒包含2个独特的核苷酸序列,分别为GFabV-GSTS-RNA1(5 280 bp)和GFabV-GSTS-RNA2(3 130 bp)。RT-PCR验证表明,3个类病毒、GPGV及GFabV均扩增出与预期基因长度一致的清晰条带。氨基酸相似性分析显示,GPGV-GSTS编码的外壳蛋白序列与其他GPGV分离物的外壳蛋白序列相似性为84.86%~96.60%,GFabV-GSTS-RNA1和GFabV-GSTS-RNA2编码的多聚蛋白氨基酸序列与其他GFabV分离物多聚蛋白氨基酸序列之间的同源性分别为92.47%~99.89%、88.15%~99.49%。系统进化树分析显示,GPGV-GSTS与中国分离物(BK011106)聚为一支,GFabV-GSTS-RNA1与2个来自日本的‘阳光玫瑰’分离物聚为一支;GFabV-GSTS-RNA2与6个‘阳光玫瑰’分离物聚为一支,亲缘关系最近。基因重组分析在GPGV和GFabV中未发现潜在重组事件。本研究明晰了天水地区葡萄病毒病的主要病原病毒,证实GPGV和GFabV在天水地区具有遗传稳定性,为后续葡萄病毒病防控提供了理论依据。 展开更多
关键词 葡萄 葡萄灰皮诺病毒 葡萄蚕豆萎蔫病毒 RT-PCR检测 序列分析 病毒鉴定
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鹅星状病毒通用型TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：1
3
作者 陈立功 穆英丽 +5 位作者 张诚 潘保革 范乐乐 魏忠华 王学静 刘聚祥 《中国家禽》 北大核心 2025年第2期53-59,共7页
为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础... 为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础上,分别建立扩增GAstV 1和GAstV 2的标准曲线,进一步验证该方法的特异性、敏感性和重复性,建立的方法用于临床样品的检测,并与文献报道的常规RT-PCR方法进行比较。结果显示:优化后的反应体系中最优上、下游引物浓度均为0.40(或0.50)μmol/L,探针浓度均为0.50μmol/L,扩增线性范围分别为3.26×10^(3)~3.26×10^(8)拷贝/μL和7.09×10^(3)~7.09×10^(8)拷贝/μL,相关系数均为0.998;该方法可特异性检出两种GAstV,但对新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鹅细小病毒和血清4型禽腺病毒6种鹅病相关病毒的核酸均无扩增信号;其检测限分别为3.26×10^(2)拷贝/μL和7.09×10^(1)拷贝/μL;组内变异系数和组间变异系数均低于3%。建立的实时荧光定量RT-PCR方法对临床样品的检测结果显示,GAstV阳性率为90.57%(96/106);而文献报道的常规RT-PCR方法对GAstV 1和GAstV 2的混合阳性率为62.26%。研究表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法为同时检测GAstV 1和GAstV 2提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 荧光定量RT-PCR TAQMAN探针
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南方水稻黑条矮缩病毒的检测及遗传多样性分析
4
作者 陆文静 周通 +6 位作者 韩笑 周雪松 宋成艳 刘乃生 郭震华 王翠 王桂玲 《东北农业大学学报》 北大核心 2025年第2期1-9,共9页
为明确南方水稻黑条矮缩病在海南省发生情况及其病原--南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)变异情况,采用RT-PCR方法对海南省5个地区表现为矮缩和叶色浓绿症状的154份水稻样品进行检测。结果表明:SR... 为明确南方水稻黑条矮缩病在海南省发生情况及其病原--南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)变异情况,采用RT-PCR方法对海南省5个地区表现为矮缩和叶色浓绿症状的154份水稻样品进行检测。结果表明:SRBSDV平均检出率为50.12%。对其中7份样品的SRBSDV外壳蛋白(Coatprotein,CP)基因序列进行克隆和遗传多样性分析,7条CP序列核苷酸和编码蛋白氨基酸序列一致性分别为99.51%~99.82%和99.23%~99.72%,与NCBI数据库中获取的其他15条SRBSDV分离物的CP基因核苷酸和氨基酸序列一致性分别为97.82%~99.83%和97.50%~99.21%。构建系统发育进化树发现,SRBSDVCP基因序列与来自中国(中国的江苏),(登录号:HQ916872)和越南(登录号:KM454846)序列聚为一簇,亲缘关系较近。遗传距离分析显示,7条序列与中国(中国的江西)分离物(登录号:JQ927009)的遗传距离为0.002~0.005,差异不显著。 展开更多
关键词 水稻 分子检测 RT-PCR CP 遗传多样性
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武汉地区油蟠桃病毒种类的小RNA测序鉴定
5
作者 刘勇 王富荣 +6 位作者 王会良 艾小艳 朱炜 张杨 甘志猛 龚林忠 何华平 《园艺学报》 北大核心 2025年第3期727-736,共10页
为明确侵染湖北武汉地区油蟠桃的病毒种类,采用小RNA测序技术对采集的5份病害样品进行了鉴定分析。结果表明样品中含有桃相关黄症病毒属病毒(peach-associated luteovirus,PaLV)、桃病毒D(peach virus D,PeVD)和桃潜隐花叶类病毒(peach ... 为明确侵染湖北武汉地区油蟠桃的病毒种类,采用小RNA测序技术对采集的5份病害样品进行了鉴定分析。结果表明样品中含有桃相关黄症病毒属病毒(peach-associated luteovirus,PaLV)、桃病毒D(peach virus D,PeVD)和桃潜隐花叶类病毒(peach latent mosaic viroid,PLMVd)。采用RT-PCR技术对测序结果进行了验证,获得的PaLV、PeVD和PLMVd基因序列(GenBank登录号:OP244073、OP244074和OP244075)与GenBank中相应的PaLV分离物T01-2(MK361479)、PeVD分离物T02-1(MK361476)和PLMVd分离物HUEI-Ob166/1-1(MW046337)的核苷酸序列一致性为92.15%~98.59%。进一步利用PaLV、PeVD、PLMVd及其他6种桃病毒特异性引物对109份油蟠桃样品进行RT-PCR检测,仅检测到PLMVd、PaLV和PeVD,检出率依次为33.94%、29.36%和5.50%。PLMVd可能为侵染油蟠桃的优势类病毒。病毒和类病毒复合侵染率为22.93%,高于单一的侵染率,表明复合侵染可能是油蟠桃上病毒、类病毒侵染的主要形式。 展开更多
关键词 油蟠桃 病毒 类病毒 小RNA测序 RT-PCR
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海南省水稻齿叶矮缩病毒的检测与遗传多样性分析
6
作者 陆文静 周通 +5 位作者 王桂玲 韩笑 周雪松 宋成艳 刘乃生 王翠 《西北农业学报》 北大核心 2025年第5期932-939,共8页
为了明确海南省水稻齿叶矮缩病毒(riceraggedstuntvirus,RRSV)发生情况,采集海南省154株表现叶片褪色、卷曲和皱缩等症状水稻植株进行RT-PCR检测。结果表明,RRSV在海南省发生普遍,三亚市、万宁市、陵水县、儋州市和琼中县5个地区检出率... 为了明确海南省水稻齿叶矮缩病毒(riceraggedstuntvirus,RRSV)发生情况,采集海南省154株表现叶片褪色、卷曲和皱缩等症状水稻植株进行RT-PCR检测。结果表明,RRSV在海南省发生普遍,三亚市、万宁市、陵水县、儋州市和琼中县5个地区检出率分别为37.5%、25.0%、32.6%、40.0%和28.6%。序列一致性分析结果显示:本研究获得的7条RRSVCP(capsidprotein)分离物氨基酸与核苷酸序列之间一致性分别为99.3%~100.0%和99.3%~99.8%;与NCBIGenBank数据库下载的7条RRSVCP基因之间的氨基酸和核苷酸一致性为97.5%~100.0%和92.6%~99.9%。构建系统发育树发现,9条分离物序列与澳大利亚分离物、美国分离物、上海分离物和浙江分离物聚为一簇,亲缘关系较近。遗传距离分析结果表明,RRSV的CP基因核苷酸遗传距离为0.001~0.078,遗传距离较近,遗传差异不显著。通过基因选择压力发现本研究中RRSVCP基因的选择压力ω值均小于1,说明CP基因的进化主要受负向选择压力的作用。 展开更多
关键词 水稻 RT-PCR 水稻齿叶矮缩病毒(RRSV) 外壳蛋白(CP) 遗传变异
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羊肠道病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用
7
作者 马雪青 张雨星 +6 位作者 李平花 王松泰 魏达礼 赵志荀 朵红 卢曾军 孙普 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第6期757-763,共7页
为建立一种灵敏、特异、准确的羊肠道病毒(CEV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究基于CEV基因序列的保守区设计特异性引物和探针,并制备标准品,通过优化反应体系和反应条件,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法,同时对其敏感性、... 为建立一种灵敏、特异、准确的羊肠道病毒(CEV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究基于CEV基因序列的保守区设计特异性引物和探针,并制备标准品,通过优化反应体系和反应条件,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法,同时对其敏感性、特异性和重复性进行评估,并与常规RT-PCR比较检测临床样品。结果显示,所建方法的标准曲线R2为0.995,拷贝数与Ct值有良好的线性关系;该方法特异性强,与口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊痘病毒(SPV)、羊口疮病毒(ORFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)无交叉反应;敏感性最低检测限为23 copies/μL;组内与组间变异系数均小于2.5%,重复性好。使用本方法检测了598份羊的临床样品,阳性检出率(83/598)高于常规RT-PCR (30/598)。上述结果表明,本研究建立了一种灵敏、特异的CEV TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法,并建议采用羊的粪便或肛拭子即可进行CEV的流调工作,这为CEV的诊断、流行病学调查提供了重要的技术支持。 展开更多
关键词 羊肠道病毒 TaqMan实时荧光定量RT-PCR 诊断
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兔出血症病毒RHDV1和RHDV2一步法双重TaqMan探针荧光定量RT-PCR体系的建立和应用
8
作者 陈萌萌 王冠萱 +8 位作者 仇汝龙 范志宇 胡波 宋艳华 魏后军 徐为中 葛雷 李一鸣 王芳 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第5期937-942,共6页
兔出血症病毒(RHDV)引起的兔出血症是一种急性、高度致死性传染病,对养兔业造成严重危害。本研究基于RHDV衣壳蛋白(VP60)基因序列设计引物和TaqMan探针,建立可同时检测RHDV1和RHDV2两种毒株的双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系。反应体... 兔出血症病毒(RHDV)引起的兔出血症是一种急性、高度致死性传染病,对养兔业造成严重危害。本研究基于RHDV衣壳蛋白(VP60)基因序列设计引物和TaqMan探针,建立可同时检测RHDV1和RHDV2两种毒株的双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系。反应体系:2×One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μL,上下游引物(10μmol/L)各0.6μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μL,两种荧光探针(10μmol/L)各0.8μL,待测样本2.0μL,ddH_(2)O 4.8μL。反应程序:42℃5 min,95℃10 s,95℃5 s,60℃30 s,40个循环。试验结果表明,该体系特异性强,与轮状病毒、兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌、绿脓杆菌、沙门氏菌无交叉反应;灵敏度高,最低检测限为1μL 100拷贝。通过组内重复和组间重复进行重复性分析,Ct值变异系数为0.2%~2.9%,表明该体系稳定性较好。使用该体系对112份临床样本(60份肝脏组织、52份鼻肛拭子)进行检测,RHDV总检出率为69%,而常规RT-PCR体系的检出率仅为51%。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法具有高灵敏度、强特异性和良好的重复性,可为RHDV的临床快速诊断及定量分析提供可靠技术支持。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 荧光定量RT-PCR TAQMAN探针
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国标中H5亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法的优化与应用
9
作者 刘朔 彭程 +3 位作者 毛秋艳 杨吉喆 蒋文明 刘华雷 《病毒学报》 北大核心 2025年第5期1522-1530,共9页
当前H5N1亚型禽流感疫情在全球范围内肆虐,且病毒不断变异,因此需要持续对检测方法的有效性进行评估。近年来,我们在临床样品检测过程中发现,国家标准《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936-2020)中H5亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT... 当前H5N1亚型禽流感疫情在全球范围内肆虐,且病毒不断变异,因此需要持续对检测方法的有效性进行评估。近年来,我们在临床样品检测过程中发现,国家标准《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936-2020)中H5亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法存在扩增曲线荧光值偏低的现象,对结果判定产生一定干扰。基于国标引物和探针序列与当前流行毒株的匹配性评估分析,我们设计和优化了上游引物和探针序列,并对优化方法的特异性、灵敏度和临床样品检测效果与国标方法进行了对比。结果显示,该优化方法特异性强,与其他亚型AIV和常见禽类病原体均无交叉反应;针对2.3.4.4b分支H5亚型病毒的检测灵敏度较国标方法提高了10倍,针对2.3.4.4h分支H5亚型病毒的检测灵敏度与国标方法类似;组内和组间试验Ct值变异系数介于0.17%~1.58%,具有良好的重复性;对48份家禽和野禽咽肛拭子样品检测,本优化方法检出阳性样本38份(国标方法检出37份),其中64.9%(24/37)阳性样品的Ct值较国标方法低2以上。结果表明,本研究优化的荧光RT-PCR方法可为H5亚型高致病性禽流感病毒的流行病学调查监测及快速诊断提供技术支持。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H5亚型 实时荧光RT-PCR 检测方法
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福建蝴蝶兰病毒小RNA测序及RT-PCR检测
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作者 樊荣辉 吴建设 +2 位作者 冯子楠 钟声远 钟淮钦 《园艺学报》 北大核心 2025年第2期503-512,共10页
从福建省福州、厦门、漳州、泉州采集56个蝴蝶兰(Phalaenopsis)疑似病毒样品,按侵染症状分为褪绿、黄化褐斑、黄化皱缩等3类样品,采用小RNA测序技术和RT-PCR进行检测,共发现8种病毒,按照检出率从高到低分别为建兰花叶病毒(Cymbidium mos... 从福建省福州、厦门、漳州、泉州采集56个蝴蝶兰(Phalaenopsis)疑似病毒样品,按侵染症状分为褪绿、黄化褐斑、黄化皱缩等3类样品,采用小RNA测序技术和RT-PCR进行检测,共发现8种病毒,按照检出率从高到低分别为建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cy MV)85.71%,齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)35.71%,白三叶草花叶病毒(white clover mosaic virus,WCMV)32.14%,淮山药X病毒(yam virus X,Ya VX)21.43%,水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus,Na MV)10.71%,凤果花叶病毒(pepino mosaic virus,Pe MV)8.93%,马铃薯X病毒(potato virus X,Po VX)7.14%和仙人指X病毒(Schlumbergera virus X,Sc VX)7.14%。其中,Cy MV、ORSV和WCMV的检出率在30%以上,多为复合侵染,侵染率达75.51%。以小RNA测序序列为模板,设计出特异引物,建立了同时检测5种病毒的多重RT-PCR体系;ORSV、Cy MV、WCMV、Ya VX和Po VX的引物对浓度分别为0.30,0.06,0.20,0.50和0.40μmol·L^(-1),退火温度56℃时,可同时扩增出片段大小分别为1156、908、561、292和162 bp的目的条带,特异性良好。灵敏度检测结果显示,可从≥0.0001 mg的感病植物组织中检测到这5种病毒。 展开更多
关键词 蝴蝶兰 小RNA深度测序 多重RT-PCR 病毒
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水貂震颤综合征-星状病毒的检测及半巢式RT-PCR检测方法的建立
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作者 王旭 刘德凯 +3 位作者 赵碧田 黄泽楷 李海名 张彦龙 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第10期143-150,共8页
为探究黑龙江省某水貂养殖场幼貂发生疑似水貂震颤综合征(shaking mink syndrome,SMS)继发死亡的病原并针对病原建立特异性强、灵敏度高的检测方法,试验首先采集3只病死幼貂的脑、肝脏、肾脏和肺脏组织标本,经H.E.染色制作成病理切片进... 为探究黑龙江省某水貂养殖场幼貂发生疑似水貂震颤综合征(shaking mink syndrome,SMS)继发死亡的病原并针对病原建立特异性强、灵敏度高的检测方法,试验首先采集3只病死幼貂的脑、肝脏、肾脏和肺脏组织标本,经H.E.染色制作成病理切片进行组织病理学观察,采用RT-PCR方法对水貂常见病原[星状病毒(Astrovirus,AstV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)]进行检测,并对检测的病原进行遗传进化分析;然后建立针对病原建立半巢式RT-PCR检测方法,对建立的方法进行条件(退火温度、Taq酶体积、引物体积)优化、特异性试验、敏感性试验、重复性试验,并采用该方法对119份病死幼貂的脑组织样本进行检测。结果表明:病死水貂大脑-皮质内部分神经细胞变性、坏死,皮质内部分血管周围有炎性细胞浸润,出现管套现象,皮质内胶质细胞散在性浸润,与神经毒性AstV引起的特征性病理变化相似;其他组织未见明显病理变化。从病死幼貂脑组织中仅检测到AstV,命名为SMS-AstV-Harbin。从基于AstV ORF1b基因构建的遗传进化树中可见,SMS-AstVHarbin与Mink astrovirus isolate-SMS-AstV(登录号为GU985458.1)处于同一小分支,亲缘关系较近;与Human astrovirus UK1(登录号为KM358468.1)、Canine astrovirus strain HUN/2012/8(登录号为KX599354.1)、Feline astrovirus 2(登录号为KF499111.1)、Porcine astrovirus 3 strain NI-Brain/173-2016a/HUN(登录号为KY073231.1)、Bovine astrovirus CH13(登录号为KM035759.1)、Ovine astrovirus 2(登录号为NC_002469.1)处于不同小分支,亲缘关系较远。建立的半巢式RT-PCR检测方法的最优退火温度、Taq酶(5 U/μL)体积和引物(10μmol/L)体积分别为52℃、0.5μL和1μL。该方法能特异性地检出SMS-AstV,其cDNA最低检测限为1 pg/μL,且对3份样本的3次重复检测结果均一致。采用该方法检出SMS-AstV阳性样本117份,阳性率为98.32%。说明引起该养殖场幼貂死亡的病原为SMS-AstV,针对该病原建立的半巢式RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于快速检测。 展开更多
关键词 水貂震颤综合征 水貂星状病毒 病理学观察 病毒鉴定 遗传进化分析 半巢式RT-PCR方法
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H9N2亚型禽流感病毒双重TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 刘莉 张贺楠 +4 位作者 莫一群 徐亚亚 金丁丁 齐岩 胡增垒 《中国家禽》 北大核心 2025年第11期154-160,共7页
为建立一种快速、灵敏且特异的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重荧光定量RT-PCR检测方法,试验根据H9N2 AIV的HA基因和NA基因保守区域设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应体系及条件,建立H9N2亚型AIV的双重荧光定量RT-PCR检测方法,进... 为建立一种快速、灵敏且特异的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重荧光定量RT-PCR检测方法,试验根据H9N2 AIV的HA基因和NA基因保守区域设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应体系及条件,建立H9N2亚型AIV的双重荧光定量RT-PCR检测方法,进一步对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估,并将建立的方法用于临床样品的检测,与H9亚型AIV荧光RT-PCR检测试剂盒进行比较。结果显示:该方法与其他亚型AIV、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、禽白血病病毒、传染性法氏囊病病毒和传染性支气管炎病毒无交叉反应,检测限为0.1 copies/μL,批内和批间变异系数均小于5%,临床样本检测阳性率(24.3%)高于H9亚型AIV荧光RT-PCR检测试剂盒(18.9%)。研究表明,建立的H9N2 AIV双重TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强,敏感性较高,能够应用于H9N2 AIV的快速检测。 展开更多
关键词 H9N2亚型禽流感病毒 TAQMAN探针 荧光定量RT-PCR HA基因 NA基因
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NGS、RT-PCR和FISH在非小细胞肺癌ALK检测中的比较研究
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作者 岳林 白雪峰 +8 位作者 项鹏程 虞飞 白建辉 冯立文 高洋 武小燕 刘恩 丁海麦 王焱宏 《包头医学院学报》 2025年第10期71-76,共6页
目的:准确的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)重排检测在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者ALK抑制剂(anaplastic lymphoma kinase tyrosine kinase inhibitors,ALK-TKI)靶向治疗中至关重要。目前,... 目的:准确的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)重排检测在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者ALK抑制剂(anaplastic lymphoma kinase tyrosine kinase inhibitors,ALK-TKI)靶向治疗中至关重要。目前,医院实验室所使用的检测方法有基于逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和二代测序(next generation sequencing,NGS)。本文评估了三种方法检测ALK重排的性能,为ALK的精确检测提供理论支持。方法:选取38例ALK阳性患者,分别用RT-PCR、FISH和NGS对样本进行ALK重排检测,评估三种方法在ALK检测中的一致性。再分别分析这三种ALK方法与ALK-TKI治疗效果的一致性。结果:分别用RT-PCR、FISH和NGS方法检测38例得到的ALK重排阳性率分别是89.47%、86.84%和97.37%,其中,NGS检测出3例罕见ALK重排。RT-PCR与FISH方法在检查ALK重排结果有较强的一致性(Kappa=0.623,P<0.05);NGS与RT-PCR、FISH检测ALK重排没有一致性(Kappa=-0.044和0.303)。该三组方法定义的ALK阳性病例经ALK-TKI治疗22个月的存活数,统计分析结果显示差异无统计学意义(P>0.05)。结论:与RT-PCR和FISH相比,NGS方法显示出更高的阳性检出率,特别是在罕见的ALK重排中具有更强的检测能力,因此,本研究倡导在实验条件满足的情况下采用NGS来检测ALK重排,能有效提升NSCLC患者的治疗效果和预后评估。 展开更多
关键词 间变性淋巴瘤激酶 非小细胞肺癌 逆转录PCR 荧光原位杂交 二代测序
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副流感病毒5型RT-PCR检测方法的建立及检测试剂盒的初步配制
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作者 吴华伟 陈晓春 +4 位作者 刘丹 秦义娴 高金源 孔冬妮 姜平 《中国兽药杂志》 2025年第11期7-15,共9页
为建立检测副流感病毒5型(Parainfluenza virus5,PIV5)的RT-PCR方法,针对PIV5L基因设计筛选出一对特异性引物,对退火温度、引物浓度、阳性对照灭活剂及浓度等进行了优化,并进行了敏感性、特异性、试剂盒配制及冻融后检测效果验证研究。... 为建立检测副流感病毒5型(Parainfluenza virus5,PIV5)的RT-PCR方法,针对PIV5L基因设计筛选出一对特异性引物,对退火温度、引物浓度、阳性对照灭活剂及浓度等进行了优化,并进行了敏感性、特异性、试剂盒配制及冻融后检测效果验证研究。结果显示:该方法仅能从PIV5分离毒种扩增到与预期大小相符的长度为314bp的特异性目的片段,最适退火温度为57.1℃,最适引物浓度为0.2umol/L,阳性对照适宜灭活剂为二乙烯亚胺(BEI),试剂盒冻融后不影响检测结果。建立的RT-PCR方法检测灵敏度为8~10TCID50,与BPIV_(3)等22种常见病毒均无交叉,特异性强、敏感性高,为PIV5的临床诊断和流行病学调查提供了技术方法。 展开更多
关键词 副流感病毒5型 RT-PCR 检测试剂
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云南省2型登革病毒流行株实时荧光逆转录聚合酶链反应检测方法的建立
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作者 郭晓芳 容艺函宇 +3 位作者 黄兴云 李佩 杨雪艳 汪伟 《中国热带医学》 北大核心 2025年第10期1263-1268,共6页
目的建立云南省2型登革病毒(dengue virus,DENV)流行株的核酸检测方法,为早期实验室分型诊断提供参考。方法在DENV-2衣壳蛋白基因保守区设计引物和探针。用新建立的实时荧光逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain ... 目的建立云南省2型登革病毒(dengue virus,DENV)流行株的核酸检测方法,为早期实验室分型诊断提供参考。方法在DENV-2衣壳蛋白基因保守区设计引物和探针。用新建立的实时荧光逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测含检测目的基因片段的质粒进行灵敏度评价。通过检测DENV-1、DENV-3、DENV-4、基孔肯雅病毒、寨卡病毒和乙脑病毒共6种病毒,验证新建立方法的特异性。对3个稀释度(104、105、106拷贝/µL)的标准品质粒进行组内与组间重复性检测。分别用新建立方法、《登革热诊断》WS216—2018 DENV分型RT-PCR、新设计引物和探针与《登革热诊断》中检测DENV-1、DENV-3和DENV-4的引物和探针组合检测84份包括亚洲Ⅰ基因型和世界性基因型的DENV-2阳性病例血清RNA和30份DENV阴性血清RNA。结果新建立方法的线性动态范围(101~107拷贝/反应)的R2值为0.998,对质粒标准品的检测下限为101拷贝/µL。组内和组间试验的变异系数均小于1%。特异度试验显示新建立方法对DENV-2特异,与其他6种病毒无反应。用新建立方法检测的阳性及阴性符合率均为100.00%,《登革热诊断》DENV分型实时荧光RT-PCR检测的阳性符合率为20.24%(17/84),新设计引物及探针与《登革热诊断》中检测DENV-1、DENV-3和DENV-4的引物及探针组合的实时荧光RT-PCR检测的阳性及阴性符合率均为100.00%。结论建立了灵敏及特异的云南DENV-2流行株实时荧光RT-PCR检测方法,适用于云南省登革热病例的分型检测。 展开更多
关键词 登革病毒 登革热 血清型 实时荧光逆转录聚合酶链反应 2型登革病毒 登革热诊断
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新城疫病毒通用荧光RT-PCR检测方法的建立
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作者 王静静 克军宏 +3 位作者 王海鸣 郭通 于晓慧 刘华雷 《中国动物检疫》 2025年第11期83-88,96,共7页
为满足新城疫病毒(NDV)快速检测的需求,通过对我国流行的6种基因型NDV基因组序列进行比对,针对P基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了NDV通用荧光RT-PCR检测方法,并评估了方法的特异性、敏感性、重复性和诊断性能。结果显示:该方法... 为满足新城疫病毒(NDV)快速检测的需求,通过对我国流行的6种基因型NDV基因组序列进行比对,针对P基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了NDV通用荧光RT-PCR检测方法,并评估了方法的特异性、敏感性、重复性和诊断性能。结果显示:该方法可检测目前国内流行的6种基因型NDV,与其他常见禽病病毒无交叉反应,灵敏度比常规RT-PCR高10倍,组内和组间变异系数均低于1.5%。利用该方法检测1044份临床样品,绘制ROC曲线,其线下面积为0.9718,诊断的敏感性和特异性分别为92.62%和98.99%,与病毒分离鉴定结果的符合率为98.08%。结果表明,本研究建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好、准确性高,可用于NDV的快速、通用检测。 展开更多
关键词 新城疫病毒 通用荧光RT-PCR 检测性能评估
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11种致牛腹泻病原的一步法多重PCR/RT-PCR检测方法的建立 被引量：2
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作者 金美君 胡云皓 +8 位作者 辛凌翔 刘燕 潘瑶 王秀丽 赵浩然 汤承 陈曦 李锦铨 朱良全 《微生物学通报》 北大核心 2025年第1期383-396,共14页
【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展,病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒的一步法多重PCR/RT-PCR检测方法,实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索调查了... 【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展,病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒的一步法多重PCR/RT-PCR检测方法,实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索调查了引起牛腹泻病的主要病原及其高覆盖率的引物,选择以产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α-toxin、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)inv A、大肠杆菌(Escherichia coli)K99、牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV)5′-UTR、牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)ORF1a、牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRoV)VP6、牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKoV)D4、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)ORF1、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)N、牛环曲病毒(bovine torovirus,BToV)N、牛病毒性腹泻黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)5′-UTR为靶标序列的引物,通过温度梯度PCR及单一控制变量法优化退火温度、引物浓度、循环数,建立11种病原的多重PCR/RT-PCR检测方法,对该方法进行特异性、灵敏度和重复性评价,并应用该方法进行临床样品检测。【结果】最佳退火温度为54.4℃,C.perfringens、S.enterica、E.coli、BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV和BVDV对应基因片段最优引物浓度分别为0.20、0.25、0.25、0.20、0.25、0.25、0.35、0.50、0.25、0.25、0.30μmol/L,最优循环数为35个循环。该方法特异性强,仅对靶标病原检测为阳性,对溶血性曼氏杆菌(Mansiella haemolyticus)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、牛支原体(Mycoplasma bovine)分离株等病原检测均为阴性;敏感性高,对重组质粒标准品最低检出限依次为7.5×10^(3)、7.5×10^(4)、7.5×10^(3)、7.5×10^(1)、7.5×10^(4)、7.5×10^(2)、7.5×10^(3)、7.5×10^(2)、7.5×10^(2)、7.5×10^(4)、7.5×10^(3)copies/μL;重复性好,批间与批内试验均一致。用该方法检测江苏地区临床样品490份,结果显示,BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV、BVDV阳性率分别0.61%、0.41%、0.61%、0.21%、27.14%、3.27%、0.21%、1.02%。通过单重PCR对该多重PCR临床样品检测结果进行重复验证,结果显示符合率为100%。随机挑选50个检测为阳性的PCR产物进行测序验证,结果均为相应病原的基因片段。【结论】建立一种同时检测11种牛腹泻主要病原的一步法多重PCR/RT-PCR检测方法。 展开更多
关键词 牛 腹泻 细菌 病毒 多重PCR RT-PCR
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一起肠炎沙门氏菌食源性疾病事件流行病学调查
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作者 白晓潇 王梓权 《临床医学研究与实践》 2025年第27期14-17,共4页
目的针对一起食源性疾病事件开展现场流行病学调查,明确致病菌及传播途径。采用RT-PCR技术对部分样本进行检测并与传统培养方法对比分析,旨在为类似事件提供处理思路和检测经验。方法收集暴发事件相关流行病学资料,采集患者样本,检测并... 目的针对一起食源性疾病事件开展现场流行病学调查,明确致病菌及传播途径。采用RT-PCR技术对部分样本进行检测并与传统培养方法对比分析,旨在为类似事件提供处理思路和检测经验。方法收集暴发事件相关流行病学资料,采集患者样本,检测并分析可疑食品与发病的相关性,开展溯源调查。使用RT-PCR检测技术对患者样本进行病原体快速筛查。结果患者临床症状以腹泻、发热、腹痛为主;发病潜伏期中位数为21.0 h。RT-PCR检测结果显示,5例患者生物标本均为沙门氏菌感染阳性。传统培养方法检测结果显示,除1例患者粪便标本结果未检出沙门氏菌,其余患者生物标本(包括7件粪便样本和2件肛拭子样本)均检出沙门氏菌。结论本次事件为一起肠炎沙门氏菌导致的食源性疾病暴发,RT-PCR技术可对突发感染事件的生物样本做出快速有效诊断,有助于对流行病事件严重程度进行初步研判。 展开更多
关键词 沙门氏菌 流行病学 细菌培养 RT-PCR
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猫传染性腹膜炎的RT-PCR诊断及病理组织学观察
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作者 王成丽 祝启成 +7 位作者 吴明慧 蔡敏欢 孙宇旭 高德翔 高峰 张杰 王文杰 静争 《特产研究》 2025年第4期145-151,共7页
本文对两例疑似感染猫传染性腹膜炎病毒的死亡患猫,通过观察临床症状、实验室检查、病原RT-PCR检测以及病理组织切片等方法进行确诊。首先,收集患猫腹水样品进行RT-PCR检测呈阳性,并构建系统发育树、进行同源性分析,显示两猫腹水样品均... 本文对两例疑似感染猫传染性腹膜炎病毒的死亡患猫,通过观察临床症状、实验室检查、病原RT-PCR检测以及病理组织切片等方法进行确诊。首先,收集患猫腹水样品进行RT-PCR检测呈阳性,并构建系统发育树、进行同源性分析,显示两猫腹水样品均能扩增出417 bp大小的阳性目的条带,序列与猫冠状病毒有很高的同源性。系统发育树显示,与猫传染性腹膜炎病毒处于同一发育分支;再次通过病理组织切片镜检结果显示肝脏、脾脏、肾脏等被膜外均有大量纤维素渗出,并伴有炎性细胞、广泛性脂肪变性,心肌纤维发生颗粒变性等严重病理损伤。最终确诊2例患猫均感染了猫传染性腹膜炎病毒,且该病毒对猫多种主要器官造成了严重损伤。 展开更多
关键词 猫传染性腹膜炎 RT-PCR 系统发育树 病理组织学
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承德地区肉牛呼吸道综合征主要病毒性病原流行病学调查与分析
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作者 闫港 张召兴 +2 位作者 王利冉 杨巍 郭磊 《现代畜牧科技》 2025年第4期44-46,共3页
为了解承德地区养殖场中肉牛呼吸道综合征主要病毒性病原流行情况。该研究于2024年1—12月采集承德地区肉牛养殖场中患有呼吸道症状的牛的咽拭子、鼻拭子及血液等病料组织样本共计617份,采用一步RT-PCR法分别检测牛传染性鼻气管炎(IBRV... 为了解承德地区养殖场中肉牛呼吸道综合征主要病毒性病原流行情况。该研究于2024年1—12月采集承德地区肉牛养殖场中患有呼吸道症状的牛的咽拭子、鼻拭子及血液等病料组织样本共计617份,采用一步RT-PCR法分别检测牛传染性鼻气管炎(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)4种引起肉牛呼吸道综合征主要病毒性病原,分析其流行情况。结果显示,从采集的617份病料组织样本中IBRV阳性率最高;经过分析,4种病毒性病原出现混合感染,二重感染以IBRV+BPIV-3和IBRV+BVDV为主,其阳性率分别为4.7%和5.8%,三重感染以IBRV+BVDV+BPIV-3为主,其阳性率为3.1%。为该地区肉牛呼吸道综合征主要病毒病流行病学调查与防控提供参考。 展开更多
关键词 肉牛 牛呼吸道综合征 RT-PCR 流行病学调查
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