共表达PCV2 Cap蛋白和IL-2重组变异株伪狂犬病病毒构建及对小鼠的免疫原性 被引量：2

1

作者 时庆贺 马宁宁 +5 位作者 刘占 邓梦梦 郭子仪 史志斌 陈陆 王川庆 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期480-486,共7页

为获得有效预防猪圆环病毒2型(PCV2)及伪狂犬病(PR)感染的重组活载体疫苗,利用同源重组将PCV2 YY株ORF2和细胞因子佐剂IL-2基因插入rPRV-gE^(-)/TK^(-)/EGFP^(+)缺失的TK基因位点,获得重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)。... 为获得有效预防猪圆环病毒2型(PCV2)及伪狂犬病(PR)感染的重组活载体疫苗,利用同源重组将PCV2 YY株ORF2和细胞因子佐剂IL-2基因插入rPRV-gE^(-)/TK^(-)/EGFP^(+)缺失的TK基因位点,获得重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)。将重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)及对照rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)、PCV亚单位疫苗、PR活疫苗和DMEM培养液分别免疫小鼠,4周后加强免疫1次,利用PCV2间接ELISA试验、PRV血清中和试验、T淋巴细胞转化试验和细胞亚群及因子测定等评价重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)的免疫原性。结果显示,构建的rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)可在BHK-21细胞内表达,免疫鼠产生抗PCV2和PRV的特异性中和抗体,能刺激CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞的增殖及促使IFN-γ、IL-4和IL-12细胞因子的表达水平明显升高。结果表明,成功构建的rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)能有效诱导机体产生较高水平的免疫效果,IL-2起到免疫增强作用,可作为预防猪PR和PCV感染相关疾病的候选疫苗株。 展开更多

关键词 重组变异株伪狂犬病病毒 pcv2 Cap IL-2 免疫效力

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PCV2 Cap蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 被引量：2

2

作者 李钰昌 郑亮 +3 位作者 张华 吴志军 肖莉杰 曹宏伟 《黑龙江八一农垦大学学报》 2023年第1期78-83,130,共7页

猪圆环病毒2型是一种常见的猪感染性病毒,Cap蛋白为猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白,也是该病毒最主要的结构蛋白,是目前猪圆环病毒2型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了Cap蛋白原核表达质粒pET28a-His-Cap,转化Transetta(DE3)表达菌株... 猪圆环病毒2型是一种常见的猪感染性病毒,Cap蛋白为猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白,也是该病毒最主要的结构蛋白,是目前猪圆环病毒2型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了Cap蛋白原核表达质粒pET28a-His-Cap,转化Transetta(DE3)表达菌株,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及蛋白免疫印迹试验验证,重组蛋白主要以可溶性形式表达,少数为包涵体蛋白。以Ni-NTA树脂进行蛋白纯化,纯化后蛋白浓度为629μg·mL^(-1),采用透析袋浓缩将重组蛋白浓缩,浓缩后蛋白终浓度为1.8 mg·mL^(-1)。将重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合,充分乳化后制备抗原,免疫兔子采集全血,分离血清。经蛋白免疫印迹试验,该多抗与重组蛋白存在免疫反应性,ELISA检测抗体效价可达1∶32000,IFA试验证明该多抗能够特异性识别猪圆环病毒2型。Cap蛋白多克隆抗体的成功制备,为后续猪圆环病毒2型基因工程疫苗制备过程中验证Cap体外蛋白表达提供了材料。 展开更多

关键词 pcv2 Cap蛋白 原核表达 多克隆抗体

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猪圆环病毒2型(PCV2) Cap基因原核表达及抗血清制备 被引量：5

3

作者 姜宇航 宋利娜 +7 位作者 许汪 杜寿文 陈竞 付婷婷 郝鹏飞 李秋璇 金宁一 李昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期237-241,共5页

Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重... Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET-28a-PCV2 Cap。将验证正确的菌种接入HB-pET自诱导培养基,过夜培养,SDS-PAGE及Western blot验证其表达,可获得28000左右的目的蛋白。利用亲和层析技术纯化PCV2 Cap蛋白,免疫BALB/c小鼠获得小鼠阳性血清,通过ELISA方法检测其效价,并用Western blot验证其活性。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得小鼠阳性血清,为PCV2 Cap蛋白的功能研究、鉴定、抗体及疫苗研制和病原检测奠定理论基础。 展开更多

关键词 pcv2 Cap基因 原核表达 小鼠阳性血清

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PCV2 Cap蛋白的胞内互作蛋白研究进展 被引量：2

4

作者 陈艳 颜秋 +1 位作者 刘畅 吕其壮 《家畜生态学报》 北大核心 2018年第7期80-85,共6页

猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus virus type 2,PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等疾病的综合感染。PCV2负义链上第2个开放阅读框编码的Cap蛋白是唯一的结构蛋白。目前,对PCV2致病机理的研究也都集中于Cap蛋白,尤其是Cap蛋白与... 猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus virus type 2,PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等疾病的综合感染。PCV2负义链上第2个开放阅读框编码的Cap蛋白是唯一的结构蛋白。目前,对PCV2致病机理的研究也都集中于Cap蛋白,尤其是Cap蛋白与其胞内互作蛋白之间的相互作用等方面。文章结合国内外最新研究进展,对PCV2Cap蛋白的胞内互作蛋白进行了综述,以期为揭示Cap蛋白在PCV2致病中的作用提供参考。 展开更多

关键词 猪圆环病毒Ⅱ型(pcv2) CAP蛋白 互作蛋白 C1QBP Hsp40

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PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选 被引量：1

5

作者 周景明 张秋丽 +5 位作者 张改平 刘红亮 祁艳华 宋瑞雪 耿玥 王爱萍 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期1754-1760,共7页

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,... 用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。 展开更多

关键词 pcv2 CAP蛋白 单链抗体 噬菌体单链抗体库

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血凝试验和反向间接血凝试验定量检测PCV2 Cap抗原的研究 被引量：2

6

作者 李晶梅 谢红玲 +8 位作者 薛霜 李文静 黄涛 王焕君 刘项羽 张飞雁 朱薇 李婷婷 石宝兰 《中国兽药杂志》 2024年第1期1-5,共5页

为研究能否用血凝和反向间接血凝方法定量检测重组杆状病毒表达的PCV2 Cap抗原,分别使用不同稀释液和不同的动物红细胞测定PCV2Cap抗原的凝集效价,同时使用PCV2Cap单抗致敏绵羊红细胞,检测PCV2Cap抗原、空杆状病毒、CSFV等的反向间接血... 为研究能否用血凝和反向间接血凝方法定量检测重组杆状病毒表达的PCV2 Cap抗原,分别使用不同稀释液和不同的动物红细胞测定PCV2Cap抗原的凝集效价,同时使用PCV2Cap单抗致敏绵羊红细胞,检测PCV2Cap抗原、空杆状病毒、CSFV等的反向间接血凝效价(RIHA效价)。结果显示,用猪、鸡、绵羊红细胞在不同稀释液条件下测得的同一批次PCV2Cap抗原凝集效价为3log2~9log2,说明PCV2Cap抗原可凝集猪、鸡、绵羊红细胞,但红细胞不同、稀释液不同,测得的PCV2Cap抗原凝集效价也不同。使用PCV2Cap单抗致敏绵羊红细胞,测得的PCV2Cap抗原RIHA效价为14log2,且纯化后和未纯化的PCV2Cap抗原的RIHA效价均与ELISA定量检测结果有平行关系;空杆状病毒、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TCEV的RIHA效价均小于1log2。说明反向间接血凝方法可定量检测重组杆状病毒表达的PCV2Cap抗原,该方法敏感、特异,适用于疫苗生产中的PCV2Cap抗原的定量检测。 展开更多

关键词 pcv2 Cap抗原 反向间接血凝 血凝 红细胞

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含有Th细胞表位的合成PCV2 ORF2 Cap多肽抗原的表达及免疫原性分析 被引量：3

7

作者 陈善真 赵焱 +4 位作者 李中圣 罗均 陈克宏 王贵平 李其昌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2273-2281,共9页

拟测定在PCV2ORF2Cap P1多肽抗原中添加从PCV2ORF1、ORF3中筛选的Th细胞表位多肽在促进其免疫原性中的作用,以及合成表达的PCV2ORF2Cap P1多肽抗原作为疫苗抗原的可行性。采用生物信息学及分子生物学方法,筛选获得1条泛宿主新型Th细胞... 拟测定在PCV2ORF2Cap P1多肽抗原中添加从PCV2ORF1、ORF3中筛选的Th细胞表位多肽在促进其免疫原性中的作用,以及合成表达的PCV2ORF2Cap P1多肽抗原作为疫苗抗原的可行性。采用生物信息学及分子生物学方法,筛选获得1条泛宿主新型Th细胞表位多肽和3条PCV2特异的含有Th细胞抗原表位的多肽序列,然后将这4条Th细胞多肽氨基酸序列与筛选自ORF2Cap1上的1条B细胞表位多肽序列进行串联组合,密码子优化,插入酶切位点、终止密码子,然后进行密码子适应指数和分布频率分析,预测可以实现高效表达后再进行化学合成。合成的P1多肽抗原连接到pET-30a表达载体,并转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1。经IPTG诱导表达后P1可实现高效表达,SDS-PAGE鉴定表达量,Western Blot鉴定其生物活性,然后分别免疫小鼠和猪,测定小鼠免疫后的抗体水平以及猪免疫后P1合成多肽抗原对外周血淋巴细胞的刺激增殖情况。结果表明,设计合成表达的PCV2P1多肽抗原序列,密码子适应性指数为0.89,能够实现高水平表达,目的片段大小约为28.29ku,具有良好的免疫原性;MTT试验结果表明,P1多肽抗原免疫后机体内IFN-γ和IL-4的表达量明显增加,且与对照组差异显著(P<0.05)。这说明P1能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,为其作为疫苗用抗原的进一步研究奠定了理论基础。 展开更多

关键词 pcv2 Th细胞表位多肽 CAP蛋白

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改良的RIHA方法定量检测PCV2 Cap抗原的研究

8

作者 谢红玲 李晶梅 +8 位作者 冯钊 雷环城 杨思谊 黄泳芳 刘项羽 程敏华 秦红刚 田丽娜 孙文 《中国兽药杂志》 2024年第10期1-7,共7页

为提高反向间接血凝试验(reverse indirect hemagglutination assay,RIHA)定量检测PCV2 Cap抗原的稳定性和精准性,将RIHA方法改良为:1)将被检样品稀释为几个适宜稀释度,分别做RIHA检测;2)检测孔100%、75%、50%、25%、0%凝集分别记录为4... 为提高反向间接血凝试验(reverse indirect hemagglutination assay,RIHA)定量检测PCV2 Cap抗原的稳定性和精准性,将RIHA方法改良为:1)将被检样品稀释为几个适宜稀释度,分别做RIHA检测;2)检测孔100%、75%、50%、25%、0%凝集分别记录为4、3、2、1、0分,将几个稀释度的被检样品全部检测孔的分数加和;3)同法检测参照品并将参照品分数加和;4)被检样品与参照品总分数对比计算,获得被检样品抗原含量。改良的RIHA方法进行稳定性评价并与ELISA方法做比较。结果显示,改良RIHA方法的批内差异为6.8%~19.4%、批间差异为11.4%~23.6%、检测同一个样品差异系数为8.5%,均优于常规RIHA方法。改良RIHA方法检测纯化前和纯化后的PCV2 Cap抗原共30份,与ELISA方法检测结果比较相关系数为0.9568。研究结果表明,改良的PCV2 Cap抗原RIHA定量检测方法稳定性良好,且与ELISA方法检测结果有相关性,可在PCV2 Cap抗原生产中做定量检测,也可在毒种筛选、生产工艺优化中快速定量检测PCV2 Cap抗原含量。 展开更多

关键词 pcv2 Cap抗原 改良 反向间接血凝试验(RIHA) ELISA 定量检测

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2024年湖南省猪圆环病毒2型和3型ORF2基因的遗传变异分析

9

作者 吴湘文 范仲鑫 +5 位作者 唐小明 王卫国 张坤 彭志 谢怡灵 胡巧云 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第10期1086-1092,共7页

为研究2024年湖南省猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)ORF2基因的分子特征及遗传变异规律,本研究采集湖南省14个地级市的1350份猪临床样品,采用多重荧光定量PCR(qPCR)检测,统计不同地区PCV2和PCV3的检测结果及与其他病原混合感染情况,并... 为研究2024年湖南省猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)ORF2基因的分子特征及遗传变异规律,本研究采集湖南省14个地级市的1350份猪临床样品,采用多重荧光定量PCR(qPCR)检测,统计不同地区PCV2和PCV3的检测结果及与其他病原混合感染情况,并挑选部分Ct值低的阳性样品,对ORF2基因扩增、测序及构建进化树,采用MegAlign分析ORF2基因的同源性及其编码蛋白Cap的氨基酸序列。qPCR检测及统计结果显示:PCV2和PCV3的阳性率分别为50.29%(679/1350)和29.85%(403/1350),二者混合感染率达16.22%(219/1350),同时也存在PCV和其他病原(PRRSV、CSFV)混合感染的情况。经PCR扩增PCV2与PCV3的ORF2基因并测序获得PCV2和PCV3的ORF2基因序列分别为69条和65条,其中PCV2与参考株的ORF2基因序列和Cap蛋白氨基酸序列同源性分别为89.4%~99.9%、88.1%~99.6%;PCV3与参考株的ORF2基因序列和Cap蛋白氨基酸序列的同源性分别为97.2%~100%、95.8%~100%。遗传进化树结果显示,PCV2d(81.2%,56/69)和PCV3c(78.4%,51/65)为湖南省绝对优势基因型,其中PCV3c的高流行率为省内首次报道,在中国其他省份也较为罕见。氨基酸序列分析结果显示:PCV2 Cap蛋白氨基酸序列的aa53~aa91、aa121~aa151、aa169~aa233存在高频率的氨基酸突变,PCV3 Cap蛋白的抗原表位呈较高的保守性。本研究为湖南省PCV2和PCV3感染的防控提供参考依据,也为相关疫苗研发与疫病监测提供数据支持。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 猪圆环病毒3型 CAP蛋白 遗传变异分析 混合感染

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稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的CHO-K1细胞系的建立及免疫原性分析 被引量：4

10

作者 武乐祎 吴素芳 +4 位作者 车影 张强 李鹏 卞广林 王选年 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1056-1063,共8页

建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到... 建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到高表达Cap蛋白的悬浮稳转单克隆细胞株,并对该细胞株进行发酵,纯化得到的目的蛋白,通过小鼠免疫验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中正确表达;发酵过程中活细胞密度高达6×10~6个·mL^(-1),细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg·L^(-1);利用间接ELISA检测小鼠免疫后血清中的抗体水平,证明了利用CHO-K1细胞生产的Cap蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并进一步对目的蛋白进行免疫原性分析,为猪圆环病毒亚单位疫苗的开发打下扎实的基础。 展开更多

关键词 CHO-K1 pcv2-cap 稳转细胞系 免疫原性

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猪α干扰素对猪圆环病毒2型亚单位疫苗免疫效果的影响 被引量：14

11

作者 曹瑞兵 周国栋 陈溥言 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期867-872,共6页

为了评估酵母表达的PCV2 Cap蛋白在猪体的免疫特性以及猪α干扰素对其的免疫佐剂效果,将酵母表达的PCV2 Cap蛋白配比适量的铝胶或重组猪α干扰素制成亚单位疫苗。30日龄仔猪分别接种铝胶佐剂亚单位疫苗和猪α干扰素佐剂亚单位疫苗,同时... 为了评估酵母表达的PCV2 Cap蛋白在猪体的免疫特性以及猪α干扰素对其的免疫佐剂效果,将酵母表达的PCV2 Cap蛋白配比适量的铝胶或重组猪α干扰素制成亚单位疫苗。30日龄仔猪分别接种铝胶佐剂亚单位疫苗和猪α干扰素佐剂亚单位疫苗,同时设攻毒对照与空白对照,首免后21 d加强免疫,二免后14 d用PCV2 JS株攻毒。铝胶佐剂亚单位疫苗免疫猪体后产生了PCV2特异性中和抗体。猪α干扰素佐剂亚单位疫苗组仔猪免疫后产生的ELISA抗体和中和抗体都显著高于铝胶亚单位疫苗组仔猪。攻毒对照组的4只仔猪攻毒后全都产生了病毒血症,并有较长时间的发热;铝胶亚单位疫苗组4头仔猪中只有1头仔猪产生病毒血症,添加猪α干扰素亚单位疫苗组的仔猪攻毒后都没有产生病毒血症。综合分析试验猪的病毒感染、临床表现和生产性能等情况表明Cap蛋白亚单位疫苗具有免疫保护效果,猪α干扰素可显著增强Cap蛋白亚单位疫苗接种仔猪的体液免疫反应,提高PCV-2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护效果。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 重组CAP蛋白 免疫特性 猪Α干扰素 免疫佐剂

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猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达 被引量：4

12

作者 宋云峰 肖少波 +3 位作者 曹胜波 张松林 陈焕春 金梅林 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期155-158,共4页

用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组... 用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证明该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白。重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定。该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8TCID50/0.1mL。 展开更多

关键词 猪2型圆环病毒(pcv2) CAP蛋白 ORF2基因 疫苗

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应用高效体积排阻色谱偶联多角度激光散射鉴定猪圆环病毒2型灭活疫苗及病毒样颗粒疫苗抗原 被引量：6

13

作者 徐嫄 杨延丽 +10 位作者 邹兴启 李翠 朱元源 秦义娴 李琰 盛亚男 刘业兵 彭国瑞 徐小艾 张松平 赵启祖 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期2948-2958,共11页

本文旨在建立基于高效体积排阻色谱(high-performance size-exclusion chromatography,HPSEC)偶联多角度激光散射仪(multi-angle laser light scattering,MALLS)的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗抗原检测方法。以... 本文旨在建立基于高效体积排阻色谱(high-performance size-exclusion chromatography,HPSEC)偶联多角度激光散射仪(multi-angle laser light scattering,MALLS)的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗抗原检测方法。以纯化的PCV2灭活病毒及病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)为参照,对4家生产企业的2种PCV2灭活病毒疫苗(a、b)及VLP疫苗(c、d)破乳后进行HPSEC-MALLS检测及分子量分析;结合PCV2抗原检测卡、Western blotting和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM),鉴定了特征色谱峰;考察了方法的重复性和检测线性。结果表明,两家企业生产的PCV2灭活病毒疫苗破乳液水相经HPSEC分离,在保留时间约13.3 min处出现抗原特征峰;MALLS计算该色谱峰分子量分别为2.61×10^(6)(±4.34%)Da和2.40×10^(6)(±2.51%)Da。两种VLP疫苗也在13.3 min处出现抗原特征峰,分子量分别为2.09×10^(6)(±2.94%)Da和2.88×10^(6)(±11.85%)Da,接近PCV2的理论分子量;同时在保留时间约11.4 min处也出现色谱峰,经检测分子量为4.37×10^(6)(±0.42%)Da,TEM表征显示为VLP二聚体。取疫苗d和PCV2 VLP纯品进行重复检测,抗原色谱峰面积的RSD(n=3)均小于1.5%,重复性好;将PCV2 VLP纯品梯度稀释检测,VLP及其多聚体的色谱峰面积与浓度均呈良好的线性关系,R2分别为0.999及0.997,能够满足定量及多聚体含量分析。该方法有望成为一种准确、高效的PCV2疫苗的体外评价方法,用于质量评价与提升。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 病毒样颗粒 疫苗 高效体积排阻色谱 多角度激光散射

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猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达 被引量：7

14

作者 李海花 覃尧 +1 位作者 张全红 李秀丽 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第2期337-341,共5页

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2TJ株扩增... Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 Cap基因 克隆 原核表达

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猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建及表达 被引量：4

15

作者 欧阳素贞 张福良 +2 位作者 王双山 王国栋 刘书梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期165-168,共4页

根据PCV2 Cap蛋白基因的序列设计引物,从1份患PMWS仔猪组织病料中扩增出Cap蛋白基因(702 bp)。并利用基因工程技术将Cap蛋白基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将其与腺病毒骨架载体(pAdeasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重... 根据PCV2 Cap蛋白基因的序列设计引物,从1份患PMWS仔猪组织病料中扩增出Cap蛋白基因(702 bp)。并利用基因工程技术将Cap蛋白基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将其与腺病毒骨架载体(pAdeasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒。通过免疫荧光、PCR和Western blot检测证明PCV2 Cap蛋白基因在293细胞内获得表达。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型(pcv2) CAP蛋白 腺病毒

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猪圆环病毒2型Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白在杆状病毒中共表达及鉴定 被引量：3

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作者 王一平 郭龙军 +7 位作者 唐青海 刘丹 危艳武 李胜斌 刘建波 黄立平 吴洪丽 刘长明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期44-47,共4页

为在真核细胞中共表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白,本研究将其各自编码基因克隆于杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)中构建重组转移质粒(pFBD-Cap-VP1),转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组杆粒(rBacm... 为在真核细胞中共表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白,本研究将其各自编码基因克隆于杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)中构建重组转移质粒(pFBD-Cap-VP1),转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组杆粒(rBacmid-Cap-VP1),并转染Sf21昆虫细胞,拯救出能够共表达PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白的重组杆状病毒(rBac-Cap-VP1)。SDS-PAGE和western blot检测结果表明,共表达的重组PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白产物的分子量分别为28 ku和30 ku,各占总蛋白含量的11.6%和3.4%,能够分别与PCV2和FMDV抗体发生特异性反应,表明共表达蛋白具有良好的反应原性。本研究为PCV2和FMDV基因工程二联亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 猪O型口蹄疫病毒 CAP蛋白 VP1蛋白 共表达

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猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备及免疫原性评价 被引量：5

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作者 赵强 赵云环 +5 位作者 郭禹 翟刚 张帅 郭晓旭 范京惠 左玉柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1529-1534,共6页

旨在利用原核表达系统在大肠杆菌中制备出猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),用改良的镍亲和层析法纯化并在小鼠体内评价其免疫原性。通过PCR方法从发病猪中扩增出PCV2的ORF2序列,对其全长进行密码子优化并交由公司合成重组质粒pET-32... 旨在利用原核表达系统在大肠杆菌中制备出猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),用改良的镍亲和层析法纯化并在小鼠体内评价其免疫原性。通过PCR方法从发病猪中扩增出PCV2的ORF2序列,对其全长进行密码子优化并交由公司合成重组质粒pET-32a-yCap;以BL21(DE3)为表达菌株,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE与Western blot对Cap蛋白的表达方式及抗原特异性进行鉴定;利用改良的镍亲和层析法纯化带有His-Tag标签的重组蛋白;利用透射电镜观察所纯化的载体融合蛋白能否形成VLP;用自制的VLP疫苗与PCV2灭活疫苗(ZJ/C株)分别免疫小鼠,利用商业化PCV2 IgG抗体ELISA检测试剂盒评价其免疫原性。结果显示,成功得到PCV2 ORF2序列和重组质粒pET-32a-yCap,重组质粒在大肠杆菌中主要以可溶性蛋白形式表达,蛋白大小为47 kDa;经镍亲和层析法纯化可得到单一的目的蛋白;重组Cap蛋白能与PCV2多克隆抗体及HRP标记的6*His,His-Tag小鼠单克隆抗体发生特异性结合;经过磷钨酸负染色的蛋白悬液在透射电镜下可观察到大量规则的、直径在17~20 nm的VLP;2种疫苗均能诱导刺激小鼠产生抗体应答反应,VLP组诱导产生的水平更高。综上所述,本研究实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,经改良的镍亲和层析法可得到单一的目的蛋白,能够在体外自发的组装成病毒样颗粒,免疫小鼠后可刺激抗体应答反应,可用于制备亚单位疫苗及相关生物制品。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 可溶性表达 病毒样颗粒

原文传递

猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化与鉴定 被引量：3

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作者 周景明 贾蕊 +5 位作者 刘红亮 祁艳华 聂守一 陈冰 张改平 王爱萍 《动物医学进展》 北大核心 2017年第9期23-27,共5页

为了获得具有良好免疫原性的猪圆环病毒2型重组Cap蛋白,对pET-28a-ORF2-BL21重组菌种进行IPTG诱导表达,利用镍亲和层析法纯化可溶性重组蛋白,并利用Western blot和ELISA鉴定其免疫反应性。结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为26ku,主... 为了获得具有良好免疫原性的猪圆环病毒2型重组Cap蛋白,对pET-28a-ORF2-BL21重组菌种进行IPTG诱导表达,利用镍亲和层析法纯化可溶性重组蛋白,并利用Western blot和ELISA鉴定其免疫反应性。结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为26ku,主要以可溶性蛋白的形式存在,纯化后的蛋白纯度可达到90%以上,浓度为1.31mg/mL,产量为30.6mg/L菌液。Western blot和间接ELISA证实,重组蛋白能够与PCV2阳性血清反应。结果表明,所制备的Cap蛋白具有较高的纯度和较好的免疫反应性,有望用于PCV2抗体检测免疫试纸的研制。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 核衣壳蛋白 蛋白纯化 鉴定

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猪圆环病毒2型Cap蛋白琼脂扩散试验检测方法的建立 被引量：5

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作者 庄金秋 梅建国 +2 位作者 张颖 董林 李峰 《中国动物检疫》 CAS 2020年第9期113-117,共5页

为便于快速、准确检测猪圆环病毒2型(PCV2),减少其对我国养猪业的威胁,建立了PCV2 Cap蛋白琼脂扩散试验(AGP)检测方法。应用表达制备好的PCV2 Cap蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,制备多克隆抗体并进行抗体效价测定。确定AGP最佳工作条件... 为便于快速、准确检测猪圆环病毒2型(PCV2),减少其对我国养猪业的威胁,建立了PCV2 Cap蛋白琼脂扩散试验(AGP)检测方法。应用表达制备好的PCV2 Cap蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,制备多克隆抗体并进行抗体效价测定。确定AGP最佳工作条件,并进行抗体特异性、稳定性及符合率试验。结果显示:制备的多克隆抗体ELISA效价可达1:12800,AGP效价可达1:32,表明其具有良好的特异性、稳定性;对20份PCV2 Cap蛋白抗原进行检测,发现其结果与应用标准猪血清抗体检测结果符合率为100%。结果表明,制备的抗PCV2 Cap蛋白多克隆抗体可替代标准抗体,用于PCV2 Cap蛋白的AGP试验检测。本研究为PCV2检测以及后续的免疫学特性研究提供了技术支撑。 展开更多

关键词 pcv2 Cap蛋白 多克隆抗体 琼脂扩散试验

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猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒表面的展示 被引量：2

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作者 邢福珊 许信刚 +2 位作者 童德文 王志昇 张彦明 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2010年第12期7-9,共3页

本试验将猪圆环病毒2型(PCV2)去核定位区ORF2基因克隆到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC中,转化DH10Bac大肠杆菌感受态,经抗性及蓝白斑筛选得到含ORF2基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病... 本试验将猪圆环病毒2型(PCV2)去核定位区ORF2基因克隆到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC中,转化DH10Bac大肠杆菌感受态,经抗性及蓝白斑筛选得到含ORF2基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。对重组病毒进行Western-blot分析和免疫金电子显微镜检测。结果表明,PCV2 Cap蛋白在重组杆状病毒中获得表达;免疫金电子显微镜观察表明,重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。本试验成功构建表面展示PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用重组杆状病毒作为亚单位疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 杆状病毒表面展示 猪圆环病毒2型 CAP蛋白

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