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用Overlap-PCR法从Trichodermareesei QM9414基因组DNA中克隆并表达木聚糖酶Ⅲ 被引量：7
1
作者 陆长梅 袁生 赵庆新 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期764-769,共6页
禾本科植物木聚糖酶在其成熟过程中需在细胞进入程序性死亡后 ,经蛋白水解酶多次剪切方显活性 ,常规蛋白质克隆表达系统无法表达这类酶。通过GenBank搜索获得一与之同族、结构相似的来源于T .reeseiQM94 1 4(ATCC2 6 92 1 )突变种PC 3 ... 禾本科植物木聚糖酶在其成熟过程中需在细胞进入程序性死亡后 ,经蛋白水解酶多次剪切方显活性 ,常规蛋白质克隆表达系统无法表达这类酶。通过GenBank搜索获得一与之同族、结构相似的来源于T .reeseiQM94 1 4(ATCC2 6 92 1 )突变种PC 3 7菌株的xynⅢ。但该酶在T .reeseiQM94 1 4中不表达 ,而在基因组中存在。通过overlap PCR法将 4个外显子分别克隆、测序 ,再连接测序 ,最终获得该基因的全长cDNA序列。将该基因连接到表达载体pETBlue 2上 ,并转化到TunerDE3表达菌株中 ,常规条件下可表达并有木聚糖酶活性显示。低温 (1 5℃ ) 6 展开更多
关键词 木聚糖酶 禾本科植物 基因组DNA 克隆 表达
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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：3
2
作者 王永飞 邓博文 +5 位作者 刘晓艳 哈尔勒哈·阿曼太 郭嘉栋 周正国 蔡江 李有文 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期689-699,共11页
[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu... [目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 重叠延伸PCR EF-Tu基因 多克隆抗体
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重组腺相关病毒装载目的核酸完整性分析
3
作者 黄天治 秦玺 +4 位作者 于雷 郑祖亮 郭林 史新昌 张怡轩 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第6期641-645,共5页
目的探讨重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)装载目的核酸完整性检测方法,并初步建立分析算法。方法消化rAAV外游离DNA片段,提取病毒基因组,设计5对搭接引物,采用正交排列方式,分别用数字PCR仪进行检测,常规条件... 目的探讨重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)装载目的核酸完整性检测方法,并初步建立分析算法。方法消化rAAV外游离DNA片段,提取病毒基因组,设计5对搭接引物,采用正交排列方式,分别用数字PCR仪进行检测,常规条件采用EveGreen和模板4μL的20μL反应体系,数字PCR条件:95℃5 min;95℃15 s,55℃30 s,72℃90 s,45个循环。超长核酸片段增强条件采用Mix B-2000 bp和模板2μL的25μL反应体系,采用仪器附带软件定量。最小二乘法拟合分析共有的全长片段数量,进而解读目的核酸完整性分布情况。结果引物间距离不大于1200 nt的片段可得到有效扩增,经系统分析得到一系列片段长约1000 nt的有效片段拷贝数,最小二乘法拟合分析共有片段拷贝数量,估计样本中全长片段不多于1234 copies/μL,该值与测得的最大值(1443 copies/μL)之间差异有统计学意义(P<0.05),差异占比约16.9%。结论初步建立了rAAV装载目的核酸完整性的检测方法,并分析出供试品中存在一定数量的不完整目的核酸,为后续深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 重组腺相关病毒 核酸 完整性 数字PCR 重叠
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重组人白介素21的原核表达与体外活性研究的优化 被引量：1
4
作者 王彤 张娟 +4 位作者 厉道娟 罗晨 吴沁航 高美风 王旻 《药物生物技术》 CAS 2013年第4期283-287,共5页
为了构建重组人白介素21(rhIL-21)原核稳定表达和体外活性检测系统,采用Overlap-PCR法合成目的基因;经双酶切整合至pET28,化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)构建pET-28a-rhIL-21 BL21(DE3)原核表达系统;胞内表达的包涵体经镍亲和层析色... 为了构建重组人白介素21(rhIL-21)原核稳定表达和体外活性检测系统,采用Overlap-PCR法合成目的基因;经双酶切整合至pET28,化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)构建pET-28a-rhIL-21 BL21(DE3)原核表达系统;胞内表达的包涵体经镍亲和层析色谱柱纯化后,尿素缓冲液梯度透析复性,最终溶于PBS缓冲液;双抗体夹心法ELISA、Western blotting检测复性蛋白的生物活性;细胞增殖抑制试验(MTT法)研究rhIL-21对Jurkat细胞株和HuT102细胞株的作用。实验成功建立了rhIL-21表达纯化与活性评价体系,为进一步研究IL-21的促免疫性疾病发展和抗肿瘤活性奠定了基础。 展开更多
关键词 重组人白介素21 overlap-pcr 原核表达 亲和层析 复性 细胞增殖抑制
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β-防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa1-6中的稳定表达 被引量：1
5
作者 梅寒芳 金小宝 朱家勇 《中国老年学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1213-1215,共3页
目的克隆抗菌肽β防御素2(mBD2)基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa1-6细胞中稳定表达。方法Trizol试剂提取C57BL/6鼠肾总RNA,RT-PCR扩增mBD2成熟肽基因,Overlap-PCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因,克隆至真核表达载体pcDNA... 目的克隆抗菌肽β防御素2(mBD2)基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa1-6细胞中稳定表达。方法Trizol试剂提取C57BL/6鼠肾总RNA,RT-PCR扩增mBD2成熟肽基因,Overlap-PCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),PCR、酶切和测序鉴定正确后,脂质体法转染Hepa1-6细胞,G418筛选,RT-PCR和Western印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达。结果成功克隆含有信号肽的IgК-mBD2序列,并且构建pcDNA3.1(+)/IgК-mBD2真核分泌性表达载体,实现了mBD2分子在Hepa1-6细胞中稳定表达,RT-PCR从细胞总RNA中扩增得到202bp的IgК-mBD2基因,Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋白分子表达。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/IgК-mBD2真核分泌性表达载体,转染得到稳定表达mBD2的Hepa1-6细胞株,为进一步研究mBD2的生物学特性及抗肝癌机制奠定细胞学基础。 展开更多
关键词 防御素 天然免疫 肝癌 overlap-pcr
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改造稀有密码子提高SEA蛋白表达量 被引量：22
6
作者 时成波 吕安国 +3 位作者 吴文芳 杨立泉 冯家勋 柏学亮 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期477-480,共4页
利用重叠PCR技术突变了sea基因上一个稀有密码子簇 ,将此段中稀有密码子全部更换成E .coli最常用密码子 ,得到seam 。将sea和seam 分别克隆于 7ZTS表达载体上 ,并转化JM10 9(DE3)菌株。结果表明 ,sea基因的表达十分微弱 ,而seam 基因的... 利用重叠PCR技术突变了sea基因上一个稀有密码子簇 ,将此段中稀有密码子全部更换成E .coli最常用密码子 ,得到seam 。将sea和seam 分别克隆于 7ZTS表达载体上 ,并转化JM10 9(DE3)菌株。结果表明 ,sea基因的表达十分微弱 ,而seam 基因的表达量十分高 ,约占菌体总蛋白的 15 %。表达产物在体内具有一定的抗肿瘤活性。 展开更多
关键词 改造 稀有密码子 SEA蛋白 表达量 表达载体
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绿色荧光蛋白基因标记野生型生防枯草芽孢杆菌的研究 被引量：24
7
作者 姚震声 陈中义 +3 位作者 陈志谊 郑小波 张杰 黄大昉 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期551-555,T002,共6页
根据绿色荧光蛋白基因和枯草芽孢杆菌木糖诱导型启动子PxylR序列 ,分别设计两对特异引物primersPxyF R和primersgfpF R ,扩增获得了完整的启动子PxylR和gfp基因序列。进一步以上述产物混合物为模板 ,以primerPxyF primergfpR做引物进行... 根据绿色荧光蛋白基因和枯草芽孢杆菌木糖诱导型启动子PxylR序列 ,分别设计两对特异引物primersPxyF R和primersgfpF R ,扩增获得了完整的启动子PxylR和gfp基因序列。进一步以上述产物混合物为模板 ,以primerPxyF primergfpR做引物进行重迭PCR ,获得了PxylR gfp重组翻译融合表达盒。经SphⅠ和KpnⅠ完全酶切后 ,将PxylR gfp表达盒分别插入大肠杆菌_苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315和大肠杆菌 枯草芽孢杆菌穿梭载体pRP2 2。相应的重组表达质粒pGFP315和pGFP2 2转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。前者在标准菌株 16 8中得到良好发光表型 ,后者则在标准菌株 16 8和野生目标菌株B916中均得到良好的发光表型。室内平板抑菌实验结果显示B916生防效果与出发菌株没有明显差异 ,遗传稳定性研究表明连续稀释培养约 175代后 ,工程菌株稳定性为 94 % ,质粒丢失频率低于 3 5× 10 - 4 代。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白基因 重迭PcR 枯草芽孢杆菌 生物防治 基因工程
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替换稀有密码子提高HBsAg在CHO细胞中的表达量 被引量：5
8
作者 单连慧 时成波 +3 位作者 孔双泉 田晓乐 杨亦代 盛军 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2004年第4期214-216,共3页
目的　通过替换S基因稀有密码子 ,提高HBsAg在CHO细胞中的表达量。方法　利用重叠PCR技术 ,将S基因上 3个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子 ,得到Sm 基因。把S和Sm 基因分别克隆到pCI载体上 ,并转染CHO(dhfr )细胞 ,利用ELISA... 目的　通过替换S基因稀有密码子 ,提高HBsAg在CHO细胞中的表达量。方法　利用重叠PCR技术 ,将S基因上 3个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子 ,得到Sm 基因。把S和Sm 基因分别克隆到pCI载体上 ,并转染CHO(dhfr )细胞 ,利用ELISA方法检测HBsAg的表达量。结果　获得预期的Sm 基因。在CHO细胞中 ,Sm 基因表达量明显高于S基因。 展开更多
关键词 重叠PCR 稀有密码子 HBSAG CHO细胞 表达 基因
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油茶FAD2基因全长cDNA的克隆和序列分析 被引量：39
9
作者 谭晓风 陈鸿鹏 +6 位作者 张党权 曾艳玲 李魏 蒋瑶 谢禄山 胡孝义 胡芳名 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第3期70-75,共6页
FAD2基因控制油酸转化为亚油酸,是油茶油脂合成代谢的关键酶基因。在构建的油茶EST文库基础上,采用5′RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶FAD2基因的全长cDNA克隆。该基因序列长1682bp,开放阅读框为1149bp,编码382个氨基酸,并且具有FAD2... FAD2基因控制油酸转化为亚油酸,是油茶油脂合成代谢的关键酶基因。在构建的油茶EST文库基础上,采用5′RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶FAD2基因的全长cDNA克隆。该基因序列长1682bp,开放阅读框为1149bp,编码382个氨基酸,并且具有FAD2特有的保守序列和相关特征。经过比对分析,发现油茶的FAD2基因与其他植物的FAD2基因具有较高的相似性。 展开更多
关键词 油茶 EST文库 FAD2基因 RACE 交错延伸PCR 基因克隆
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运用CRISPR/Cas系统敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其对脂肪酸代谢的影响 被引量：9
10
作者 夏军 郑明刚 +3 位作者 王玲 孙承君 郑立 祝建波 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1864-1871,共8页
【目的】CRISPR/Cas是目前基因编辑的一个重要的新兴技术,拟通过该技术,对大肠杆菌进行快速、高效的基因编辑,获取脂肪酸代谢工程菌。【方法】利用一个二元载体构建出CRISPR/Cas偶联λ-Red重组酶的系统,重叠PCR扩增出敲除的Donor,最后... 【目的】CRISPR/Cas是目前基因编辑的一个重要的新兴技术,拟通过该技术,对大肠杆菌进行快速、高效的基因编辑,获取脂肪酸代谢工程菌。【方法】利用一个二元载体构建出CRISPR/Cas偶联λ-Red重组酶的系统,重叠PCR扩增出敲除的Donor,最后用电转的方式对Escherichia coli MG1655脂肪酸代谢相关基因进行快速编辑。同时,采用气相色谱-质谱(GC-MS)对脂肪酸进行定性及定量分析。【结果】获得了大肠杆菌ΔPEPC(partial)、ΔPEPC、ΔPEPC(partial)-ΔFad D、ΔPEPC-ΔFad D以及ΔFad D突变体菌株。各缺失体菌株脂肪酸含量均比野生型要高,最高的增长了3.7%,但是敲除ppc获得的脂肪酸增长量并没有预期的高。同时在脂肪酸组成上,各菌株均含有11:0、12:0、13:0、14:0、15:0、16:0、17:1、17:0、18:0,并且16:0,17:0,18:0占主要组成部分。【结论】运用该技术可以快速、高效地对大肠杆菌基因进行编辑,是大肠杆菌工程菌株构建的一个新思路,对其他工程菌的构建提供了一定的理论基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas 反向PCR GC-MS λ-Red重组酶 PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶) 脂肪酸含量
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PCV2a-ORF3基因缺失株感染性克隆的构建 被引量：7
11
作者 湛洋 胡意 +2 位作者 王东亮 蔡杰 邓治邦 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期351-355,共5页
为构建猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染性克隆及其ORF3缺失的感染性克隆,本研究通过比较分析Gen Bank中8种亚型的PCV2基因组序列(各3株),设计了PCV2基因全长克隆引物,以从江西省萍乡市某猪场疑似感染断奶仔猪多系统衰竭综合征病死猪的病料... 为构建猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染性克隆及其ORF3缺失的感染性克隆,本研究通过比较分析Gen Bank中8种亚型的PCV2基因组序列(各3株),设计了PCV2基因全长克隆引物,以从江西省萍乡市某猪场疑似感染断奶仔猪多系统衰竭综合征病死猪的病料中提取的DNA为模板,利用PCR方法扩增PCV2全长基因序列并进行测序。利用分子生物学软件对测序结果分析,结果表明所获得的克隆为PCV2a-2A基因型。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增病毒全长基因组DNA,克隆于p SP72载体中构建野生型PCV2a病毒株感染性克隆。此外,采用SOE-PCR方法,缺失野生型PCV2a感染性克隆中的阅读框3(ORF3),并将这两种重组质粒分别转染PK15细胞,盲传6代后经PCR和间接免疫荧光方法检测显示,构建的PCV2a病毒株与PCV2a-ORF3突变株克隆均具有感染性。本研究为进一步探究ORF3基因对PCV2致病机理和免疫原性的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 PCV2 ORF3基因 基因缺失 重叠延伸PCR
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重叠PCR法合成轮状病毒抗原基因VP4 被引量：8
12
作者 冉丹霞 王荣荣 +2 位作者 郝亚宁 宋方洲 马永平 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期118-119,124,共3页
用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了... 用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了重叠延伸PCR法是获得目的基因的有效方法。 展开更多
关键词 轮状病毒 VP4基因 合成 重叠延伸PCR
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兔出血症病毒与欧洲野兔综合征病毒复合RT-PCR检测方法的建立 被引量：14
13
作者 王印 杨泽晓 +3 位作者 韩雪清 汪开毓 姚学萍 白瑜 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1165-1170,共6页
为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构... 为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构建的重组质粒pGM-T-EBHSV和RHDV RT-PCR产物构建的pGM-T-RHDV为模板,经过反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,初步建立了RHDV和EBHSV的复合RT-PCR检测方法,并对20份临床样品和5份RHDV人工感染样品进行了检测。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和EBHSV的特异性目的片段192bp和335bp,对2种病毒的检测限度均可达到50copies的目的基因片段,兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌和沙门氏菌核酸扩增均为阴性。样品检测结果显示,5份人工感染样品的RHDV检出率为100%,20份临床样品的RHDV检测为阴性。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 欧洲野兔综合征病毒 反转录-聚合酶链反应 重叠延伸PCR
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兔出血症病毒与兔出血症病毒2型复合RT-PCR检测方法的初步研究 被引量：8
14
作者 杨泽晓 赵希仑 +6 位作者 李岩 姚学萍 王印 刘亚东 蒙正群 耿毅 白瑜 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期710-716,共7页
为建立用于兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)鉴别诊断的检测方法。根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,设计合成6对特异性引物和10条搭桥引物,采用RT-PCR和搭桥PCR技术分别获取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守区片段,... 为建立用于兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)鉴别诊断的检测方法。根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,设计合成6对特异性引物和10条搭桥引物,采用RT-PCR和搭桥PCR技术分别获取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守区片段,构建重组质粒p MD-19T-RHDV2、p MD-19T-RHDV441和p MD-19T-RHDV294,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及人工感染RHDV样品和临床样品的应用,对RHDV与RHDV2的复合RT-PCR检测方法进行了初步研究。结果显示,建立的RHDV与RHDV2复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和RHDV2的VP60保守区基因片段大小为294 bp和435 bp,RHDV与RHDV2的检测限度分别为160和230个拷贝的靶基因片段,而p GM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和沙门菌等病原的检测结果均为阴性。样品检测结果显示,人工感染样品的RHDV检出率为100%(5/5),30份临床检样RHDV和RHDV2检测结果均为阴性。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 兔出血症病毒2型 RT-PCR 搭桥PCR
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氯灭活水中脊髓灰质炎病毒机制的研究 被引量：4
15
作者 赵祖国 喻云梅 +2 位作者 金敏 王新为 李君文 《环境与健康杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期491-494,共4页
目的探讨氯对脊髓灰质炎病毒核酸和衣壳蛋白的破坏在灭活病毒中的作用,并对病毒基因组受损区域进行定位,阐明氯灭活脊髓灰质炎病毒的机制。方法以不同剂量(0.1、0.5、1.0、1.5和2.0mg/L)的有效氯对脊髓灰质炎病毒作用不同时间(0、15、30... 目的探讨氯对脊髓灰质炎病毒核酸和衣壳蛋白的破坏在灭活病毒中的作用,并对病毒基因组受损区域进行定位,阐明氯灭活脊髓灰质炎病毒的机制。方法以不同剂量(0.1、0.5、1.0、1.5和2.0mg/L)的有效氯对脊髓灰质炎病毒作用不同时间(0、15、30、45和60min),采用大片断逐步步移PCR(long-overlapping PCR)分析氯对病毒全基因组的损伤,以ELISA技术分析氯对病毒衣壳蛋白的破坏,以细胞培养检测病毒感染性。结果脊髓灰质炎病毒各部分对氯的抵抗力强弱存在如下关系:病毒衣壳>基因组蛋白编码区>基因组5′端非编码区(noncoding region,NCR)>基因组3′端NCR>poly A尾;脊髓灰质炎病毒的polyA尾和3'端NCR破坏可造成病毒的感染性下降,但不能完全灭活病毒;5′端NCR的破坏与病毒感染性的消失一致,损伤区域主要位于富含二级结构的区域。结论氯主要通过破坏脊髓灰质炎病毒核酸而非衣壳蛋白灭活病毒;病毒基因组5′NCR内二级结构区域的破坏对脊髓灰质炎病毒具有致死效应。 展开更多
关键词 水 消毒 脊髓灰质炎病毒 氯 大片断逐步步移PCR 非编码区
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日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因合成、表达与免疫原性研究 被引量：4
16
作者 余传信 李健 +3 位作者 殷旭仁 华万全 梁幼生 高琪 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期161-165,共5页
目的合成和表达日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因,并研究其免疫原性。方法采用重叠PCR人工合成日本血吸虫TSP2HD(aa107～aa182)完整基因片段,经测序正确后,将此片段插入表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒TSP2HD-PG,转化... 目的合成和表达日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团(TSP2HD)基因,并研究其免疫原性。方法采用重叠PCR人工合成日本血吸虫TSP2HD(aa107～aa182)完整基因片段,经测序正确后,将此片段插入表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒TSP2HD-PG,转化大肠埃希菌BL21(DE3),获得含重组表达质粒的转化子,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察TSP2HD融合蛋白表达情况。用谷胱甘肽(GST)融合蛋白纯化胶(glutathione sepharose 4B)从表达产物裂解上清中纯化GST-TSP2HD融合蛋白,用凝血酶切割融合蛋白,制备纯化的重组TSP2HD蛋白。通过蛋白质印迹(Western blotting)分析重组TSP2HD蛋白与血吸虫病患者血清及血吸虫重感染兔血清的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白刺激血吸虫感染小鼠淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验,通过比较实验组与对照组脉冲指数(cpm)值的差异研究重组TSP2HD蛋白的免疫原性。结果经过3轮重叠PCR扩增,获得长228bp的TSP2HD基因,序列分析证实与天然基因序列完全一致。含重组质粒TSP2HD-PG的转化子细菌,经IPTG诱导后表达相对分子质量(Mr)约为34000的可溶性GST-TSP2HD融合蛋白。凝血酶切割GST-TSP2HD融合蛋白获得纯化的重组TSP2HD蛋白。Western blotting分析证明,重组表达蛋白可被血吸虫重感染兔血清和血吸虫病患者血清识别,有较好的免疫反应性;重组TSP2HD蛋白能刺激血吸虫感染小鼠脾细胞增殖,实验组cpm值明显高于对照组,两者间差异有统计学意义(P<0.01)。结论日本血吸虫TSP2HD基因合成及表达获得成功,重组TSP2HD蛋白有天然免疫原性。 展开更多
关键词 日本血吸虫 四跨膜蛋白第二亲水基团基因 重叠PCR 基因合成 表达 免疫原性
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豆豉纤溶酶在枯草杆菌WB800中的高水平表达(英文) 被引量：10
17
作者 罗文华 郭勇 韩双艳 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期565-569,共5页
一个来源于豆豉产生菌DC12的新的纤溶酶基因序列被克隆测序.为了实现在枯草杆菌中高水平表达豆豉纤溶酶,将来源于枯草杆菌168的重叠启动子P43序列以及转录终止信号序列通过重叠延伸融合,将融合序列克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3... 一个来源于豆豉产生菌DC12的新的纤溶酶基因序列被克隆测序.为了实现在枯草杆菌中高水平表达豆豉纤溶酶,将来源于枯草杆菌168的重叠启动子P43序列以及转录终止信号序列通过重叠延伸融合,将融合序列克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3中,构建了pBEP43载体.将豆豉纤溶酶基因插入到载体pBEP43后转化枯草杆菌WB800.结果表明,在P43启动子驱动下,豆豉纤溶酶基因在重组菌中的对数生长期和平衡期均获得了表达且分泌到培养基中.重组菌经培养后上清液中的纤溶酶活性最高达1270U/mL,是豆豉纤溶酶基因在自身启动子驱动下表达量的1.87倍和野生菌株枯草杆菌DC12表达量的4.1倍. 展开更多
关键词 豆豉纤溶酶 枯草杆菌 启动子P43 重叠PCR 基因表达
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λpL/pR-cI857温控系统的改造及其对大肠杆菌菌蜕制备的影响 被引量：4
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作者 董洪亮 韩先干 +7 位作者 白灏 何亮 刘蕾 刘瑞 柴同杰 丁铲 刘海文 于圣青 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1423-1430,共8页
菌蜕是革兰氏阴性菌在噬菌体Phix174的溶菌基因E的作用下形成的细菌空壳,通常由λpL/pR-cI857温控系统通过调控E基因的表达制备。通过重叠PCR技术,将λpL/pR-cI857温控系统中λpR启动子的第2个操纵基因(OR2)的第9位碱基由T突变为C(T→C... 菌蜕是革兰氏阴性菌在噬菌体Phix174的溶菌基因E的作用下形成的细菌空壳,通常由λpL/pR-cI857温控系统通过调控E基因的表达制备。通过重叠PCR技术,将λpL/pR-cI857温控系统中λpR启动子的第2个操纵基因(OR2)的第9位碱基由T突变为C(T→C)。溶菌试验结果表明,突变后的λpL/pR-cI857系统在37℃时仍能稳定抑制基因E的表达,对大肠杆菌的溶菌率为99.9%。通过对λpR启动子的改造,扩大了λpL/pR-cI857温控系统的温度调控范围,为菌蜕疫苗的研制提供了参考。 展开更多
关键词 大肠杆菌 菌蜕 重叠PCR 突变
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TAV-CP、CVB-CP、CChMVd基因片段的融合及其RNAi载体的构建 被引量：5
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作者 刘佳 黄丛林 +2 位作者 吴忠义 张秀海 王永勤 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2013年第1期106-111,共6页
番茄不孕病毒(TAV)、菊花B病毒(CVB)、菊花褪绿斑驳类病毒(CChMVd)是侵染菊花的3种主要病毒,严重影响菊花品质。利用Blast及分子生物学软件DNAStar对TAV、CVB、CChMVd基因序列同源性进行分析比较,选用TAV的277 bp(1 810～2 086),CVB的28... 番茄不孕病毒(TAV)、菊花B病毒(CVB)、菊花褪绿斑驳类病毒(CChMVd)是侵染菊花的3种主要病毒,严重影响菊花品质。利用Blast及分子生物学软件DNAStar对TAV、CVB、CChMVd基因序列同源性进行分析比较,选用TAV的277 bp(1 810～2 086),CVB的281 bp(496～776),CChMVd的217 bp(109～325)的部分基因片段,应用重叠延伸PCR技术将其拼接成融合基因CBT,构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有"正向CBT片段-内含子-反向CBT片段"的RNAi的植物表达载体,为培育抗3种病毒的菊花优异种质资源奠定基础。 展开更多
关键词 菊花 TAV-CP CVB-CP CChMV 重叠延伸PCR 融合基因 RNAI载体
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马铃薯gbss、ssⅡ和ssⅢ基因片段的融合及其RNAi载体的构建 被引量：8
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作者 陈国梁 张金文 王蒂 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期51-56,共6页
颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）与可溶性淀粉合成酶（SSS）是淀粉合成的关键酶，其活性大小直接影响着淀粉的直链淀粉／支链淀粉比例、淀粉链长及结构等，进而影响淀粉品质。利用blast及分子生物学软件DNAStar对gbss、ssⅡ和ssⅢ基因的cDN... 颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）与可溶性淀粉合成酶（SSS）是淀粉合成的关键酶，其活性大小直接影响着淀粉的直链淀粉／支链淀粉比例、淀粉链长及结构等，进而影响淀粉品质。利用blast及分子生物学软件DNAStar对gbss、ssⅡ和ssⅢ基因的cDNA序列同源性进行分析比较，选用加船的261bp（1～261），ssⅢ的244bp（2164～2407），ssⅡ的281bp（161～441）的cDNA片段，并应用重叠PCR法将其拼接成一融合基因gbs3s2，构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有“正向gbs3s2融合片段-pdk内含子-反向gbs3s2融合片段”ihRNAi的植物表达载体，为培育糊化温度低的马铃薯品系奠定基础。 展开更多
关键词 RNAI 马铃薯 融合基因 重叠PCR
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