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间充质干细胞端粒酶催化亚基RT-qPCR方法的建立
1
作者 陈晓菲 李慧婷 +10 位作者 董莹莹 曹译丹 付欣悦 刘明月 张瑞瑞 王艳辉 王新乐 崔梦姗 张峒 庞琳 饶春明 《药物分析杂志》 北大核心 2025年第1期20-29,共10页
目的:建立一种简便、高效的端粒酶活性检测方法,用于评价间充质干细胞产品的成瘤性风险。方法:针对端粒酶催化亚基(TERT)的保守结构域设计特异性引物和探针,并对TERT基因的引物和探针进行优化筛选,同时设置内参基因的引物和探针,在一个... 目的:建立一种简便、高效的端粒酶活性检测方法,用于评价间充质干细胞产品的成瘤性风险。方法:针对端粒酶催化亚基(TERT)的保守结构域设计特异性引物和探针,并对TERT基因的引物和探针进行优化筛选,同时设置内参基因的引物和探针,在一个反应体系内使用双色荧光探针进行多重定量PCR反应,建立RT-qPCR探针法。应用该法对人间充质干细胞中是否表达TERT基因来间接判断细胞中是否存在端粒酶活性。结果:该方法可稳定特异地检测到阳性对照细胞293T/17的TERT基因,Ct平均值为23.96,RSD为1.5%。内参基因GAPDH均可以正常检出,Ct平均值为14.13,RSD为1.3%。阴性对照细胞MRC-5内参基因GAPDH可以正常检出,Ct平均值为12.81,RSD为0.46%,TERT基因未检出,该细胞端粒酶活性为阴性。人间充质干细胞HMSC内参基因GAPDH可以正常检出,Ct平均值为13.01,RSD为3.8%,TERT基因未检出,人间充质干细胞HMSC的端粒酶活性为阴性。结论:本研究建立的RT-qPCR探针法重复性好,特异性高,能够准确检测端粒酶阳性细胞催化亚基mRNA的转录。可用于间充质干细胞的端粒酶活性分析,间接评估间充质干细胞成瘤性风险。 展开更多
关键词 荧光定量RT-pcr探针法 端粒酶催化亚基 端粒酶活性 干细胞 成瘤性
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基于逆转录与实时荧光定量PCR的基因工程原创试题命制
2
作者 廖乐祥 《生物学教学》 北大核心 2025年第10期70-72,共3页
基因工程试题的情境常围绕现实问题展开,注重核心素养的考查。从科学文献、大学教材等获取合适的素材,编制符合高考风格的基因工程试题,做到新颖、真实、科学、恰当。设问有清晰的层次和严谨的逻辑,指向核心素养的不同水平。这样典型模... 基因工程试题的情境常围绕现实问题展开,注重核心素养的考查。从科学文献、大学教材等获取合适的素材,编制符合高考风格的基因工程试题,做到新颖、真实、科学、恰当。设问有清晰的层次和严谨的逻辑,指向核心素养的不同水平。这样典型模拟题的创作,有利于生物学教学工作的检测、诊断、调控和评价。 展开更多
关键词 试题命制 基因工程 逆转录pcr 实时荧光定量pcr
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荧光定量PCR在疟疾实验室诊断中的应用 被引量：10
3
作者 李素华 李静 +7 位作者 高丽君 张雅兰 周瑞敏 钱丹 杨成运 刘颖 赵玉玲 张红卫 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期232-234,共3页
分别采用镜检、巢式PCR和荧光定量PCR等3种检测方法对收集到的79份疟疾血样进行检测,并对检测结果进行比较分析。结合患者临床症状和3种检测结果, 79份血样最终确诊74份为疟原虫阳性,阳性率为93.7%(74/79),其中镜检阳性检出率为82.3%(65... 分别采用镜检、巢式PCR和荧光定量PCR等3种检测方法对收集到的79份疟疾血样进行检测,并对检测结果进行比较分析。结合患者临床症状和3种检测结果, 79份血样最终确诊74份为疟原虫阳性,阳性率为93.7%(74/79),其中镜检阳性检出率为82.3%(65/79),巢式PCR阳性检出率为82.3%(65/79),荧光定量PCR阳性检出率为93.7%(74/79),荧光定量PCR阳性检出率高于其他两种方法(P <0.05)。镜检和巢式PCR的一致率为78.4%(58/74),镜检和荧光定量PCR的一致率为63.5%(47/74),巢式PCR和荧光定量PCR的一致率为83.8%(62/74)。相比镜检和巢式PCR,荧光定量PCR敏感性和检出率更高,且用时更短。 展开更多
关键词 疟疾 镜检 巢式pcr 荧光定量pcr
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猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测 被引量：11
4
作者 赵建军 成丹 +6 位作者 李娜 史子学 孙元 赵和平 朱庆虎 涂长春 仇华吉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期685-693,共9页
本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^... 本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 荧光定量RT-pcr TaqMan荧光探针 RT-npcr
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一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立 被引量：39
5
作者 包静月 李林 +3 位作者 王志亮 李金明 刘春菊 肖肖 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第8期21-23,共3页
建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反... 建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 一步法实时定量RT—pcr 检测
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实时荧光定量RT-PCR分析非小细胞肺癌SATB1的表达和临床病理意义 被引量：32
6
作者 周来勇 刘芳 +3 位作者 童健 陈群请 张福伟 郭琳琅 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期534-537,共4页
目的检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义。方法用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组... 目的检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义。方法用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组织及正常肺组织中SATB1 mRNA的表达,分析SATB1基因表达与临床病理参数的相关性。结果癌组织中SATB1 mRNA表达量为正常组织13倍,两者差异显著(P<0.001),其中有、无转移组分别为正常组织23.63倍和5.57倍。结论SATB1 mRNA的表达水平可能与非小细胞肺癌发生发展及淋巴转移有关,有望成为判断非小细胞肺癌预后的一个指标。 展开更多
关键词 非小细胞肺癌 SATB1 mRNA 实时荧光定量RT-pcr
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应用两种PCR法快速检测公共场所水环境中嗜肺军团菌 被引量：10
7
作者 张宝莹 刘凡 +2 位作者 陈逊 葛覃兮 刘航 《中国卫生检验杂志》 北大核心 2014年第14期1984-1986,1990,共4页
目的应用巢式PCR和荧光定量PCR法调查公共场所水环境中嗜肺军团菌的污染现状与水平。方法于2012年8月-2012年11月在我国4个地区的公共场所中采集冷却水、自来水、淋浴水和喷泉水,巢式PCR检测嗜肺军团菌的污染现况,荧光定量PCR检测其污... 目的应用巢式PCR和荧光定量PCR法调查公共场所水环境中嗜肺军团菌的污染现状与水平。方法于2012年8月-2012年11月在我国4个地区的公共场所中采集冷却水、自来水、淋浴水和喷泉水,巢式PCR检测嗜肺军团菌的污染现况,荧光定量PCR检测其污染水平。结果巢式PCR和荧光定量PCR检测公共场所水环境中嗜肺军团菌的阳性率分别为51.7%(90/174)和47.1%(82/174),两种方法的检出率差异具有统计学意义(χ2=98.083,P=0.000)。4个地区公共场所水环境嗜肺军团菌浓度均值为1.08×107copies/ml。结论巢式PCR和荧光定量PCR可作为公共场所水环境嗜肺军团菌快速检测方法之一。冷却水和淋浴水中嗜肺军团菌污染水平较自来水和景观水严重。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 巢式pcr 荧光定量pcr 水环境 公共场所
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RT-PCR检测病媒生物SARS冠状病毒结果初报 被引量：3
8
作者 段金花 吴军 +4 位作者 林立丰 裴福全 易建荣 卢文成 蔡松武 《中国媒介生物学及控制杂志》 CAS CSCD 2003年第5期332-334,共3页
目的　调查广东重点地区鼠类和蜚蠊是否携带SARS冠状病毒或者是否SARS冠状病毒的宿主 ,为寻找SARS冠状病毒的来源及控制SARS流行提供依据。方法　巢式RT -PCR技术、荧光定量RT -PCR技术。结果　利用SARS冠状病毒特异性引物对广州、中山... 目的　调查广东重点地区鼠类和蜚蠊是否携带SARS冠状病毒或者是否SARS冠状病毒的宿主 ,为寻找SARS冠状病毒的来源及控制SARS流行提供依据。方法　巢式RT -PCR技术、荧光定量RT -PCR技术。结果　利用SARS冠状病毒特异性引物对广州、中山、江门及恩平等地的 160份鼠肺样品及 15份蜚蠊的体表擦拭子检测结果表明 ,荧光定量RT -PCR未检测到阳性 ,巢式RT -PCR显示来自广州市的 1份蜚蠊体表擦拭子呈可疑阳性。结论　巢式RT -PCR、荧光定量RT -PCR都适合于病媒生物SARS冠状病毒的初步筛选 ,目前未有明显证据显示鼠类及蜚蠊携带和传播SARS冠状病毒 ,仍需作进一步研究。 展开更多
关键词 冠状病毒 巢式逆转录-聚合酶链反应 荧光定量RT-pcr 病媒生物 SARS
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‘琯溪蜜柚’荧光定量PCR内参基因的筛选 被引量：16
9
作者 王梨嬛 潘永娟 +2 位作者 杨莉 蔡盛华 黄新忠 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期48-54,共7页
【目的】为了克隆‘琯溪蜜柚’的管家基因,并筛选合适的管家基因作为内参,【方法】以‘琯溪蜜柚’盛花期后5个不同时期的果实汁胞,以及根﹑茎﹑叶为材料,采用实时荧光定量PCR技术,分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α和Ubiquitin ... 【目的】为了克隆‘琯溪蜜柚’的管家基因,并筛选合适的管家基因作为内参,【方法】以‘琯溪蜜柚’盛花期后5个不同时期的果实汁胞,以及根﹑茎﹑叶为材料,采用实时荧光定量PCR技术,分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α和Ubiquitin 5个管家基因在不同材料中的表达情况,并结合geNorm、NormFinder﹑comparative Delta-CT和BestKeeper 4种评估方法进行稳定性分析。【结果】结果表明,actin1和β-tubulin是‘琯溪蜜柚’果实发育进程中较为稳定的内参基因,而EF1-α和β-tubulin则是研究不同组织特定靶基因表达中稳定的内参基因。【结论】筛选出了‘琯溪蜜柚’最佳的内参基因β-tubulin,为今后目的基因的表达分析奠定了基础。 展开更多
关键词 '琯溪蜜柚’ 荧光定量pcr 内参基因
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实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌中外周血端粒酶逆转录酶mRNA的表达及其临床意义 被引量：4
10
作者 司君利 亓玉琴 +1 位作者 周长宏 刘吉勇 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2008年第36期4066-4070,共5页
目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21... 目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本hTERT mRNA表达情况,分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系并应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA检测对结直肠癌的诊断价值.结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组(t'=7.953,P<0.05),其表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(t'/t=2.334,2.149,2.460,均P<0.05).hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91,诊断界值为Ct≤32.结论:应用实时荧光定量RT-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点;外周血hTERT mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物. 展开更多
关键词 结直肠癌 微转移 外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应
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应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性 被引量：3
11
作者 许炎 张晨 +5 位作者 徐庆文 黄江平 刘亚楠 邹凯南 平原 周怀谷 《法医学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期259-262,共4页
目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse tr... 目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。 展开更多
关键词 法医遗传学 反转录pcr 实时荧光定量pcr 血液 唾液 精液
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荧光定量PCR技术检测疟原虫方法初探 被引量：3
12
作者 邵雷 朱姗姗 +3 位作者 胡文佳 蒋昵真 陈妍 林红 《中国输血杂志》 CAS 2020年第11期1144-1147,共4页
目的探索荧光定量PCR技术在献血者疟原虫检测中的应用。方法参照文献设计针对疟原虫18S小亚基核糖体RNA (18S rRNA)基因序列的通用引物和探针并构建标准质粒;将标准质粒和4种疟原虫阳性标本进行梯度倍比稀释后进行荧光定量PCR检测,建立... 目的探索荧光定量PCR技术在献血者疟原虫检测中的应用。方法参照文献设计针对疟原虫18S小亚基核糖体RNA (18S rRNA)基因序列的通用引物和探针并构建标准质粒;将标准质粒和4种疟原虫阳性标本进行梯度倍比稀释后进行荧光定量PCR检测,建立符合本实验室条件的实验体系,与巢式PCR方法进行灵敏度比较,并对47例献血者进行疟原虫筛查。结果应用荧光定量PCR技术检测标准质粒的检测下限是10-1copy/μL,用于恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malaria)和卵形疟原虫(P.ovale)阳性标本检测,其下限均为1 copy/μL,且整个PCR程序仅用时1 h 59 min;应用荧光定量PCR技术检测47例献血者全血标本,均为阴性;应用巢式PCR技术检测间日疟原虫和三日疟原虫的检测下限为102copy/μL,检测灵敏度明显低于荧光定量PCR检测方法。结论荧光定量PCR检测方法具有操作简单、快速、灵敏、经济等特点,通过针对本实验室的特定实验优化,更加适用于献血者疟原虫的快速大量筛查。 展开更多
关键词 疟原虫 荧光定量pcr 18S核糖体RNA 巢式pcr 献血者
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体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板 被引量：4
13
作者 孙军峰 刘华雷 +1 位作者 张维 王志亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第4期43-46,共4页
本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性... 本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,模板稀释度为2.95×104～2.95×108拷贝/L时,相关系数为0.998。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×104～2.95×108拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。 展开更多
关键词 新城疫病毒 体外转录 一步法荧光定量RT-pcr
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大鼠TGF-β1 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：12
14
作者 陈英剑 胡成进 赵苗青 《中国实验诊断学》 2005年第2期279-281,共3页
目的　建立检测大鼠TGF- β1mRNA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT- PCR方法。方法　摸索SYBRGreenⅠ工作液的配制方法,筛选PCR反应液,优化反应中引物和MgCl2 的浓度,以actin为对照,建立大鼠TGF -β1mR NA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量... 目的　建立检测大鼠TGF- β1mRNA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT- PCR方法。方法　摸索SYBRGreenⅠ工作液的配制方法,筛选PCR反应液,优化反应中引物和MgCl2 的浓度,以actin为对照,建立大鼠TGF -β1mR NA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT PCR方法并检测大鼠肾皮质TGF -β1mRNA表达水平。结果　SYBRGreenⅠ工作液,4 0倍水溶液稳定性好,最佳反应稀释度为1∶1 0 0 0 0。大鼠TGF β1表达水平的SYBRGreen荧光定量PCR方法,TGF- β1和actin的最佳MgCl2 反应浓度分别为2 5mM和3 5mM ,引物浓度分别为0 . 8μM和0. 5μM ,特异扩增产物的熔解温度分别为88 1和88 .6℃,因此选择在85℃时收集荧光信号。正常大鼠TGF- β1的Ct值在2 9 0 3,actin的Ct值在2 4 .86 ,扩增效率分别为0 . 995和1 . 0 8。结论　通过优化反应条件和特异性分析,成功地建立了特异、敏感的大鼠TGF- β1mRNASYBRGreenⅠ荧光定量RT PCR。SYBRGreenⅠ荧光定量PCR快速、敏感、特异、经济,可以满足临床和科研的需要。 展开更多
关键词 TGF-β1 mRNA SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-pcr
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纳米免疫磁珠联合巢式PCR检测胰腺癌患者外周循环微转移的意义 被引量：2
15
作者 胡亮 周家华 +3 位作者 易永祥 丁海 刘俊卯 赵亮 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期1097-1101,共5页
目的:建立一种检测胰腺癌患者外周血循环微转移的有效方法。方法:用人胰腺癌细胞株PANC-1与正常人外周血单核细胞(PBMC)以不同比例混合,用EpCAM抗体的纳米免疫磁珠对各比例组进行阳性分选,分离富集出肿瘤细胞,用巢式RT-PCR(RT-nest-PCR... 目的:建立一种检测胰腺癌患者外周血循环微转移的有效方法。方法:用人胰腺癌细胞株PANC-1与正常人外周血单核细胞(PBMC)以不同比例混合,用EpCAM抗体的纳米免疫磁珠对各比例组进行阳性分选,分离富集出肿瘤细胞,用巢式RT-PCR(RT-nest-PCR)检测细胞中端粒酶亚催化单位(h-TERT)和c-met的表达,以确定该检测方法的敏感度;用以上纳米免疫磁珠联合RT-nest-PCR方法检测25例胰腺癌患和15例良性病患者PBMC中h-TERT和c-met的表达,并分析两者与胰腺癌患者临床病理因素的关系。结果:纳米免疫磁珠联合RT-nest-PCR法检测h-TERT和c-met的敏感度分别为1个肿瘤细胞/1×107个PBMC和1个肿瘤细胞/1×106个PBMC。良性疾病组h-TERT及c-met基因表达率均为0(0/15),胰腺癌组h-TERT和c-met基因表达率分别为100%(25/25)和80%(20/25),且c-met阳性表达率与肿瘤分期有关(P<0.05)。结论:免疫磁珠联合RT-nest-PCR法检测h-TERT和c-met是发现胰腺癌外周血循环微转移的高敏感度方法。 展开更多
关键词 胰腺肿瘤 微转移 纳米免疫磁珠 巢式聚合酶链式反应 端粒酶亚催化单位 原癌基因蛋白质C-MET
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采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨 被引量：6
16
作者 汤贤英 孙永苹 +4 位作者 马锐 朱红倩 田祖国 孙万邦 姚新生 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期727-730,共4页
目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上... 目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。 展开更多
关键词 T淋巴细胞受体 互补决定区3 荧光定量pcr 溶解曲线
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人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建 被引量：2
17
作者 田梅 刘林林 李修义 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期9-12,共4页
目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为... 目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。 展开更多
关键词 PTEN/MMAC1 逆转录聚合酶链反应 巢式pcr法 表达载体 基因 抑制 肿瘤 基因表达
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多重实时定量PCR检测BCR—ABL mRNA方法的建立 被引量：3
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作者 陈建森 林寿榕 +1 位作者 陈志哲 周文娟 《国际检验医学杂志》 CAS 2007年第10期865-868,共4页
目的建立一种快速、可靠的实时定量PCR（RQ-PCR）检测BCR-ABL mRNA的方法。方法应用LightCycler技术，设计在同一PCR反应管内可扩增b3a2、b2a2、ela2几种常见的BCR-ABL转录本和b3a3、b2a3等少见转录本，并对RQ-PCR主要要素进行优化，评... 目的建立一种快速、可靠的实时定量PCR（RQ-PCR）检测BCR-ABL mRNA的方法。方法应用LightCycler技术，设计在同一PCR反应管内可扩增b3a2、b2a2、ela2几种常见的BCR-ABL转录本和b3a3、b2a3等少见转录本，并对RQ-PCR主要要素进行优化，评价优化后RQ-PCR的敏感性、特异性和可靠性。结果建立的RQ-PCR方法可检出10^3健康人单个核细胞中的1个K562细胞，最低可检出100个拷贝BCR—ABL分子。BCR—ABL和ABL的循环域值（C1）值（拷贝数）批内变异系数分别为0．68％（12．93％）和0．59％（8．60％），批间变异系数分别为1．14％（18．89％）和1．01％（12．72％）。结论RQ-PCR可作为评价慢性粒细胞白血病（CML）疾病进展、预后判断和骨髓移植后微量残留白血病监测的灵敏、可靠的方法。 展开更多
关键词 慢性粒细胞白血病 BCR—ABL 实时定量pcr
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细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及验证 被引量：1
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作者 王晨 李永红 +2 位作者 付志浩 张爱华 饶春明 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第8期1061-1065,共5页
目的 建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR Green玉实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法 以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR Green玉实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠... 目的 建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR Green玉实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法 以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR Green玉实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus,MMLV）逆转录酶活性参考品绘制标准曲线,进行逆转录酶活性的定量。对反应的引物和2×RT-PCR Mix进行优化,并对建立的方法进行线性关系、灵敏度、精密度和准确度验证。结果1组引物（上游：5忆-CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG-3忆,下游：5忆-TCCTGCTC-AACTTCCTGTCGAG-3忆）更适合本方法;Promega公司生产的2×RT-PCR Mix具有更高的反应效率。逆转录酶活性在5.40×108～5.40×104pU/μl范围内定量标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999 7;该方法判断样品阴阳性的标准cut-off值为1.31×104pU/μl;检测CHO-1细胞株样品逆转录酶活性的试验内变异系数（CV）为0.80%,试验间CV值为16.4%;检测5株细胞样品逆转录酶活性的平均加标回收率为122.8%。结论 建立了生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR Green玉实时定量PCR检测方法,该方法能够准确地定量检测细胞株的逆转录酶活性。 展开更多
关键词 细胞株 逆转录酶 活性 实时定量pcr
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空气中嗜肺军团菌的巢式PCR和荧光定量PCR测定方法比较 被引量：1
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作者 吕锡芳 葛覃兮 +1 位作者 张宝莹 刘凡 《环境与健康杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期197-199,共3页
目的评价巢式PCR和荧光定量PCR方法在嗜肺军团菌气溶胶检测中的应用。方法于2012年8—10月在北京、南京、苏州和深圳四城市选取38家公共场所,使用带有虚拟浓缩器的Bio-sampler生物冲击式采样器采集气溶胶样品,分别应用巢式PCR和荧光定量... 目的评价巢式PCR和荧光定量PCR方法在嗜肺军团菌气溶胶检测中的应用。方法于2012年8—10月在北京、南京、苏州和深圳四城市选取38家公共场所,使用带有虚拟浓缩器的Bio-sampler生物冲击式采样器采集气溶胶样品,分别应用巢式PCR和荧光定量PCR法检测样品中的嗜肺军团菌。结果共采集气溶胶样品165份。巢式PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为8.5%(14/165),荧光定量PCR法测定嗜肺军团菌的阳性率为26.1%(43/165),后者高于前者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用荧光定量PCR法测定空气中嗜肺军团菌的灵敏度优于巢式PCR法。 展开更多
关键词 嗜肺军团菌 巢式pcr 荧光定量pcr
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