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柞蚕NPV转移载体组建及外源基因在Sf9细胞、柞蚕卵巢原代细胞和蛹体中的表达 被引量：12
1
作者 张春发 刘淑珊 +3 位作者 范琦 王林美 李文利 李广泽 《蚕业科学》 CAS CSCD 1992年第3期164-172,共9页
根据对载有ApNPV核多角体蛋白基因的片段的酶谱和核苷酸序列分析结果,采用人工合成寡核苷酸引物引导的点突变方法,去掉了该基因的起始密码子(ATG突变为ATT),经系列克隆组建了pApM740转移载体,其外源基因插入位点为nt+141(BamHI)。系用... 根据对载有ApNPV核多角体蛋白基因的片段的酶谱和核苷酸序列分析结果,采用人工合成寡核苷酸引物引导的点突变方法,去掉了该基因的起始密码子(ATG突变为ATT),经系列克隆组建了pApM740转移载体,其外源基因插入位点为nt+141(BamHI)。系用多聚酶链反应(Polymerase Chain Rea-ction简称PCR)技术,分别将nt+2～+140,nt+9～+140、和nt+37～+140切掉,组建了pApM740、741、748和736转移载体,其外源基因克隆位点分别为nt+1、+8和+36(均为BamHI切点)。将IL-4、DE基因分别克隆到pApM740、741、748和736载体中,并进行了转染表达实验:(1)将载有DE基因的上述四种载体质粒DNA分别与AcNPV_(WT)DNA共转染Sf9细胞、经免疫抗体荧光检测,供试4个载体所载DE基因均得到表达;(2)将pApM741-IL_4和pApM748-IL_4重组载体质粒DNA分别与ApNPV_(WT)DNA共转染柞蚕卵巢原代细胞,待多角体出现后,用PCR法检测病毒基因,证实IL-4基因已整合到ApNPV DNA基因组中;(3)将pApM748-DE重组载体质粒DNA与ApNPV _(WT)DNA共转染柞蚕蛹获得成功。对病蛹病毒DNA进行PCR检测,证实DE基因已整合到病毒基因组中;取病蛹体液,用免疫沉淀及Western blotting方法检测DE蛋白,证实DE蛋白确已被表达。 展开更多
关键词 柞蚕 核型多角体 病毒 转移载体
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柞蚕NPV核多角体蛋白基因核苷酸序列分析及其mRNA转录起始点的确定 被引量：8
2
作者 张春发 范琦 +3 位作者 刘淑珊 李文利 王林美 李广泽 《蚕业科学》 CAS CSCD 1992年第2期77-87,共11页
采用DNA双脱氧法,对所克隆的载有ApNPV核多角体蛋白基因片段进行了核苷酸序列分析,并与AcNPV和BmNPV核多角体蛋白基因序列进行了比较。结果表明,ApNPV核多角体蛋白结构基因由735个核苷酸编码序列(编码245个氨基酸)组成,其序列与AcNPV和B... 采用DNA双脱氧法,对所克隆的载有ApNPV核多角体蛋白基因片段进行了核苷酸序列分析,并与AcNPV和BmNPV核多角体蛋白基因序列进行了比较。结果表明,ApNPV核多角体蛋白结构基因由735个核苷酸编码序列(编码245个氨基酸)组成,其序列与AcNPV和BmNPV的核多角体蛋白基因编码序列相比同源性较高,分别为79.6％和81.6％;但其5′端和3′端两侧翼序列与AcNPV和BmNPV相比差异显著,特别是控制该基因表达的5′端启动子部分调控序列(nt—2～—61):AcNPV与BmNPV完全相同,而ApNPV在此区域却有20个核苷酸序列发生变异,并且在对该基因表达起决定性作用的8个高度保守核苷酸序列(nt—44～—51),有两处发生自然突变。经核苷酸序列推测出的ApNPV核多角体蛋白氨基酸序列与AcNPV、BmNPV核多角体蛋白氨基酸序列的差异,同其三者之间的核苷酸序列的差异的比率降低10％。采用引物延伸法,对ApNPV核多角体蛋白mRNA转录起始点进行了测定,确定其位于该基因调控序列12个核苷酸高保守区的nt—50位点与AcNPV相似。 展开更多
关键词 柞蚕 核多角体病毒 蛋白基因
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樗蚕蛹精巢细胞传代培养及柞蚕NPV感染试验初步研究 被引量：5
3
作者 刘淑珊 王林美 《蚕业科学》 CAS CSCD 1997年第2期128-129,共2页
关键词 樗蚕 精巢细胞 传代培养 柞蚕 核型多角体病毒
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柞蚕蛹内过氧化物酶类对柞蚕病毒ELISA检测结果影响的研究 被引量：2
4
作者 罗怡珊 杨明辉 孙富林 《昆虫知识》 CSCD 1991年第5期292-294,共3页
从蚕蛹的生化组成分析,蚕蛹血淋巴中含有大量的氨基酸、脂类和微量元素,此外还有多酚氧化酶和其它各种酶类(Ito,Toshi等1958,1953)。本文证明了柞蚕蛹血淋巴液中含有过氧化物酶类,这类酶的存在引起了ELISA检测蚕蛹血淋巴液带毒情况的假... 从蚕蛹的生化组成分析,蚕蛹血淋巴中含有大量的氨基酸、脂类和微量元素,此外还有多酚氧化酶和其它各种酶类(Ito,Toshi等1958,1953)。本文证明了柞蚕蛹血淋巴液中含有过氧化物酶类,这类酶的存在引起了ELISA检测蚕蛹血淋巴液带毒情况的假阳性结果。用加热法和叠氮化钠法对此类酶有一定的抑制作用。 展开更多
关键词 柞蚕 蛹 过氧化物酶 病毒 检测
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柞蚕成虫卵巢细胞株的建立及其对病毒敏感性的研究 被引量：3
5
作者 梁布锋 刘明富 《微生物学杂志》 CAS CSCD 1997年第4期8-11,共4页
建立了一株连续生长的柞蚕成虫卵巢细胞株Ap－4，测定了细胞株的生长曲线，细胞株的群体倍增时间为67h，该细胞株亦可以在无血清培养基SF－900Ⅱ中生长。用同源的柞蚕核型多角体病毒感染细胞后，观察了细胞的病理变化以及病毒多角体的... 建立了一株连续生长的柞蚕成虫卵巢细胞株Ap－4，测定了细胞株的生长曲线，细胞株的群体倍增时间为67h，该细胞株亦可以在无血清培养基SF－900Ⅱ中生长。用同源的柞蚕核型多角体病毒感染细胞后，观察了细胞的病理变化以及病毒多角体的形成。检测了病毒多角体的数量以及非包埋型病毒的TCID50数值，细胞株增殖的病毒对柞蚕幼虫和Ap－4细胞株仍具有感染性。 展开更多
关键词 柞蚕 成虫卵巢细胞株 核型多角体病毒 感染
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柞蚕核多角体病毒基因工程载体的研究——Ⅱ柞蚕核多角体蛋白基因的克隆、定位及部分DNA序列分析
6
作者 庄楚雄 张秋福 +1 位作者 钟文彪 黄自然 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 1990年第4期35-39,共5页
本文报道了柞蚕核型多角体病毒(Anlherdea peruyi Nuclear polybedrosis Virus,ApNPV)DNA的分离、纯化,ApNPV DNA用限制性内切酶PstI、BamHI酶解分别出现31、6个片段。用Southern转印杂交确定了核多角蛋白基因的大部分序列存在于BamHI-E... 本文报道了柞蚕核型多角体病毒(Anlherdea peruyi Nuclear polybedrosis Virus,ApNPV)DNA的分离、纯化,ApNPV DNA用限制性内切酶PstI、BamHI酶解分别出现31、6个片段。用Southern转印杂交确定了核多角蛋白基因的大部分序列存在于BamHI-E及PstI-C片段上,其大小分别为7.8Kb和6.7Kb.PstI-C片段经BamHI酶解后出现大小为4.0Kb和2.610的两个片段,将这两个片段克隆于Bluescript质粒中,并分析了4.0Kb片段其PstI端的部分DNA序列。 展开更多
关键词 柞蚕 核型多角体 病毒 基因工程
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柞蚕核型多角体病毒转移载体的组建及外源基因在柞蚕蛹体内的表达
7
作者 范琦 《辽宁农业科学》 北大核心 1992年第5期9-14,共6页
近几年,以昆虫杆状病毒为载体,表达外源基因的研究发展较快。由于杆状病毒载体具有所用的核多角体蛋白基因启动子效率高,外源基因插入容量大;重组病毒对人、畜等安全无害,所表达的外源蛋白的抗原性、免疫源性和生物学功能等均与其天然... 近几年,以昆虫杆状病毒为载体,表达外源基因的研究发展较快。由于杆状病毒载体具有所用的核多角体蛋白基因启动子效率高,外源基因插入容量大;重组病毒对人、畜等安全无害,所表达的外源蛋白的抗原性、免疫源性和生物学功能等均与其天然蛋白质相似等特点,因此,有关这一方面的研究日益受到人们重视。一、组建柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)转移载体的重要意义1983年,美国科学家 G.E.Smith 等采用基因工程技术首先建立了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)载体表达系统,即以AcNPV 为载体,用培养的昆虫细胞(如 Sf9)为宿主进行外源基因的表达。从那以后,该载体表达系统得到了深入的研究和应用。 展开更多
关键词 柞蚕 核型多角体 病毒 外源基因
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不同地域柞蚕核型多角体病毒特性的研究 被引量：1
8
作者 周怀民 谢秉泉 +2 位作者 杨明辉 罗怡珊 孙富林 《蚕业科学》 CAS CSCD 1991年第3期155-162,共8页
探讨了我国不同地域ApNPV的特征性状。试验表明:(1)不同地域的ApNPV对河南柞蚕、蓖麻蚕的致病性有差异;(2)不同地域ApNPV-DNA经EcoRI酶解,电泳图谱相似;使用salI内切酶酶解时,在琼脂糖电泳图谱中的C、G、O、Q、U和P等片段,不同毒株之间... 探讨了我国不同地域ApNPV的特征性状。试验表明:(1)不同地域的ApNPV对河南柞蚕、蓖麻蚕的致病性有差异;(2)不同地域ApNPV-DNA经EcoRI酶解,电泳图谱相似;使用salI内切酶酶解时,在琼脂糖电泳图谱中的C、G、O、Q、U和P等片段,不同毒株之间有差异;(3)河南云阳株(HY)病毒粒子多肽由16种蛋白亚基组成;病毒DNA为线形环状结构,周长4.76×10~5,计算DNA的分子量为:91.4×10~6道尔顿。 展开更多
关键词 柞蚕 多角体病毒 病毒性状
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柞蚕蛹增殖核型多角体病毒的研究 被引量：2
9
作者 谢秉泉 周怀民 郑作运 《蚕业科学》 CAS CSCD 1994年第1期64-65,共2页
柞蚕蛹增殖核型多角体病毒的研究谢秉泉，周怀民，郑作运（河南省云阳蚕业试验场）在Ｓｍｉｔｈ（１９８３）、前田进（１９８４）取人干扰素基因分别与苜蓿尺蠖核型多角体病毒ＤＮＡ（Ａｕ－ｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮ... 柞蚕蛹增殖核型多角体病毒的研究谢秉泉，周怀民，郑作运（河南省云阳蚕业试验场）在Ｓｍｉｔｈ（１９８３）、前田进（１９８４）取人干扰素基因分别与苜蓿尺蠖核型多角体病毒ＤＮＡ（Ａｕ－ｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮＰＶ－ＤＮＡ）和家蚕核型多角体病毒... 展开更多
关键词 柞蚕 蚕蛹 核型 多角体病毒
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柞蚕核多角体病毒基因工程载体的研究 Ⅰ柞蚕核多角体病毒DNA限制性内切酶图谱 被引量：1
10
作者 张秋福 黄自然 钟文彪 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 1990年第3期1-5,共5页
本文研究了柞蚕核多角体病毒的分离、纯化、纯化后的病毒DNA经限制性内切酶Pat Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、XhoⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ及EcoRⅠ+BamHⅠ等酶解后电泳分别形成31、26、6、15、24、5及7条区带。据内切酶图谱测算柞蚕核多角体病毒的... 本文研究了柞蚕核多角体病毒的分离、纯化、纯化后的病毒DNA经限制性内切酶Pat Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、XhoⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ及EcoRⅠ+BamHⅠ等酶解后电泳分别形成31、26、6、15、24、5及7条区带。据内切酶图谱测算柞蚕核多角体病毒的分子量为75.16±2.3×10~6道尔顿。并比较了柞蚕、蓖麻蚕及家蚕等核多角体病毒的亲缘关系。 展开更多
关键词 柞蚕 核多角体 病毒 基因 DNA
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