目的目前国内尚未有针对猫主要过敏原(Fel d 1)的商品化定量检测试剂盒,为建立Fel d 1快速检测方法,本研究制备了Fel d 1蛋白的单克隆抗体。方法本研究利用大肠杆菌密码子偏好性,对Fel d 1基因进行优化与合成,构建原核表达质粒pET-28a-F...目的目前国内尚未有针对猫主要过敏原(Fel d 1)的商品化定量检测试剂盒,为建立Fel d 1快速检测方法,本研究制备了Fel d 1蛋白的单克隆抗体。方法本研究利用大肠杆菌密码子偏好性,对Fel d 1基因进行优化与合成,构建原核表达质粒pET-28a-Fel d 1,随后表达并纯化Fel d 1重组蛋白;对BALB/c小鼠进行免疫,制备单克隆抗体。以重组Fel d 1作为包被蛋白建立间接ELISA方法,筛选杂交瘤细胞株;利用Western blot法验证单克隆抗体的特异性并鉴定其抗原表位。将筛选出的杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠腹腔,大量制备单克隆抗体。结果成功构建了重组质粒pET-28a-Fel d 1,对表达条件进行优化后获得了可溶性表达的Fel d 1蛋白。Western blot法及抗体效价测定结果显示,获得了2株稳定分泌抗Fel d 1特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7D11和5H4;抗体鉴定结果显示,5H4抗体亚型为IgG2a,可识别Fel d 1第105-163位氨基酸区域;7D11抗体亚型为IgG1,可识别Fel d 1第1-59位氨基酸区域。结论本研究获得的高纯度重组Fel d 1蛋白将为临床免疫治疗猫毛过敏提供一种备选方案;此外,制备的单克隆抗体将为深入研究Fel d 1的生物学功能及ELISA检测方法的研发奠定物质基础。展开更多
文摘目的目前国内尚未有针对猫主要过敏原(Fel d 1)的商品化定量检测试剂盒,为建立Fel d 1快速检测方法,本研究制备了Fel d 1蛋白的单克隆抗体。方法本研究利用大肠杆菌密码子偏好性,对Fel d 1基因进行优化与合成,构建原核表达质粒pET-28a-Fel d 1,随后表达并纯化Fel d 1重组蛋白;对BALB/c小鼠进行免疫,制备单克隆抗体。以重组Fel d 1作为包被蛋白建立间接ELISA方法,筛选杂交瘤细胞株;利用Western blot法验证单克隆抗体的特异性并鉴定其抗原表位。将筛选出的杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠腹腔,大量制备单克隆抗体。结果成功构建了重组质粒pET-28a-Fel d 1,对表达条件进行优化后获得了可溶性表达的Fel d 1蛋白。Western blot法及抗体效价测定结果显示,获得了2株稳定分泌抗Fel d 1特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7D11和5H4;抗体鉴定结果显示,5H4抗体亚型为IgG2a,可识别Fel d 1第105-163位氨基酸区域;7D11抗体亚型为IgG1,可识别Fel d 1第1-59位氨基酸区域。结论本研究获得的高纯度重组Fel d 1蛋白将为临床免疫治疗猫毛过敏提供一种备选方案;此外,制备的单克隆抗体将为深入研究Fel d 1的生物学功能及ELISA检测方法的研发奠定物质基础。
