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超螺旋质粒pVAX1-SGS的构建及其宿主细胞的筛选
1
作者 江学文 成雪鸿 马苗鹏 《生物技术》 2025年第5期542-547,616,共7页
[目的]将Mu噬菌体强促旋酶结合位点(bacteriophage Mu strong gyrase site,Mu SGS)序列插入pVAX1质粒以稳定质粒超螺旋构型,并从中筛选质粒生产的最适大肠杆菌宿主细胞以及培养基。[方法]合成并克隆Mu SGS序列,通过无缝克隆技术将其插入... [目的]将Mu噬菌体强促旋酶结合位点(bacteriophage Mu strong gyrase site,Mu SGS)序列插入pVAX1质粒以稳定质粒超螺旋构型,并从中筛选质粒生产的最适大肠杆菌宿主细胞以及培养基。[方法]合成并克隆Mu SGS序列,通过无缝克隆技术将其插入pVAX1质粒构建超螺旋质粒pVAX1-SGS,将其转化4种大肠杆菌感受态细胞并提取质粒,测量质粒浓度和检测质粒形态结构。选取质粒产率最高的宿主细胞作为生产菌株,比较在3种培养基和3个卡那霉素浓度下的质粒产率。[结果]成功构建超螺旋质粒pVAX1-SGS,质粒pVAX1、pVAX1-SGS均在大肠杆菌MC1061中产率最高,其提取的质粒浓度近250μg/mL,远高于大肠杆菌Mach T1,且其质粒超螺旋构型稳定,LB-A培养基的质粒浓度高达80μg/mL,是LB、LB-B培养基的近2倍,在15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL卡那霉素浓度下的质粒产率基本相近。[结论]Mu SGS序列能稳定质粒构型,增加超螺旋质粒的密度,超螺旋质粒pVAX1-SGS的最佳宿主菌为大肠杆菌MC1061,确定LB-A培养基为质粒生产的最适基础培养基,为以后进一步优化打下良好基础。 展开更多
关键词 DNA疫苗 PVAX1 超螺旋质粒 强促旋酶结合位点 无缝克隆 宿主细胞 MC1061 生长培养基
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DP7-C/DOTAP脂质体增强溶瘤腺病毒抗肿瘤效用的研究
2
作者 胡蝶 苍玉德 杨莉 《中国医药生物技术》 2025年第S2期1-11,共11页
目的利用DP7-C/DOTAP脂质体作为腺病毒运载工具,一方面通过DP7-C/DOTAP脂质体增强溶瘤腺病毒转染CAR受体低表达肿瘤细胞,克服溶瘤腺病毒在转染细胞时受到的CAR限制,提高转染效率;另一方面通过用DP7-C/DOTAP脂质体包裹溶瘤腺病毒,保护溶... 目的利用DP7-C/DOTAP脂质体作为腺病毒运载工具,一方面通过DP7-C/DOTAP脂质体增强溶瘤腺病毒转染CAR受体低表达肿瘤细胞,克服溶瘤腺病毒在转染细胞时受到的CAR限制,提高转染效率;另一方面通过用DP7-C/DOTAP脂质体包裹溶瘤腺病毒,保护溶瘤腺病毒不被中和抗体清除。验证两方面增强溶瘤腺病毒的“溶瘤”作用。方法采用薄膜分散法制备DP7-C修饰的DOTAP脂质体(DP7-C/DOTAP),将腺病毒(Ad)与DP7-C/DOTAP脂质体在体外孵育形成DP7-C/DOTAP/Ad复合物。对DP7-C/DOTAP/Ad复合物的粒径、电位和形态学进行表征。然后在体外检测DP7-C/DOTAP/Ad复合物转染CAR受体低表达肿瘤细胞的效率及抵抗腺病毒中和抗体的功效。最后在小鼠中验证DP7-C/DOTAP脂质体促进溶瘤腺病毒H101的抗肿瘤效果。结果DP7-C/DOTAP脂质体其粒径分布在140~200 nm,电位为48~58 mV,透射电镜结果显示DP7-C/DOTAP/Ad复合物制备成功。与Ad相比,DP7-C/DOTAP/Ad复合物可显著提高低表达CAR受体卵巢癌细胞SKOV3的转染效率,同时DP7-C/DOTAP脂质体可以起到保护腺病毒不被中和抗体识别和清除的作用。在SKOV3卵巢癌皮下移植瘤模型中,单独H101组抑瘤率为23.90%,H101/DP7-C/DOTAP组抑瘤率为54.81%,可更好地抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论DP7-C/DOTAP脂质体包裹腺病毒可增强腺病毒的转染效率和杀伤效果。DP7-C/DOTAP脂质体可有效促进腺病毒转染CAR低表达细胞。DP7-C/DOTAP脂质体可以对腺病毒起到良好的保护效果,不被抗腺病毒中和抗体中和。在动物实验中初步证明采用DP7-C/DOTAP脂质体能够增强溶瘤病毒的抗肿瘤效用。 展开更多
关键词 溶瘤腺病毒 DP7-C/DOTAP阳离子脂质体 卵巢癌
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苏云金芽胞杆菌可视化快速表达载体的构建与特性分析
3
作者 张静安 胡孝龙 +5 位作者 曹蓓蓓 廖敏 束长龙 张杰 王奎 操海群 《生物技术通报》 北大核心 2025年第1期95-102,共8页
【目的】构建可以快速高效表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫基因的表达载体,提高Bt杀虫基因发掘及功能研究效率。【方法】以pUC18载体为基础,构建一个以cry1Ac基因启动子p1Ac指导、融合绿色荧光蛋白GFP的可视化快速... 【目的】构建可以快速高效表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫基因的表达载体,提高Bt杀虫基因发掘及功能研究效率。【方法】以pUC18载体为基础,构建一个以cry1Ac基因启动子p1Ac指导、融合绿色荧光蛋白GFP的可视化快速表达载体p1Ac-GFP,并从生物活性、碱溶性、抗胰蛋白酶稳定性、培养条件等方面对其进行分析。【结果】p1Ac-GFP在大肠杆菌中指导表达的Cry1Ac蛋白与Bt来源的蛋白在杀虫活性方面无明显差异。同时,p1Ac-GFP表达的Cry1Ac蛋白能够溶解于50 mmol/L Na_(2)CO_(3)溶液中,可溶性组分可被胰蛋白酶消化为60 kD大小的核心活性片段。此外,p1Ac-GFP大肠杆菌宿主菌株可以发出绿色荧光,培养菌液荧光强度与所表达的Bt蛋白浓度呈较好的线性关系。培养条件优化结果显示,37℃、培养液与装瓶体积比为5/5、48 h的培养时间最适合p1Ac-GFP表达Bt Cry1Ac蛋白。【结论】p1Ac-GFP表达Bt蛋白时可以直接使用菌液荧光强度作为生物活性测定的浓度指示依据,有助于Bt基因杀虫活性功能的快速批量筛选。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 杀虫基因 cry1Ac启动子 大肠杆菌 表达载体
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NLRP3、NLRP12基因突变质粒载体构建及应用
4
作者 黄毓娴 郝金奇 +6 位作者 余艳琴 贾喜梅 张宏佳 王利全 裘瑞泽 王秀春 石继海 《包头医学院学报》 2025年第1期14-19,31,共7页
目的:根据家族性寒冷性自身炎症综合征(familial cold autoinflammatory syndrome,FCAS)家族的NLRP3(p.V72M,c.214G>A)、NLRP12(p.R754H,c.2261G>A)基因突变位点,构建携带Wistar大鼠NLRP3、NLRP12突变的基因质粒载体。方法:依据... 目的:根据家族性寒冷性自身炎症综合征(familial cold autoinflammatory syndrome,FCAS)家族的NLRP3(p.V72M,c.214G>A)、NLRP12(p.R754H,c.2261G>A)基因突变位点,构建携带Wistar大鼠NLRP3、NLRP12突变的基因质粒载体。方法:依据氨基酸同源性,设计大鼠NLRP3、NLRP12基因突变质粒,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增目的基因并回收,双酶切并连接在pCMV-mCherry-MCS-Neo载体上,连接产物转化感受态细胞,菌落PCR鉴定阳性转化子,质粒小提电泳并测序鉴定。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,成功扩增出NLRP3、NLRP12突变基因,基因突变质粒经酶切电泳及DNA测序证实,基因序列完全正确,重组质粒载体构建成功。结论:成功构建NLRP3、NLRP12基因突变的质粒载体,为进一步探讨NLRP3、NLRP12基因突变导致FCAS发病的机制研究以及NLRP3、NLRP12基因的功能性研究提供生物学基础。 展开更多
关键词 NLRP3 NLRP12 基因突变 家族性寒冷性自身炎症综合征
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甜菜BvNLP2-like基因敲除载体构建与拟南芥中模拟敲除
5
作者 王希 陶艳昵 +3 位作者 张西宁 张琦 李志烨 赵春雷 《中国糖料》 2025年第2期20-26,共7页
【目的】为研究此前自甜菜中发现的BvNLP2-like基因的功能,需要观察其过表达与基因敲除对性状的影响。本研究旨在构建该基因的敲除载体,同时构建拟南芥中同源基因敲除载体并进行模拟敲除。【方法】以甜菜BvNLP2-like基因为研究对象,利用... 【目的】为研究此前自甜菜中发现的BvNLP2-like基因的功能,需要观察其过表达与基因敲除对性状的影响。本研究旨在构建该基因的敲除载体,同时构建拟南芥中同源基因敲除载体并进行模拟敲除。【方法】以甜菜BvNLP2-like基因为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑基础载体,设计构建BvNLP2-like基因的敲除载体;同时寻找拟南芥中与之同源的基因,构建该拟南芥基因的敲除载体,最后利用农杆菌介导法将拟南芥基因敲除载体转化拟南芥以验证敲除效果。【结果】设计并构建了BvNLP2-like基因的敲除载体pHK2-Cas9-U6-BV,拟南芥中同源基因的敲除载体pHK2-Cas9-U6-AT,通过模拟敲除得到了基因组中目的基因发生缺失突变的植株,表明使用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以成功实现该NLP基因的敲除。【结论】本研究得到了2种可用于NLP基因基因敲除的载体,为此基因在甜菜中的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 甜菜 NLP基因 CRISPR/Cas9 载体构建 基因敲除
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MS2噬菌体样颗粒制备及作为核酸检测质控/标准品的应用研究进展
6
作者 刘子榕 林琦 翁育伟 《海峡预防医学杂志》 2025年第3期14-17,共4页
MS2噬菌体样颗粒(MS2 phage like particles,MS2 PLP)是人工构建的一种病毒样颗粒,形态结构与天然噬菌体相似,其内含外源RNA序列。这些人工构建的MS2 PLP通常不具有感染性,生物安全性良好,可耐受RNase等核酸酶的攻击,热稳定性好。MS2 PL... MS2噬菌体样颗粒(MS2 phage like particles,MS2 PLP)是人工构建的一种病毒样颗粒,形态结构与天然噬菌体相似,其内含外源RNA序列。这些人工构建的MS2 PLP通常不具有感染性,生物安全性良好,可耐受RNase等核酸酶的攻击,热稳定性好。MS2 PLP的制备技术经历了包装位点和表达系统优化,提高了RNA包装效率、特异性和纯化效果,提供了高灵敏度、精密度和稳定性的标准品或质控品。在核酸检测应用中,MS2 PLP可用于监控从核酸提取、反转录到核酸扩增全过程,是一种理想的核酸检测质控品。本文对MS2 PLP研制及研究状况进行综述,为今后MS2 PLP的改进及RNA病毒检测应用等提供依据。 展开更多
关键词 MS2噬菌体 噬菌体样颗粒 核酸检测 质控品 RNA病毒检测
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腺相关病毒基因治疗药物研发现状及挑战
7
作者 李曼君 刘凡菲 杨阳 《中国医药生物技术》 2025年第S2期78-82,共5页
腺相关病毒(AAV)载体是目前应用最广泛的体内基因治疗递送工具,具有低免疫原性、良好的组织靶向性和长期稳定表达等优势。AAV基因治疗通过将治疗性基因递送至靶细胞,以修复、替代突变基因,为遗传性疾病的治疗带来了希望。然而,AAV基因... 腺相关病毒(AAV)载体是目前应用最广泛的体内基因治疗递送工具,具有低免疫原性、良好的组织靶向性和长期稳定表达等优势。AAV基因治疗通过将治疗性基因递送至靶细胞,以修复、替代突变基因,为遗传性疾病的治疗带来了希望。然而,AAV基因治疗在临床应用中仍面临免疫原性风险、基因装载容量有限和靶向性有待提升等挑战。近年来,基因编辑技术(如CRISPR)和载体工程的进步为AAV疗法带来了新的发展机遇,如优化衣壳蛋白结构、开发新型血清型和整合高效基因编辑工具等,有望进一步提升载体性能。本文回顾了AAV基因治疗的研发进展,分析了当前面临的主要挑战,并展望了未来的发展方向。 展开更多
关键词 腺相关病毒 基因治疗 药物研发
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鸡IL-18真核表达载体的构建及其对新城疫疫苗免疫增强作用的研究 被引量：20
8
作者 程相朝 赵德明 +2 位作者 吴庭才 李银聚 张春杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期476-481,共6页
利用首次从鸡新城疫疫苗接种的鸡胚脾细胞中扩增出的鸡IL 18 全基因,构建IL 18 真核表达载体(pcDNA3 IL18),并观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。结果表明,同时接种pcDNA3 IL18 质粒和活疫苗的免疫鸡在接种后35 d内,特别是15 d之后所... 利用首次从鸡新城疫疫苗接种的鸡胚脾细胞中扩增出的鸡IL 18 全基因,构建IL 18 真核表达载体(pcDNA3 IL18),并观察其对新城疫疫苗的免疫增强作用。结果表明,同时接种pcDNA3 IL18 质粒和活疫苗的免疫鸡在接种后35 d内,特别是15 d之后所产生的HI抗体效价和T、B淋巴细胞增殖反应均高于单纯疫苗免疫组及pcDNA3 空白质粒和疫苗联合免疫组。其中,HI抗体效价在15 d 时差异显著(P<0 05),在30 和35 d时差异极显著(P<0 01); T淋巴细胞增殖反应在15 d后均表现为差异显著(P<0 05〉或极显著(P<0 01);而单纯疫苗组与空白质粒和疫苗联合免疫组之间的各测定指标则无明显的差异(P>0 05)。在35 d时进行攻毒, pcDNA3 IL18和疫苗联合免疫组的保护率为83.3%,而单纯疫苗免疫组、空白质粒和疫苗联合免疫组鸡的保护率则分别只有61.5%和66.7%。说明该pcDNA3 IL18真核表达质粒在鸡体内得到了表达,表达产物不仅能够显著增强新城疫疫苗所诱导的细胞免疫和体液免疫反应,而且还可以明显提高疫苗的保护率。 展开更多
关键词 免疫增强作用 真核表达载体 新城疫疫苗 IL-18 构建 HI抗体效价 联合免疫 真核表达质粒 体液免疫反应 疫苗免疫 增殖反应 差异显著 B淋巴细胞 T淋巴细胞 保护率 疫苗接种 鸡新城疫 测定指标 细胞免疫 表达产物 全基因 脾细胞
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蓝藻基因表达载体系统的构建和应用 被引量：13
9
作者 楼士林 章军 +5 位作者 吴巧娟 刘仁海 周克夫 徐虹 徐惠娟 黄厚哲 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期586-591,共6页
蓝藻是一类具植物型放氧光合作用特性的原核生物 .多数蓝藻富含营养物质 ,无毒 ,是表达外源目的基因的独特受体系统 .因此 ,构建适用于蓝藻表达外源目的基因的载体系统 ,并用于表达药物活性肽基因 ,已成为当前蓝藻基因工程研究的热点之... 蓝藻是一类具植物型放氧光合作用特性的原核生物 .多数蓝藻富含营养物质 ,无毒 ,是表达外源目的基因的独特受体系统 .因此 ,构建适用于蓝藻表达外源目的基因的载体系统 ,并用于表达药物活性肽基因 ,已成为当前蓝藻基因工程研究的热点之一 .本课题组 10多年来率先在国内开展蓝藻基因工程研究 ,从蓝藻 Plectonema botyanum中分离得到了约 1.5kb的小质粒 ,以此为出发质粒 ,构建了蓝藻穿梭质粒 p PRS- 1和穿梭质粒表达载体 p PKE2 ;同时根据 DNA片段同源重组的性质 ,构建了蓝藻 Calothrix sp.PCC76 0 1、Synechococcus sp.PCC794 2的基因整合平台系统 .在国家 86 3项目经费资助下 ,利用构建的蓝藻质粒载体和基因整合平台系统 ,把人源胸腺素基因转入蓝藻 Calothrix sp.PCC76 0 1和 Synechococcus sp.PCC794 2 ,并能高效表达 ,首次获得了可直接口服的含人源胸腺素的转基因蓝藻 ,这对研究和开发基因工程口服药物具有重大的科学意义和经济。 展开更多
关键词 蓝藻 基因工程 原核生物 基因表达 载体系统 外源目的基因 构建
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含P_RP_L启动子的原核高效表达载体的组建及其应用 被引量：178
10
作者 张智清 姚立红 侯云德 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1990年第2期111-116,共6页
我们组建了一个含P_RP_L自动子的原核高效表达载体,它同时含有cI调控基因、多酶切点和两个强的转录终止序列。带起始密码子ATG的外源基因可以插入启动子下游的多酶切点,表达非融合蛋白,产品可供临床使用。我们实验室已用它成功地表达了... 我们组建了一个含P_RP_L自动子的原核高效表达载体,它同时含有cI调控基因、多酶切点和两个强的转录终止序列。带起始密码子ATG的外源基因可以插入启动子下游的多酶切点,表达非融合蛋白,产品可供临床使用。我们实验室已用它成功地表达了人γ干扰素、人白细胞介素-2和人肿瘤坏死因子等,表达量均占菌体总蛋白的20％以上。 展开更多
关键词 表达载体 PRPL启动子 非融 合蛋白
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DREB1A基因植物表达载体的构建 被引量：23
11
作者 李杰 李晶 +4 位作者 朱延明 张晶 代翠红 纪巍 才华 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 2003年第2期199-204,共6页
以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由... 以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将 展开更多
关键词 DREBlA基因 植物表达载体 基因构建 生长发育 水分胁迫 植株表现
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植物基因工程表达载体的改进和优化策略 被引量：55
12
作者 侯丙凯 夏光敏 陈正华 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期492-497,共6页
外源基因在转基因植物中表达效率低一直是令相关研究者困扰的一个问题。转基因植物的生物安全性最近在全球范围内开始引起世人的担忧。本文简要介绍了近年来在植物表达载体构建方面所采用的一些新策略 ,这些策略有助于增强外源基因的表... 外源基因在转基因植物中表达效率低一直是令相关研究者困扰的一个问题。转基因植物的生物安全性最近在全球范围内开始引起世人的担忧。本文简要介绍了近年来在植物表达载体构建方面所采用的一些新策略 ,这些策略有助于增强外源基因的表达水平、提高生物工程体的安全性。 展开更多
关键词 植物 转基因 表达载体 优化 改进
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丝状真菌表达分泌系统中受体菌的构建 被引量：12
13
作者 刘丽 刘谨 +2 位作者 仇润祥 朱兴国 唐国敏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期667-670,共4页
黑曲霉糖化酶高产菌株T2 1经紫外诱变后 ,通过酪蛋白平板和蛋白酶活性测定筛选出胞外酸性蛋白酶活力仅为原株 0 76 %的菌株A .nigerT2 1 2 0 1,其生长特性和产糖化酶活力与原株基本一致。利用原生质体 PEG法将含有报告基因vhb的表达... 黑曲霉糖化酶高产菌株T2 1经紫外诱变后 ,通过酪蛋白平板和蛋白酶活性测定筛选出胞外酸性蛋白酶活力仅为原株 0 76 %的菌株A .nigerT2 1 2 0 1,其生长特性和产糖化酶活力与原株基本一致。利用原生质体 PEG法将含有报告基因vhb的表达分泌质粒pGT10 vhb通过与选择标记质粒的共转化导入此蛋白酶部分缺陷株及其原株T2 1,检测在蛋白酶缺陷株AspergillusnigerT2 1 2 0 1和原株T2 1中VHb的分泌表达 ,结果表明在A .nigerT2 1 2 0 1中VHb表达水平显著高于原株 ,但Northernblot却显示在两菌株中vnb基因的转录水平近似 。 展开更多
关键词 丝状真菌 表达分泌系统 受体菌 构建 黑曲霉T21 蛋白酶缺陷株 VHB
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枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究 被引量：44
14
作者 李瑞芳 薛雯雯 +2 位作者 黄亮 熊前程 王彬 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期227-230,共4页
为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进。用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DB1342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5 kb质... 为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进。用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DB1342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5 kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响。结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DB1342的转化率为750 CFU/μgDNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/μg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg DNA。根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 感受态细胞 质粒转化方法
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农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究 被引量：20
15
作者 孙传波 曲文利 +7 位作者 姜志磊 韦正乙 麻鹏达 李晓辉 张举仁 刘德璞 郝东云 袁英 《玉米科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期32-34,共3页
选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行PCR检测,其中6... 选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。 展开更多
关键词 玉米 茎尖 农杆菌介导 HAL1基因
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一种PCR产物克隆的新方法——T-A克隆法 被引量：23
16
作者 李新波 赵小松 +2 位作者 田德志 朱依纯 姚泰 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1999年第2期187-189,共3页
介绍一种ＰＣＲ产物克隆的新方法———ＴＡ克隆法．用改良碱裂解法抽提ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒，用ＥｃｏＲⅤ将ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒切成平端，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶及ｄＴＴＰ制备ｐＢｌｕｅｓｃ... 介绍一种ＰＣＲ产物克隆的新方法———ＴＡ克隆法．用改良碱裂解法抽提ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒，用ＥｃｏＲⅤ将ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒切成平端，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶及ｄＴＴＰ制备ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ＴＡ载体．将βａｃｔｉｎｃＤＮＡ片段克隆入自制的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ＴＡ载体，经ＥｃｏＲⅠ及ＨｉｎｄⅢ双酶切得到与设定长度一致的βａｃｔｉｎｃＤＮＡ片段． 展开更多
关键词 T-A克隆载体 PCR产物 T-A克隆法
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噬菌体展示肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位的研究 被引量：13
17
作者 刘仁荣 余宙 +2 位作者 何庆华 王希 许杨 《卫生研究》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期448-450,共3页
目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定... 目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列。结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阻断,模拟表位的共有序列为IRPMVXX,X为任意氨基酸。以其中的P2号克隆建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200～8000pgml,检测下限为150pgml。结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法。 展开更多
关键词 噬菌体展示肽库 赭曲霉毒素A 模拟表位 单克隆抗体 免疫分析
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自身互补型腺相关病毒载体发展趋势 被引量：12
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作者 吕颖慧 王启钊 +2 位作者 肖卫东 刁勇 许瑞安 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期658-664,共7页
重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)可以作为基因运载工具将目的基因运送入靶器官并对多种疾病发挥治疗作用。以rAAV为载体进行基因治疗的关键是病毒基因组由单链变为双链,否则不能适时、有效表达目的基因。自身... 重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)可以作为基因运载工具将目的基因运送入靶器官并对多种疾病发挥治疗作用。以rAAV为载体进行基因治疗的关键是病毒基因组由单链变为双链,否则不能适时、有效表达目的基因。自身互补型rAAV(scrAAV)载体基因组本身以双链形式存在,与常规的单链rAAV(ssrAAV)载体相比,无论在表达时间还是表达强度上都有十分明显改善,可显著降低在疾病治疗过程中由于载体本身所诱发的免疫反应。目前,scrAAV已经在肝脏疾病、中枢神经系统疾病、眼部疾病、干细胞修饰以及RNA干扰、核酶技术等领域得到应用。以下在介绍scrAAV载体构建、表达、定位的基础上,以血友病B为主要对象,阐述scrAAV的应用潜力及发展趋势。 展开更多
关键词 基因治疗 自身互补 重组腺相关病毒 血友病B RNA干扰
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按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究 被引量：10
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作者 张相民 辛伟 +5 位作者 王世峰 李仁清 陆柔剑 王文玲 吕亦晨 阮力 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期210-216,共7页
为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示:①... 为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示:①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7.5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Westernblot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17%。上述结果表明:按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。 展开更多
关键词 痘苗病毒 基因表达 HIV-1 GAG基因 密码子偏向性 优势密码子 载体系统
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形成多角体的杆状病毒载体系统的建立 被引量：23
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作者 王珣章 谢伟东 +3 位作者 龙綮新 苏德明 钟江 蒲蛰龙 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1991年第3期253-261,共9页
用具有多聚A信号、不带翻译起始密码子ATG或含三种读码框ATG的寡聚核苷酸为聚合接头,构建了含多角体蛋白基因、并能利用人工合成启动序列和多角体蛋白XIV启动子表达外源基因的转移载体质粒pSXIVVI^+X_3系列。为便于重组毒株的筛选,还组... 用具有多聚A信号、不带翻译起始密码子ATG或含三种读码框ATG的寡聚核苷酸为聚合接头,构建了含多角体蛋白基因、并能利用人工合成启动序列和多角体蛋白XIV启动子表达外源基因的转移载体质粒pSXIVVI^+X_3系列。为便于重组毒株的筛选,还组建了含合成启动子和β-半乳糖苷酶基因的无包含体粉纹夜蛾核型多角体病毒株TnNPV-SVI^-G,并由此建立起以上述质粒为转移载体,形成多角体及能在X-gal半固体培养基中呈白斑,具有易于辨认遗传标志的TnNP V表达载体系统。 展开更多
关键词 杆状病毒 多角体 载体系统
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