分别提取锯缘青蟹Scylla serrata卵巢、精巢、眼柄、促雄腺的总RNA,等量混合后经oligotex试剂分离mRNA,利用SMART(Switch mechanisms at the 5′end of RNA transcript)技术及DSN(duplex-specific nuclease)的特性构建线性化cDNA质粒文...分别提取锯缘青蟹Scylla serrata卵巢、精巢、眼柄、促雄腺的总RNA,等量混合后经oligotex试剂分离mRNA,利用SMART(Switch mechanisms at the 5′end of RNA transcript)技术及DSN(duplex-specific nuclease)的特性构建线性化cDNA质粒文库。经检测文库约含有5.3×107重组子,扩增后的文库含有1011以上重组子。文库的插入cDNA长度为0.5—2.5kb,重组率大于98%。从构建的文库中随机挑取5 202个克隆进行大规模EST测序,获得3 346条ESTs,其中长度大于100bp的高质量ESTs 2 697条。经拼接与软件分析,2 697 ESTs代表了2 522个Unigenes,包括2 355个Singlets和167个Contigs,冗余率6.49%。EST序列经生物信息学分析(BLASTX,e<10-6),发现了Sry-like protein C、Sox14 protein、Sox4b、sex-determining protein fem-1、vitellogenin、vitellogenin receptor、cyclin A、cathepsin C和cyclin-dependent kinase 2等与性别分化和性腺发育相关的基因,以及热休克蛋白家族、泛素系统、抗氧化防御体系和抗病相关的功能基因。该文库具有较高的质量和利用价值,可为更大规模EST分析及采用基因芯片技术开展锯缘青蟹性腺发育及性别分化相关功能基因的研究奠定基础。展开更多
目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探...目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用机制提供一定实验依据。方法依据miRNA设计原则,针对人Id3基因的mRNA序列,设计并合成编码miRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建含靶向人Id3基因的miRNA表达质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3),DNA测序验证后,采用Lipofectamine2000TM脂质体转染技术将该质粒导入A549细胞。荧光倒置显微镜下观察miRNA干扰质粒转染A549细胞后EGFP的表达情况,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测miRNA干扰后Id3mRNA及蛋白水平的表达。结果DNA测序表明重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3构建正确,将其成功导入A549细胞后,在Id3mRNA水平和蛋白表达水平均有不同程度的抑制作用。结论成功构建了针对人Id3基因的4组pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3miRNA表达载体,其中,SRId3-1干扰组在mRNA水平和蛋白表达水平均能有效抑制A549细胞Id3的表达。展开更多
文摘目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用机制提供一定实验依据。方法依据miRNA设计原则,针对人Id3基因的mRNA序列,设计并合成编码miRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建含靶向人Id3基因的miRNA表达质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3),DNA测序验证后,采用Lipofectamine2000TM脂质体转染技术将该质粒导入A549细胞。荧光倒置显微镜下观察miRNA干扰质粒转染A549细胞后EGFP的表达情况,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测miRNA干扰后Id3mRNA及蛋白水平的表达。结果DNA测序表明重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3构建正确,将其成功导入A549细胞后,在Id3mRNA水平和蛋白表达水平均有不同程度的抑制作用。结论成功构建了针对人Id3基因的4组pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3miRNA表达载体,其中,SRId3-1干扰组在mRNA水平和蛋白表达水平均能有效抑制A549细胞Id3的表达。
