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家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3的鉴定及亚细胞定位 被引量：7
1
作者 谈娟 张奎 +2 位作者 徐曼 陈思源 崔红娟 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第22期4808-4815,共8页
【目的】克隆家蚕整合素基因BmintegrinαPS3,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征,并进行原核表达及蛋白纯化,为进一步探究BmintegrinαPS3在家蚕中的功能奠定基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmintegrinαPS3的cDNA全长序列;采用RT-PC... 【目的】克隆家蚕整合素基因BmintegrinαPS3,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征,并进行原核表达及蛋白纯化,为进一步探究BmintegrinαPS3在家蚕中的功能奠定基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmintegrinαPS3的cDNA全长序列;采用RT-PCR方法检测BmintegrinαPS3的时空表达;在原核表达系统中表达获得BmintegrinαPS3重组蛋白;并构建BmintegrinαPS3真核表达载体,转染家蚕胚胎细胞系分析其蛋白亚细胞定位。【结果】家蚕整合素基因BmintegrinαPS3编码框全长为2 895 bp,编码965个氨基酸,含有整合素家族蛋白典型的integrin alpha结构域,预测其为跨膜蛋白。构建了BmintegrinαPS3的原核表达系统,并利用亲和层析纯化获得高纯度的BmintegrinαPS3原核表达蛋白,为进一步制备抗体获得足够的抗原。在家蚕细胞系中外源表达BmintegrinαPS3蛋白,显示其主要定位于细胞质和细胞膜中。另外,RT-PCR结果显示BmintegrinαPS3 mRNA在血细胞中为特异持续表达。【结论】获得了BmintegrinαPS3的完整cDNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得其融合蛋白,在细胞水平上初步分析了其亚细胞定位情况。 展开更多
关键词 家蚕整合素基因 克隆 时空表达 原核表达 亚细胞定位
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昆虫造血作用和造血干细胞研究进展 被引量：6
2
作者 谈娟 周其明 崔红娟 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1165-1171,共7页
昆虫血细胞(insect hemocyte)在昆虫代谢、发育变态以及先天免疫等方面承担着重要的作用。昆虫只有先天免疫系统,血细胞所行使的免疫功能对于昆虫对抗外源病菌尤为重要。本文主要介绍了昆虫血细胞类型、造血作用、造血干细胞及造血相关... 昆虫血细胞(insect hemocyte)在昆虫代谢、发育变态以及先天免疫等方面承担着重要的作用。昆虫只有先天免疫系统,血细胞所行使的免疫功能对于昆虫对抗外源病菌尤为重要。本文主要介绍了昆虫血细胞类型、造血作用、造血干细胞及造血相关因子的相关研究。通过特殊染色和形态学观察,果蝇Drosophila血细胞主要由3类细胞组成,而鳞翅目等大部分昆虫血细胞由5类细胞组成。昆虫血细胞主要存在于循环血液环境及造血器官内,而在这两个系统中都存在有进行复制的血细胞,这为研究昆虫造血干细胞特性和其定位提供了一个很好的系统。果蝇血细胞祖细胞来自于胚胎中胚层细胞,然后再分化为各种血细胞,这一系列分化过程由造血因子所调控。 展开更多
关键词 昆虫 血细胞 造血作用 造血干细胞 调控因子
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运用概念图培育历史思维能力的价值、问题与优化路径 被引量：3
3
作者 谈娟 《教学月刊（中学版）（教学参考）》 2024年第1期62-67,共6页
概念图被用于表征某一主题下多个历史概念之间的意义关系,是一种常用的思维可视化工具,具有利于把握历史概念、激活学习思维、构建历史大概念等重要价值。从实践来看,学生在绘制概念图方面存在知识储备不足、历史理解浅显,图示信息烦琐... 概念图被用于表征某一主题下多个历史概念之间的意义关系,是一种常用的思维可视化工具,具有利于把握历史概念、激活学习思维、构建历史大概念等重要价值。从实践来看,学生在绘制概念图方面存在知识储备不足、历史理解浅显,图示信息烦琐、线索提炼不精,辩证思维薄弱、逻辑生搬硬套等典型问题。基于这些问题,教师可科学构建概念图,引导学生深度理解、精准把握相关的历史概念,通过问题引领学生挖掘历史概念间的内在联系,将其分类整合,并打破不同领域之间的界限,引导学生突破思维局限,达成融会贯通。 展开更多
关键词 概念图 思维可视化 历史思维能力培养
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历史于细节处见精神——略论历史细节在课堂教学中的运用
4
作者 谈娟 《中学教学参考》 2019年第6期25-26,共2页
历史于细节处见精神,教师在课堂教学中善用历史细节,可以还原历史具象,使逝去的历史变得有血有肉;可以使学生感受历史人物伟大的人格,感受人性的力量;可以激发学生对历史的理性思考,使学生在历史中钩沉思想。
关键词 历史细节 历史具象 人文情怀 历史思想
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历史课堂教学的问题探源
5
作者 谈娟 《文教资料》 2014年第3期166-167,共2页
在中学历史课堂教学中，提问是教学知识点得以深入的阶梯，善教者，必善问。精心设计课堂提问。可以启迪思维、触发灵感，但是乏味无效的提问影响课堂教学效果，继而挫伤学生学习历史的积极性。在教学过程中，教师要依据教材和学生实际... 在中学历史课堂教学中，提问是教学知识点得以深入的阶梯，善教者，必善问。精心设计课堂提问。可以启迪思维、触发灵感，但是乏味无效的提问影响课堂教学效果，继而挫伤学生学习历史的积极性。在教学过程中，教师要依据教材和学生实际，不时提出切实有效而发人深省的问题，使师生之间的双边活动处于和谐的信息交流中。 展开更多
关键词 历史教学 课堂教学 问题探源 课堂提问
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思维导图:基于思维可视化的历史思维能力提升路径
6
作者 谈娟 《中学教学参考》 2023年第1期71-74,78,共5页
培养学生的历史思维能力是中学历史教师的重要职责,也是落实历史学科核心素养的关键。要培养学生历史思维能力,有必要教会学生使用思维导图开展学习。教会学生绘制和使用思维导图,可以把零散的知识结构化、复杂的知识概要化、抽象的知... 培养学生的历史思维能力是中学历史教师的重要职责,也是落实历史学科核心素养的关键。要培养学生历史思维能力,有必要教会学生使用思维导图开展学习。教会学生绘制和使用思维导图,可以把零散的知识结构化、复杂的知识概要化、抽象的知识具象化,从而帮助学生提高记忆效率,促进深度学习,提高思维能力。 展开更多
关键词 历史思维能力 思维可视化 思维导图
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应用PCR快速检测单核细胞增生症李斯特菌的研究 被引量：9
7
作者 周晓辉 焦新安 +4 位作者 邓云飞 巢国祥 殷月兰 唐丽华 谈娟 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 2003年第3期1-4,共4页
用聚合酶链式反应(PCR)扩增hly基因,检测单核细胞增生症李斯特菌的纯培养物及其模拟污染的生猪肉、水和牛奶。41株单核细胞增生症李斯特菌的PCR结果呈阳性,而其他李斯特菌,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特... 用聚合酶链式反应(PCR)扩增hly基因,检测单核细胞增生症李斯特菌的纯培养物及其模拟污染的生猪肉、水和牛奶。41株单核细胞增生症李斯特菌的PCR结果呈阳性,而其他李斯特菌,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性片段。这表明所扩增的hly基因3′末段850bp的DNA片段对单核细胞增生症李斯特菌具有较高的特异性。PCR对单核细胞增生症李斯特菌纯培养物的检测低限达10~5cfu·mL^(-1),对16hLEB增菌培养的模拟污染生猪肉、水和牛奶的增菌培养液用PCR捡测,结果检测生猪肉低限达400cfu·kg^(-1)、水和牛奶为400cfu·L^(-1)。整个检测过程只需24h。这表明PCR法对单核细胞增生症李斯特菌的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点。 展开更多
关键词 单核细胞增生症李斯特菌 快速检测 聚合酶链式反应 PCR引物 扩增条件 灵敏度试验
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家蚕周期蛋白A基因(BmcyclinA)的克隆和表达谱分析 被引量：6
8
作者 张春冬 谈娟 +4 位作者 赵丹红 刘迪 冯业勋 潘敏慧 鲁成 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期761-767,共7页
周期蛋白A(cyclinA)能分别与2种重要的周期蛋白依赖性激酶cdk1和cdk2作用,推动细胞周期的正常进行。利用家蚕基因组数据和分子生物学方法克隆了cyclinA基因在家蚕中的同源物BmcyclinA(GenBank登录号:FJ619105),发现了BmcyclinA基因的另... 周期蛋白A(cyclinA)能分别与2种重要的周期蛋白依赖性激酶cdk1和cdk2作用,推动细胞周期的正常进行。利用家蚕基因组数据和分子生物学方法克隆了cyclinA基因在家蚕中的同源物BmcyclinA(GenBank登录号:FJ619105),发现了BmcyclinA基因的另一种错误剪接形式BmcyclinA-1。BmcyclinA基因位于家蚕第13号染色体,由7个外显子和6个内含子组成,其完整开放阅读框为1 533 bp,编码511个氨基酸,在248th-450th氨基酸区域存在2个保守的周期蛋白框。BmcyclinA-1仅能编码正常cyclinA蛋白N端的153个氨基酸残基。RT-PCR分析显示BmcyclinA基因在家蚕整个胚胎发育时期及5龄第3天各组织中均有表达,并且在幼虫精巢中的表达相对较高。 展开更多
关键词 家蚕 周期蛋白A 基因克隆 染色体定位 表达分析
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昆虫干细胞研究进展 被引量：4
9
作者 崔红娟 李泰 +3 位作者 谈娟 潘敏慧 秦俭 向仲怀 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期990-997,共8页
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,按照其来源可分为胚胎干细胞和成年干细胞。昆虫中也同样存在多种干细胞。开展昆虫干细胞自我更新、发育命运决定、分化潜能等特性以及其与周围微环境相互关系的研究,对农林害虫的生物防治、... 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,按照其来源可分为胚胎干细胞和成年干细胞。昆虫中也同样存在多种干细胞。开展昆虫干细胞自我更新、发育命运决定、分化潜能等特性以及其与周围微环境相互关系的研究,对农林害虫的生物防治、经济昆虫的遗传育种以及一些生物反应器材料的利用,甚至对于人类疾病的治疗等都具有重要意义。以模式生物果蝇为主,介绍了昆虫干细胞的相关研究进展,重点集中在果蝇各种组织干细胞的鉴定与识别方面,包括研究较成熟的生殖腺内干细胞、中肠干细胞、马氏管干细胞、神经母细胞和造血干细胞。同时介绍了对干细胞维持起重要调控作用的各种信号途径的研究进展。这些昆虫干细胞的研究成果将为开展家蚕等鳞翅目昆虫的干细胞研究提供启示。 展开更多
关键词 昆虫 果蝇 干细胞
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从集体规约到个性化建构——教师专业道德生成的逻辑研究 被引量：13
10
作者 陆道坤 谈娟 《教师教育研究》 CSSCI 北大核心 2017年第4期7-12,共6页
教师专业道德发展遵循了从集体规约到个性化建构的基本逻辑:专业道德知识上,由道德对象的审视走向道德自我的建构;专业道德实践范式上,由他律压力的道德实践走向自律自由的道德实践;专业道德行为模式上,由道德直觉模式走向道德自主模式... 教师专业道德发展遵循了从集体规约到个性化建构的基本逻辑:专业道德知识上,由道德对象的审视走向道德自我的建构;专业道德实践范式上,由他律压力的道德实践走向自律自由的道德实践;专业道德行为模式上,由道德直觉模式走向道德自主模式;专业道德智慧上,由自在自为走向惠及他人。 展开更多
关键词 集体规约 个性化建构 教师专业道德 逻辑
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提高学生历史素养，培养有“能力”的人
11
作者 谈娟 《试题与研究（教学论坛）》 2014年第4期90-90,共1页
进入21世纪，随着素质教育的开展和新课改的深入，对高中历史学科学生历史学习能力的要求越来越高。高考也H益注重于能力考核而淡化于知识考核，那么作为历史教师。怎么样才能贯彻新课改的要求，提高学生的历史学习素养，并在历史教学... 进入21世纪，随着素质教育的开展和新课改的深入，对高中历史学科学生历史学习能力的要求越来越高。高考也H益注重于能力考核而淡化于知识考核，那么作为历史教师。怎么样才能贯彻新课改的要求，提高学生的历史学习素养，并在历史教学中渗透“以学生发展为本”和“以培养学生的创新精神和实践能力为重点”的新教育理念呢。我想就这个问题作一点初步的探讨，供同行参考。 展开更多
关键词 历史素养 创造性思维 历史学科
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SARS-CoV棘突蛋白片段在E.coli中的表达及免疫活性分析 被引量：2
12
作者 莎日娜 谈娟 +5 位作者 邓刚 胡文治 赵季红 岳继华 乔文涛 陈启民 《南开大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期73-77,共5页
SARS-冠状病毒(SARS-CoV)棘突蛋白(Spike,S)是构成病毒包膜突起的主要成分,属于I型膜糖蛋白,全长1255 aa,在病毒入侵宿主细胞中起重要作用.本文利用生物信息学技术,界定冠状病毒SARS-CoV S蛋白的抗原决定区域,通过PCR扩增相应片段,克隆... SARS-冠状病毒(SARS-CoV)棘突蛋白(Spike,S)是构成病毒包膜突起的主要成分,属于I型膜糖蛋白,全长1255 aa,在病毒入侵宿主细胞中起重要作用.本文利用生物信息学技术,界定冠状病毒SARS-CoV S蛋白的抗原决定区域,通过PCR扩增相应片段,克隆至原核表达载体pET-H,得到四个重组质粒pET-H S1、pET-H S3、pET-H S4、pET-H S5.经序列测定证实后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导获得表达,产物经紫外薄层扫描显示目的蛋白占菌体细胞总蛋白量的20%～30%.经Western blot检测,表达蛋白与恢复期SARS病人血清呈高反应原性.纯化相应蛋白免疫小鼠,所获抗血清效价达1:3×103.与SARS诊断试剂反应呈阳性,这一工作将为进一步研究S蛋白的定位、功能及SARS诊断提供帮助. 展开更多
关键词 SARS-冠状病毒 重组S蛋白 多克隆抗体
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家蚕整合素β2的表达、纯化及其免疫功能 被引量：1
13
作者 张奎 李重阳 +3 位作者 苏晶晶 谈娟 徐曼 崔红娟 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期181-190,共10页
【目的】分析家蚕(Bombyx mori)整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】利用生物... 【目的】分析家蚕(Bombyx mori)整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验结果显示重组蛋白在Ca^(2+)的存在下对金黄色葡萄球菌具有较强的凝聚作用。细菌清除试验证实重组蛋白可以有效促进机体对外源入侵细菌的清理作用。【结论】整合素β2具有典型的整合素β亚基的结构特征,可能具有识别病原相关分子模式,如LPS和PGN等的能力,通过与细菌的直接结合而实现对入侵病原微生物的凝聚作用,从而增强有机体的免疫能力,推测在家蚕免疫反应中发挥重要作用。 展开更多
关键词 家蚕 整合素β2 细菌感染 原核表达 细菌凝聚
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家蚕多梳蛋白家族基因BmPsc的全长序列克隆及表达分析 被引量：1
14
作者 徐曼 谈娟 +2 位作者 张奎 王雪 崔红娟 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期14-20,共7页
多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基... 多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基因的功能。Bmi-1在昆虫中的同源基因为Psc(posterior sex combs)。采用RACE技术获得家蚕Psc基因(BmPsc)全长4 084 bp的序列。该基因位于家蚕第4号染色体上,是一个单外显子基因,ORF为3 291 bp,编码1 096个氨基酸,蛋白质分子质量121 kD,等电点(pI)为9.83;同源序列比对发现BmPsc与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的Psc基因序列有58%的相似度,与果蝇(Drosophila melanogaster)的Psc基因序列仅有34%的相似度;氨基酸序列分析显示BmPsc具有保守的N端Ring结构。利用qRT-PCR检测家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄各时期幼虫血液中BmPsc基因的表达水平,发现BmPsc在各组织均有表达,在精巢以及卵巢中的表达明显较高,其次是翅原基(含造血器官),在循环血液中也有较高表达;在5龄各时期幼虫血液中的表达呈一定规律性,于蜕皮后的5龄第2天以及进入变态前的5龄第6天出现表达峰值,而在5龄中期(第4～5天)为表达低谷。研究结果为进一步阐释该基因在细胞水平以及个体水平对干细胞分化的抑制作用奠定了基础。 展开更多
关键词 家蚕 多梳蛋白 BmPsc基因 序列特征 QRT-PCR 时空表达
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nanos基因的研究进展 被引量：1
15
作者 张春冬 潘敏慧 +3 位作者 李娜 孙志亚 谈娟 鲁成 《细胞生物学杂志》 CSCD 2009年第1期58-62,共5页
nanos基因在时空上的表达调控对于个体发育起着重要作用。母源nanos mRNA在卵子中的定位及翻译调控受到严格的控制。果蝇Nanos通过抑制后极hunchback mRNA的翻译建立胚胎后极信号中心,从而建立前后体轴;同时它对果蝇原始生殖细胞的决定... nanos基因在时空上的表达调控对于个体发育起着重要作用。母源nanos mRNA在卵子中的定位及翻译调控受到严格的控制。果蝇Nanos通过抑制后极hunchback mRNA的翻译建立胚胎后极信号中心,从而建立前后体轴;同时它对果蝇原始生殖细胞的决定及迁移有重要作用;Nanos对于胚后发育中生殖细胞的维持也是必须的。现对nanos基因的mRNA的定位、翻译调控及Nanos结构和功能的研究进展进行了综述。 展开更多
关键词 NANOS 原始生殖细胞 早期胚胎发育
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纳米防紫外与防老化抗色变功能性纺织品 被引量：1
16
作者 谈娟 王进美 《现代纺织技术》 2007年第5期54-55,58,共3页
介绍纳米材料的基本性能以及抗紫外纳米材料的特性,以及纺织品老化与色变的现象和机理。通过对防老化、抗色变的传统工艺的分析,阐述使用纳米防紫外材料进行防老化、抗色变整理的优越性以及发展前景。
关键词 纳米材料 防紫外辐射 防老化 抗色变织物
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企业在职培训投资收益率计算模型探析 被引量：1
17
作者 刘建英 谈娟 《财会通讯（中）》 2009年第2期46-46,共1页
一、在职培训投资收益计算 假设：企业的人力资本存量决定企业的收益水平。借鉴柯布·道格拉斯生产函数，建立企业在职培训投资收益的函数为：
关键词 在职培训投资 投资收益率 企业 计算模型 道格拉斯生产函数 人力资本存量 收益计算 收益水平
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企业人力资本投资风险防范体系研究 被引量：1
18
作者 刘建英 谈娟 《财会通讯（中）》 2009年第3期136-137,共2页
知识经济时代的到来使得越来越多的企业意识到，企业竞争的关键是人才的竞争。树立人力资本投资观念，不断强化企业的人力资本投资是企业持续发展的源泉。与其他投资相同，人力资本投资也具有风险胜，所以如何完善企业人力资本投资风险... 知识经济时代的到来使得越来越多的企业意识到，企业竞争的关键是人才的竞争。树立人力资本投资观念，不断强化企业的人力资本投资是企业持续发展的源泉。与其他投资相同，人力资本投资也具有风险胜，所以如何完善企业人力资本投资风险防范体系，以避免或降低人力资本投资风险，是企业目前亟需解决的重要问题之一。 展开更多
关键词 企业人力资本投资 风险防范体系 企业持续发展 企业竞争 企业意识 经济时代 投资观念 投资风险
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激光量子血疗仪治疗慢性肝病的护理体会
19
作者 谈娟 袁伟 郭顺明 《实用肝脏病杂志》 CAS 1997年第2期47-48,共2页
激光量子血疗仪虽已用于各种缺血、缺氧性心脑血管系疾病的治疗,但用于治疗慢性肝病的报告却甚少。我科自1995年8月～1997年1月用此疗法治疗慢性肝病患者45例,未发生任何不良反应。现将操作方法及护理体会报告如下。
关键词 慢性肝病患者 激光量子 血疗仪 护理体会 不良反应 操作方法 普鲁卡因 慢性重型肝炎 传染病科 心理护理
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家蚕glial cell missing(BmGcm)基因鉴定、表达、亚细胞定位和功能
20
作者 张奎 潘光照 +4 位作者 苏晶晶 谈娟 徐曼 李钰添 崔红娟 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1401-1411,共11页
【目的】鉴定、克隆家蚕(Bombyx mori)glial cell missing(Bm Gcm)基因,分析其m RNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究Bm Gcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法... 【目的】鉴定、克隆家蚕(Bombyx mori)glial cell missing(Bm Gcm)基因,分析其m RNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究Bm Gcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得Bm Gcm全长c DNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对Bm Gcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和q RT-PCR方法检测Bm Gcm的表达情况。利用原核表达系统获得重组蛋白,通过蛋白纯化和免疫小鼠制备多克隆抗体,运用Western blot对抗体进行检测。构建Bm Gcm表达载体,转染家蚕胚胎细胞系,分析其亚细胞定位情况,同时利用EDU细胞增殖标记和流式细胞仪对其功能进行探索。【结果】Bm Gcm(BGIBMGA006182)定位于4号染色体的nscaf2847上,其基因全长4046 bp,包含4个外显子和3个内含子。其c DNA全长1734 bp,包含166 bp的5′UTR、227 bp的3′UTR和1341 bp的完整开放阅读框(ORF)。该基因编码446个氨基酸残基,预测蛋白分子量为50.61 k D,等电点5.557,含有典型的GCM结构域。多重比对结果显示GCM结构域在不同物种间具有高度的保守性,进化分析显示昆虫Gcm蛋白单独聚为一支,其中Bm Gcm蛋白与帝王蝶同源蛋白亲缘关系最为接近。表达分析结果显示Bm Gcm在胚胎发育第4天表达达到峰值,随后表达水平逐渐下调,而在幼虫阶段,Bm Gcm主要表达于中肠、精巢和卵巢。将Bm Gcm完整的开放阅读框序列构建至原核表达系统,经IPTG诱导和亲和层析纯化获得高纯度重组蛋白,通过免疫小鼠获得了多克隆抗体,Western blot检测该抗体可以特异性识别重组蛋白。在家蚕细胞系中过表达Bm Gcm蛋白,结果显示其定位于细胞核。在细胞水平,过表达Bm Gcm会明显抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G1/S期。【结论】克隆鉴定得到Bmgcm全长序列,获得其表达和亚细胞定位信息。通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠制备了可用的多克隆抗体。细胞实验发现Bm Gcm可以显著抑制增殖和影响正常的细胞周期进程。 展开更多
关键词 家蚕glial cell missing基因(BmGcm) 克隆 表达分析 抗体制备 过表达
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