摘要
目的:从人淋巴细胞中克隆人肿瘤坏死因子-α(hT-NF-α)基因,构建原核表达载体,通过表达、纯化,获得具有生物学活性的hTNF-α,为深入研究和利用hTNF-α奠定基础。方法:利用RT-PCR方法从人淋巴细胞中克隆hTNF-α基因,并分别插入到pGEX-6P-1的GST标签和pHisSUMOexpression的SUMO(small ubiquitin-like modifier)标签下游构建成重组表达载体pGEX-6P-1-hTNF-α和pHisSUMO-hTNF-α。将两种载体分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),比较两种载体hTNF-α表达量及可溶性的差异。选择表达效果较好的重组载体对hTNF-α进行诱导表达,经纯化并切去融合标签后获得成熟hTNF-α蛋白。以L929细胞为靶细胞,利用MTT比色法检测其细胞毒活性。结果:克隆得到hTNF-α编码基因,利用pGEX-6P-1载体表达的GST-hTNF-α融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的27%,主要以包涵体形式表达,经低温诱导后可溶性提高了约50%,但表达量有所降低。而利用pHisSUMO-expression表达的SUMO-hTNF-α融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的30%以上,且主要以可溶形式存在。本实验中选择SUMO系统表达hTNF-α,纯化后成熟蛋白纯化产物纯度达98%以上。活性测定结果表明,获得的成熟hTNF-α对L929的细胞毒活性为5.01×108U/mg。结论:与GST标签相比,SUMO利于hTNF-α的可溶性表达。经过纯化并切去融合标签后获得了纯度较高的具有生物学活性的hTNF-α蛋白。
出处
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第5期497-499,501,共4页
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology
基金
哈尔滨市科技创新人才发展计划资助(2006RFXXS002)
东北农业大学创新团队发展计划资助(2007年)
