目的构建高尔基蛋白73(GP73)的重组真核表达载体,获得高纯度的GP73重组蛋白并进行功能分析。方法根据GP73基因序列,利用Primer Premier 6.0设计引物,扩增获得GP73基因;构建GP73-pCMV02重组真核表达载体,将其转染至HEK293细胞,提取GP73...目的构建高尔基蛋白73(GP73)的重组真核表达载体,获得高纯度的GP73重组蛋白并进行功能分析。方法根据GP73基因序列,利用Primer Premier 6.0设计引物,扩增获得GP73基因;构建GP73-pCMV02重组真核表达载体,将其转染至HEK293细胞,提取GP73重组蛋白,并用Ni excel亲和层析柱纯化;采用G-250法对其蛋白浓度进行鉴定。结果GP73重组蛋白长度与预期一致,约为1100 bp;测序比对分析结果显示GP73基因成功插入pCMV02载体;SDS-PAGE结果显示在66 kD处有一明显条带,与预期蛋白质位置一致。ELISA检测与抗体有较好反应性,抗原效价1/500;4℃保存10 d活性变幅小于10%,热加速10 d与4℃试剂对肝癌血清检测变幅小于10%。结论成功利用真核系统表达GP73重组蛋白,效价为1/500,稳定性良好。展开更多