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HCV干扰素敏感决定区“基因盒”的构建,体外表达及功能探讨
1
作者 李刚 江元森 +5 位作者 Jenny L Craigen Lynda Tussey Eric DA D'Souza Tony R Carroll 姚集鲁 Berwyn E Clarke 《世界华人消化杂志》 CAS 2002年第8期892-896,共5页
目的:构建对干扰素敏感和不敏感的丙型肝炎患者的干扰素敏感决定区(ISDR)基因;在体外表达含ISDR的丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白,探讨表达的NS5A蛋白是否通过ISDR与干扰素诱导的RNA蛋白激酶(PKR)结合来影响干扰素的抗HCV作用.方法:采用合... 目的:构建对干扰素敏感和不敏感的丙型肝炎患者的干扰素敏感决定区(ISDR)基因;在体外表达含ISDR的丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白,探讨表达的NS5A蛋白是否通过ISDR与干扰素诱导的RNA蛋白激酶(PKR)结合来影响干扰素的抗HCV作用.方法:采用合成寡核苷酸,PCR,分子克隆等方法构建ISDR基因“盒”,包括3个对干扰素敏感的丙肝患者ISDR及1个对干扰素耐受的丙肝患者ISDR,将含不同ISDR的NS5A基因克隆进原核表达载体PRSET,转染BL21(DE3)细胞后由IPTG诱导表达,获得蛋白过柱纯化及透析去掉高盐后,与经体外转录和翻译系统获得的PKR进行蛋白结合试验.结果:经测序证实获得4个不同ISDR基因,包括1个对干扰素不敏感基因和3个对干扰素敏感基因;体外表达的含ISDR的NS5A蛋白约58000,体外试验初步证实,无论对干扰素敏感或不敏感的ISDR均可与PKR结合.结论:体外构建的含不同ISDR的NS5A蛋白能在原核细胞系统中获得较好表达;研究显示,ISDR影响干扰素抗病毒作用可能不是由ISDR与PKR直接结合导致的. 展开更多
关键词 HCV 干扰素敏感决定区 丙型肝炎病毒 基因构建 体外表达 ISDR RNA蛋白激酶 PKR
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HGV NS5A区部分基因的克隆及表达
2
作者 马会慧 李刚 +4 位作者 廖家杰 梁英杰 杨绍基 Berwyn Clarke 姚集鲁 《热带医学杂志》 CAS 2001年第2期123-125,共3页
目的　构建含HGVNS5A区基因的原核表达载体。方法　采用PCR方法从重组了HGV 6 6 72 - 72 92区段基因的pUC19中扩增出HGV 6 86 4- 72 77nt片段 ,定向克隆入pGEMEX1质粒 ,再经SacⅠ、HindⅢ酶切亚克隆入高效表达载体pRSETA。结果　重组pRS... 目的　构建含HGVNS5A区基因的原核表达载体。方法　采用PCR方法从重组了HGV 6 6 72 - 72 92区段基因的pUC19中扩增出HGV 6 86 4- 72 77nt片段 ,定向克隆入pGEMEX1质粒 ,再经SacⅠ、HindⅢ酶切亚克隆入高效表达载体pRSETA。结果　重组pRSETA 经序列测定证实插入基因为目的基因 ,符合表达框架 ,经IPTG诱导 ,在BL2 1(DE3)菌株中表达连接 6个组氨酸的HGVNS5A融合蛋白。Westernblotting显示在Marker约 2 5kDa处可见明显的蛋白带 ,与预期结果一致。结论　成功构建了重组HGVNS5A区基因表达载体 ,在BL2 1(DE3)中能有效表达。 展开更多
关键词 庚型肝炎病毒 分子克隆 基因表达
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