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含KSHV vIL-6基因重组分泌型表达载体的构建及其分泌蛋白对内皮细胞增殖和血管生成能力影响的初探 被引量：5
1
作者 朱小飞 秦娣 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期283-288,共6页
目的:构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-assoliated herpesvirus,KSHV)致瘤基因vIL-6的重组分泌型质粒,将其导入内皮细胞系EA.hy926中进行表达,并检测vIL-6对内皮细胞增殖和血管生成作用的影响。方法:根据本实验室先前... 目的:构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-assoliated herpesvirus,KSHV)致瘤基因vIL-6的重组分泌型质粒,将其导入内皮细胞系EA.hy926中进行表达,并检测vIL-6对内皮细胞增殖和血管生成作用的影响。方法:根据本实验室先前构建的pvIL-6 F表达载体中的核酸序列设计PCR引物,在其5′端及3′端分别引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点,PCR扩增vIL-6基因,经双酶切纯化后将其克隆入分泌型真核表达载体pSecTag2B中。重组质粒经核酸测序鉴定后转染EA.hy926细胞,以Western blot检测vIL-6基因的表达情况;另外收集重组分泌型质粒转染293T细胞后的上清,通过细胞增殖实验和微管形成实验分别检测vIL-6通过自分泌或旁分泌方式对内皮细胞增殖和血管生成作用的影响。结果:限制性内切酶鉴定和基因测序证实成功构建了含KSHV vIL-6基因的重组分泌型质粒pSecTag2B-vIL-6,此质粒转染EA.hy926细胞后,Western blot能够在相应位置检测到目的蛋白vIL-6的条带。通过将pSecTag2B-vIL-6瞬时转染EA.hy926细胞或者收集pSecTag2B-vIL-6转染293T细胞后的上清作用于EA.hy926细胞,均观察到细胞增殖和血管生成能力的明显增强。结论:成功构建了重组分泌型质粒pSecTag2B-vIL-6;目的蛋白可在EA.hy926细胞中表达,且vIL-6能够通过自分泌和旁分泌方式促进内皮细胞的增殖和血管生成。 展开更多
关键词 KSHV vil.6 分泌型 细胞增殖 血管生成
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人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL-6全长基因的克隆、表达及表达产物的纯化 被引量：1
2
作者 徐静 朱晓蕾 +1 位作者 秦娣 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期303-307,共5页
目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达,并纯化融合表达的vIL-6。方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和pcD-NA3.1+vIL-6为... 目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达,并纯化融合表达的vIL-6。方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和pcD-NA3.1+vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含HHV-8ORF50截短基因的重组原核表达质粒pORF50-C1,pORF50-C2,pORF50-C3和含vIL-6全长基因的重组原核表达质粒pvIL-6。重组质粒经酶切鉴定和核酸序列测定正确后转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。用glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化vIL-6表达产物。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot检测GST融合蛋白的表达和纯化情况。结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的序列与基因数据库中已登记的HHV-8相应序列呈现100%同源;IPTG诱导后的菌体,经SDS-PAGE,显示有相应大小的融合表达蛋白产生。Western blot亦在预期的位置检测到特异性条带。结论:在E.coli中获得了正确表达的HHV-8ORF50基因3个截短片段和vIL-6全长基因,并成功纯化了vIL-6融合蛋白。 展开更多
关键词 人类疱疹病毒8型 ORF50截短基因 vil-6全长基因 原核表达 亲和层析
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病毒白细胞介素6对甲基转移酶1表达的影响
3
作者 徐建 许雨乔 +3 位作者 潘世扬 彭姗姗 黄蕾 孙瑞红 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期160-163,共4页
目的:观察病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,vIL-6)对甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)表达的影响。方法:vIL-6真核表达质粒转染293T细胞,荧光定量RT-PCR和Western blot法检测DNMT1表达的变化,比色法检测DNMT1的活性。结... 目的:观察病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,vIL-6)对甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)表达的影响。方法:vIL-6真核表达质粒转染293T细胞,荧光定量RT-PCR和Western blot法检测DNMT1表达的变化,比色法检测DNMT1的活性。结果:荧光定量RT-PCR和Western blot均表明vIL-6可显著促进DNMT1的表达,且vIL-6能上调DNMT1的活性。结论:vIL-6能诱导DNMT1的表达,可能是卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)致DNA甲基化异常,促进肿瘤发生发展的分子机制之一。 展开更多
关键词 vil-6 甲基转移酶1 卡波济肉瘤相关疱疹病毒
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HIV-1Nef蛋白通过调控PTEN／PI3K信号通路促进KSHVvIL-6诱导血管生成
4
作者 姚水洪 朱小飞 +1 位作者 卢春 葛高霞 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期627-633,共7页
目的探讨HIV-1Nef蛋白能否通过调控PTEN／P13K信号通路促进卡波氏肉瘤病毒（KSHV）vIL-6诱导血管生成。方法用脂质体转染的方法将pPTEN．cDNA、P13K．DN及其对照空载体质粒分别转染稳定表达KSHVvIL-6和HIV-1Nef蛋白的内皮细胞，采用微... 目的探讨HIV-1Nef蛋白能否通过调控PTEN／P13K信号通路促进卡波氏肉瘤病毒（KSHV）vIL-6诱导血管生成。方法用脂质体转染的方法将pPTEN．cDNA、P13K．DN及其对照空载体质粒分别转染稳定表达KSHVvIL-6和HIV-1Nef蛋白的内皮细胞，采用微管形成试验观察微管形成状况，将这些细胞接种鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）检测血管生成情况。Westernblot进一步检测转染了上述质粒后细胞内源性VrEN和P13K信号分子的表达水平。结果过表达PTEN或抑制P13K表达均可抑制Nef促进vIL-6诱导的内皮细胞微管形成和CAM血管生成。结论HIV-1Nef蛋白通过调控PTEN／P13K信号通路促进KSHVvIL-6诱导血管生成。 展开更多
关键词 KSHV 负调控因子 病毒白细胞介素6 PTEN P13K通路 血管生成
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