随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法...随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。展开更多
文摘随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。
