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患者胃窦黏膜组织幽门螺杆菌real time-PCR检测与分离培养结果的一致性分析 被引量：2
1
作者 杨雅名 何利华 +6 位作者 杨宁敏 宫雅楠 韩秀瑞 范如岳 薛志静 魏永越 张建中 《疾病监测》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期641-645,共5页
目的针对胃黏膜组织标本的幽门螺杆菌(HP)感染诊断的real time-PCR检测和分离培养2种最常用方法进行结果一致性分析,为HP感染诊断方法的选择提供科学依据。方法在浙江省4个地区(萧山、温岭、苍南和湖州)各选取1所医院,采集2020年11月16... 目的针对胃黏膜组织标本的幽门螺杆菌(HP)感染诊断的real time-PCR检测和分离培养2种最常用方法进行结果一致性分析,为HP感染诊断方法的选择提供科学依据。方法在浙江省4个地区(萧山、温岭、苍南和湖州)各选取1所医院,采集2020年11月16日至12月7日送至杭州致远检验医学研究所进行HP分离培养和耐药性分析的全部患者胃窦部黏膜活检标本,共1312份。每份样本经研磨匀浆处理后分为2份,分别用于常规HP分离培养和real time-PCR检测(以cagH为检测靶点),2种方法平行双盲进行。检测结果的一致性及不同医院来源样本间的差异用χ^(2)检验、Fisher精确检验以及独立样本t检验等统计学方法进行分析。结果1312份样本中,分离培养法和real time-PCR法的阳性率分别为29.34%(385/1312)、28.51%(374/1312),差异无统计学意义(P=0.636)。来自4所医院的标本,2种方法的检出率差异均无统计学意义(P=0.075),二者在萧山某院、温岭某院、苍南某院、湖州某院样本以及总体样本中的Kappa值分别为0.84、0.89、0.75、0.91、0.85。real time-PCR法的灵敏度和特异度分别为89.26%、100.00%。在real time-PCR法检测阳性而培养阴性的样本中,检测Ct值为25.47~34.97,均值为30.90,90%的Ct值均≤34.46,频数最高组为29.00~30.00组。结论分离培养法和real time-PCR法在临床胃黏膜标本HP诊断中均可达到较高的检测效能,且2种方法检出结果一致性良好,可应用于HP个体化治疗,以便在做出HP感染诊断的同时提供受检者的药敏检测结果。标本中HP菌量及标本的保存运输条件可能对结果产生重要影响。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 胃窦 分离培养 Real time-pcr
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18srDNA为内参照的Real-Time-PCR方法检测半夏病毒 被引量：2
2
作者 何煜波 陈集双 +2 位作者 陈海敏 冯俊丽 高必达 《晓庄学院自然科学学报》 EI CAS 北大核心 2006年第3期103-106,共4页
利用实时荧光PCR方法,以18srRNA为内参照,对半夏植株及相应组培苗携带的黄瓜花叶病毒(Cu-cumber Mosaic Virus,CMV)含量进行了相对定量检测.并以DAS-ELISA和RT-PCR方法检测结果相比较.结果表明,相比原始植株,组培苗的病毒含量大大降低.... 利用实时荧光PCR方法,以18srRNA为内参照,对半夏植株及相应组培苗携带的黄瓜花叶病毒(Cu-cumber Mosaic Virus,CMV)含量进行了相对定量检测.并以DAS-ELISA和RT-PCR方法检测结果相比较.结果表明,相比原始植株,组培苗的病毒含量大大降低.以带病毒半夏母株为外植体培养的组培苗,其病毒含量以叶片中的相对较高,在块茎和愈伤组织中病毒相对较低.而ELISA方法在检测病毒含量低的样品时有假阴性结果;RT-PCR方法灵敏度可靠但不适宜精确量化. 展开更多
关键词 实时荧光PCR 黄瓜花叶病毒 反转录-PCR 双夹心酶联免疫反应 半夏
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早期分泌抗原靶标6免疫组织化学联合抗酸染色法检测在结核病病理诊断中的价值
3
作者 童海涛 郑叶 +5 位作者 周静 冯艳玲 石雨涵 曾东 郭文娟 宋曙 《安徽医药》 2026年第1期160-164,I0007,共6页
目的探讨早期分泌抗原靶标6(early secreted antigenic target 6,ESAT-6)联合抗酸染色检测在结核病病理诊断中的意义。方法收集2017年1—8月上海市公共卫生临床中心病理学诊断结核病的病人81例临床资料,评价ESAT-6免疫组织化学法、抗酸... 目的探讨早期分泌抗原靶标6(early secreted antigenic target 6,ESAT-6)联合抗酸染色检测在结核病病理诊断中的意义。方法收集2017年1—8月上海市公共卫生临床中心病理学诊断结核病的病人81例临床资料,评价ESAT-6免疫组织化学法、抗酸染色法、实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)法检测对结核病的诊断效能,分析不同方法检测的一致性关系,并以qRT-PCR法为标准衡量ESAT-6免疫组织化学联合抗酸染色法检测的效果。结果3种检测方法按结核杆菌检出率从高到低分别为qRT-PCR法(87.65%,71/81)、抗酸染色法(72.84%,59/81)、ESAT-6免疫组织化学法(64.20%,52/81)(χ^(2)=12.13,P=0.002)。3种方法在不同病变组织的结核杆菌检出率差异无统计学意义(χ^(2)=7.53、4.94、5.92,P=0.110、0.294、0.210)。ESAT-6免疫组织化学法与抗酸染色法检出率差异无统计学意义(χ^(2)=1.40,P=0.236),3种方法总检出率为93.83%,qRT-PCR法检出率显著高于ESAT-6免疫组织化学法与抗酸染色法(χ^(2)=12.19,P=0.001;χ^(2)=5.61,P=0.018)。抗酸染色和免疫组织化学法联合检测检出率(85.19%,69/81)稍低于单独使用qRT-PCR检测检出率(87.65%,71/81),差异无统计学意义(χ^(2)=0.21,P=0.647)。64例样本ESAT-6免疫组织化学联合抗酸染色法检测与qRT-PCR检测均为阳性,5例样本ESAT-6免疫组织化学联合抗酸染色法检测与qRT-PCR检测均为阴性,检出一致性为93.82%(Kappa=0.37,P=0.028)。结论ESAT-6免疫组织化学联合抗酸染色法检测在结核病病理诊断中有较高价值。 展开更多
关键词 结核病 病理诊断 免疫组织化学 早期分泌抗原靶标6(ESAT-6) 抗酸染色 实时荧光定量PCR
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传染性胰脏坏死病毒(IPNV)检测及区分1、5基因型方法的建立及应用
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作者 刘威彤 张振 +3 位作者 赵景壮 邵轶智 卢彤岩 徐黎明 《水产学报》 北大核心 2026年第2期221-231,共11页
【目的】建立传染性胰脏坏死病毒(IPNV)鉴定与基因分型一体化检测方法。【方法】基于IPNV VP2基因序列保守片段,设计了用于IPNV高效检测的探针法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物;进一步针对IPNV 1型和5型毒株特异性片段设计了用于IPNV基... 【目的】建立传染性胰脏坏死病毒(IPNV)鉴定与基因分型一体化检测方法。【方法】基于IPNV VP2基因序列保守片段,设计了用于IPNV高效检测的探针法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物;进一步针对IPNV 1型和5型毒株特异性片段设计了用于IPNV基因分型的聚合酶链式反应(PCR)引物组,并对检测方法进行优化与验证。【结果】本研究建立的RT-qPCR检测方法对IPNV具有较高的特异性,对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的核酸均无扩增;灵敏度高,对IPNV 1型和5型检测限均低至10个/μL拷贝数;稳定性良好,批内和批间重复变异系数均小于1%。利用本研究建立的RT-qPCR和PCR方法对来自不同虹鳟养殖区域的30份已鉴定样本进行IPNV检测与基因分型,结果符合率为100%。【结论】本研究建立的方法能够特异、稳定、灵敏地检测IPNV并准确区分基因1型或5型毒株,实现了病原鉴定与基因分型的高效一体化检测。本研究为我国IPNV的监测提供了有效的工具,为IPN病害的分类防控提供了科学指导。 展开更多
关键词 冷水性鱼类 传染性胰脏坏死病毒(IPNV) 基因型分析 实时荧光定量PCR 快速检测
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基于EVM009基因的鼠痘病毒荧光定量检测方法建立
5
作者 赵立磊 任善会 +11 位作者 王会宝 高小龙 姚威 杨雪 张红强 王小龙 张强蓉 喇萍 叶国荣 陈豪泰 孙跃峰 樊江峰 《动物医学进展》 北大核心 2026年第1期9-14,共6页
为建立一种快速测定鼠痘病毒(ECTV)含量的检测方法,针对鼠痘病毒的基因序列,建立了靶向ECTV EVM009基因的荧光定量PCR检测方法。根据ECTV全基因序列,设计出4对qPCR引物并评价其特异性及敏感性。最终通过筛选得到靶向于ECTV EVM009基因... 为建立一种快速测定鼠痘病毒(ECTV)含量的检测方法,针对鼠痘病毒的基因序列,建立了靶向ECTV EVM009基因的荧光定量PCR检测方法。根据ECTV全基因序列,设计出4对qPCR引物并评价其特异性及敏感性。最终通过筛选得到靶向于ECTV EVM009基因的一对特异性高、灵敏度强的荧光定量PCR引物。利用构建的pCAGGS-EVM009真核表达质粒绘制标准曲线获得标准曲线y=-3.5099 x+41.30,线性相关系数R^(2)=0.9992。扩增效率达到92.7%;对重组质粒标准品的最低检测限为4.91×10^(0)拷贝/μL;组内与组间的重复试验变异系数均小于2%;仅能有效检测ECTV,与VACV、GPTV、SPPV、ORFV和LSDV均无交叉反应。结果表明,建立的荧光定量检测方法特异性强、敏感性高及重复性好,可以用于ECTV感染小鼠模型中病理组织中病毒载量的测定。 展开更多
关键词 鼠痘病毒 EVM009基因 荧光定量PCR 小鼠模型
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猫疱疹病毒Ⅰ型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及应用
6
作者 刘雅雯 赵广荣 +9 位作者 许丽文 孙亚杰 李双双 刘佳佳 李智杰 张成琪 符建海 张子闯 胡博 白雪 《畜牧与兽医》 北大核心 2026年第1期79-84,共6页
猫疱疹病毒I型(FHV-1)是威胁猫科动物健康的重要传染性疾病,本研究旨在研发一种灵敏、高效的FHV-1检测技术。依据GenBank上FHV-1 US6保守区域的基因序列,设计合成1对针对FHV-1 gD基因的引物,建立了一种SYBR Green I荧光定量PCR的检测方... 猫疱疹病毒I型(FHV-1)是威胁猫科动物健康的重要传染性疾病,本研究旨在研发一种灵敏、高效的FHV-1检测技术。依据GenBank上FHV-1 US6保守区域的基因序列,设计合成1对针对FHV-1 gD基因的引物,建立了一种SYBR Green I荧光定量PCR的检测方法,构建标准曲线后分别验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并将其进一步应用于人工感染猫产生的临床样本检测。结果:该特异性引物与猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)和猫冠状病毒(FCoV)均未出现交叉反应,检测下限为14.78 copies/μL,组内和组间重复试验的变异系数均低于2%;该方法对临床样本的检出率比常规PCR高出25.46%;通过该方法检测人工感染FHV-1强毒后猫的每日排毒量,结果呈现上升趋势,与临床发病程度相符,猫的脏器病毒载量存在个体差异,但集中在心脏、肺脏、肠道和膀胱中检出。综上,该研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法对FHV-1具有较好的特异性、灵敏度和重复性,为FHV-1感染的快速诊断以及疾病的防控提供方法支持。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒Ⅰ型 荧光定量PCR SYBR GreenⅠ US6基因 猫病毒性鼻气管炎
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血清学检测指标及实时荧光定量PCR检测在侵袭性念珠菌病患者中的诊断价值
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作者 MD ALI HOSSAIN 彭亮 +2 位作者 袁余 周晓涵 马莹 《四川大学学报(医学版)》 北大核心 2026年第1期170-176,共7页
目的 评估血清学检测指标1, 3-β-D-葡聚糖试验(G试验)、念珠菌甘露聚糖(Mn)抗原、念珠菌甘露聚糖IgG抗体(Mn-IgG)和实时荧光定量PCR(qPCR)检测在侵袭性念珠菌病(IC)患者中的临床诊断价值。方法 收集四川大学华西医院2022年12月-2024年1... 目的 评估血清学检测指标1, 3-β-D-葡聚糖试验(G试验)、念珠菌甘露聚糖(Mn)抗原、念珠菌甘露聚糖IgG抗体(Mn-IgG)和实时荧光定量PCR(qPCR)检测在侵袭性念珠菌病(IC)患者中的临床诊断价值。方法 收集四川大学华西医院2022年12月-2024年12月期间通过血培养及无菌体液培养确诊为IC患者的血清样本79例作为IC组,排除IC感染患者的血清样本83例作为非IC组,进行G试验(磁微粒化学发光法)、Mn抗原(ELISA法)、Mn-IgG抗体(化学发光法)和qPCR检测。比较分析G试验、Mn抗原、Mn-IgG抗体和qPCR检测及联合检测对IC诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值,绘制受试者工作特征(ROC)曲线并计算ROC曲线下面积(AUC)。结果 3种血清学检测指标单独检测对IC诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为:G试验62.03%、94.87%、92.45%、71.15%;Mn抗原65.63%、86.59%、79.25%、76.34%;Mn-IgG抗体31.65%、87.95%、71.43%、57.48%。G试验、Mn抗原、Mn-IgG三项联合检测敏感性提高至73.44%。基于ROC曲线分析,各血清学检测指标诊断IC的AUC分别为:G试验0.862(95%CI:0.803-0.922)、Mn试验0.853(95%CI:0.790-0.915)、Mn-IgG 0.603(95%CI:0.514-0.692)。G试验+Mn试验两项联合检测、G试验+Mn-IgG两项联合检测、G试验+Mn试验+Mn-IgG三项联合检测的AUC分别为0.875(95%CI:0.809-0.925)、0.869(95%CI:0.805-0.917)和0.875(95%CI:0.809-0.924),优于单独检测。qPCR对IC诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为100.00%、98.80%、98.75%、100.00%。以培养菌株基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定结果为金标准,qPCR检测对白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌的诊断一致性分别为100.00%、100.00%、94.44%和90.00%。结论 G试验、Mn抗原和Mn-IgG抗体联合检测可提高诊断敏感性,有助于IC的早期诊断。qPCR对IC具有优异的诊断性能,可将IC常见念珠菌鉴定至种水平,并可覆盖其他念珠菌种,与临床培养方法结果一致性好。 展开更多
关键词 1 3-β-D葡聚糖 念珠菌甘露聚糖抗原 念珠菌甘露聚糖IgG抗体 实时荧光定量PCR 侵袭性念珠菌病
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布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
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作者 彭海涛 高阳 +6 位作者 刘雨欣 顾德媛 张东 张如 许会会 陈思 杨艳玲 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第1期369-377,共9页
旨在建立一种经济高效的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法,用于布鲁菌感染的动物及动物产品的快速检测并区分牛种布鲁菌和其他种布鲁菌感染的动物,为临床常的疫苗和研发的新型疫苗提供科学有效的鉴别诊断方法。本研究根据GenBan... 旨在建立一种经济高效的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法,用于布鲁菌感染的动物及动物产品的快速检测并区分牛种布鲁菌和其他种布鲁菌感染的动物,为临床常的疫苗和研发的新型疫苗提供科学有效的鉴别诊断方法。本研究根据GenBank公布的galU和Omp31的序列设计检测引物和探针,构建重组质粒,对方法特异性、灵敏性及重复性评价,检测实验室制备和临床动物布病血清及组织样品。结果表明,成功建立了布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,该方法最低检测限为1.93×10^(0) copies·μL^(-1),与其他革兰阴性菌无交叉反应,批内及批间变异系数均小于2%。利用本研究建立的方法检测实验室制备样品和临床采集样品共156份,与BCSP31-PCR相比,两者阳性符合率为69.75%;与PCR和虎红凝集试验相比,灵敏性更高,双重TaqMan荧光定量PCR的敏感性为100%,PCR的敏感性为69.75%,虎红凝集试验的敏感性为58.65%。本研究建立的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,为布鲁菌临床鉴别检测、流行病学调查及净化提供技术支持。 展开更多
关键词 布鲁菌 双重Taq Man荧光定量PCR 检测方法 鉴别诊断
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甘蔗杆状病毒绝对荧光定量检测方法的建立与应用
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作者 夏宝山 王文治 +2 位作者 张树珍 袁潜华 沈林波 《热带生物学报(中英文)》 2026年第1期108-116,共9页
为建立甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus,SCBV)的绝对荧光定量PCR检测方法,并测定甘蔗不同组织部位中SCBV载量,本研究从SCBV基因组保守区(SCBV-ORF1)设计特异性扩增引物,构建重组质粒pMD19T-SCBV-P1作为阳性质粒标准品,以其为... 为建立甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus,SCBV)的绝对荧光定量PCR检测方法,并测定甘蔗不同组织部位中SCBV载量,本研究从SCBV基因组保守区(SCBV-ORF1)设计特异性扩增引物,构建重组质粒pMD19T-SCBV-P1作为阳性质粒标准品,以其为模板建立SCBV绝对荧光定量PCR检测方法。测试该方法的灵敏性、特异性和稳定性,并用该方法测定甘蔗种质不同组织中SCBV载量。结果表明,将含有SCBV基因组序列的重组质粒10倍比稀释成标准品,以其为模板进行荧光定量PCR,获得标准曲线y=-3.3397×log(x)+32.05,相关系数r^(2)=0.999;表明Cq值与标准品浓度拷贝数的对数呈线性关系。研究建立的绝对荧光定量PCR方法展现出高灵敏度特征,其检测下限可达到7 copies·μL^(-1),相较于常规PCR检测法,该方法的灵敏度提高了近100倍。该方法特异性高,可特异检测SCBV;重复性良好,批内和批间的变异系数均在0.11%~0.90%。甘蔗不同组织部位SCBV累积水平存在显著差异,其中正4叶SCBV载量显著高于其他组织部位(P<0.05)。本研究建立了能灵敏特异检测SCBV的绝对荧光定量PCR方法,为SCBV的诊断提供一种高效的定量检测方法,明确了甘蔗中SCBV检测的最佳采样部位是正4叶。 展开更多
关键词 甘蔗杆状病毒 绝对荧光定量PCR 病毒载量 检测
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槲树不同器官及盐胁迫下qRT-PCR的内参基因筛选及验证
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作者 蒋萌 白晓宁 +4 位作者 王文波 赵亚洲 胡增辉 苏淑钗 冷平生 《中南林业科技大学学报》 北大核心 2026年第1期211-220,234,共11页
[目的]筛选在不同器官及盐胁迫下表达稳定的槲树内参基因,验证所选内参基因在qRT-PCR中的适用性和稳定性,为精准评价槲树目标基因表达量提供理论依据。[方法]从槲树盐胁迫转录组中筛选出10个高表达传统管家基因作为候选内参基因(TUBA、T... [目的]筛选在不同器官及盐胁迫下表达稳定的槲树内参基因,验证所选内参基因在qRT-PCR中的适用性和稳定性,为精准评价槲树目标基因表达量提供理论依据。[方法]从槲树盐胁迫转录组中筛选出10个高表达传统管家基因作为候选内参基因(TUBA、TUBA、GAPDH、Actin、EIF2B5、UBE2W、ADCK、EEF1B、UBE2J1和EIF5A),采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件和ΔCt程序对候选基因在槲树中的表达稳定性进行分析。以槲树6个器官(根、茎、叶、叶芽、花序、种子)及盐胁迫下4个不同处理时期(CK、3 h、24 h、96 h)的叶片为样品,通过qRT-PCR技术,结合候选内参基因,验证过氧化氢酶基因QdCAT2在槲树不同器官及盐胁迫下的表达模式以及候选内参基因的表达稳定性。[结果]10个候选内参基因中,EIF5A和UBE2W的表达稳定性最高,综合排名位居前列,EIF2B5为最不稳定内参基因。QdCAT2基因在槲树叶片中表达量最高,且随着盐胁迫时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势,在处理3 h后达到高峰,使用EIF5A、UBE2W及EIF5A+UBE2W组合作为内参基因得到的相对表达结果基本一致,表明EIF5A和UBE2W为槲树各器官及盐胁迫最适合的内参基因。[结论]成功筛选出了2个稳定内参基因,并验证了EIF5A、UBE2W及EIF5A+UBE2W组合均适合作为槲树不同器官及盐胁迫下qRT-PCR的内参基因,为槲树不同器官及盐胁迫下基因表达分析提供了参考,并为后续槲树分子生物学研究奠定理论基础。 展开更多
关键词 槲树 实时荧光定量PCR 内参基因筛选 盐胁迫 表达分析
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实时荧光定量PCR与传统方法诊断HIV感染者合并耶氏肺孢子菌肺炎的效能比较
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作者 许少莉 王梦琦 +1 位作者 马丹丹 侯淑芬 《临床研究》 2026年第1期121-123,128,共4页
目的探讨实时荧光定量PCR(qPCR)与传统染色技术在艾滋病(HIV)感染者合并耶氏肺孢子菌肺炎中的诊断效能。方法选取2023年12月至2025年4月郑州市第六人民医院接收的130例疑似耶氏肺孢子菌肺炎的HIV感染者,共收集130份呼吸道标本(BALF或痰... 目的探讨实时荧光定量PCR(qPCR)与传统染色技术在艾滋病(HIV)感染者合并耶氏肺孢子菌肺炎中的诊断效能。方法选取2023年12月至2025年4月郑州市第六人民医院接收的130例疑似耶氏肺孢子菌肺炎的HIV感染者,共收集130份呼吸道标本(BALF或痰液)。所有患者于入院48 h内采集支气管肺泡灌洗液(BALF)或痰液,同期开展qPCR与传统染色[六胺银(GMS)染色]检测,比较两种方法的耶氏肺孢子菌肺炎诊断效能。结果所有130例均完成GMS染色检测,以临床最终裁决诊断为参照。GMS染色检出耶氏肺孢子菌肺炎19例(真阳19例,假阳0例),非耶氏肺孢子菌肺炎111例(真阴48例,假阴63例),其敏感度为23.17%(19/82),特异度为100.00%(48/48)。qPCR检出耶氏肺孢子菌肺炎84例(真阳78例,假阳6例),非耶氏肺孢子菌肺炎46例(真阴42例,假阴4例),其敏感度为95.12%(78/82),特异度为87.50%(42/48)。与GMS染色相比,qPCR法表现出明显更高的敏感度与总体准确度。两种方法均具有较高的特异度,GMS染色法特异度高于qPCR法。配对McNemar检验提示两法敏感度、特异度、准确率均存在统计学差异(P<0.05)。结论在HIV感染者疑似耶氏肺孢子菌肺炎的诊断中,qPCR相较于传统GMS染色,其敏感度与准确度较高。建议以qPCR作为首选检测手段,结合GMS染色及临床综合证据进行分层判定,以减少漏诊、提升诊断效率并优化治疗决策。 展开更多
关键词 艾滋病感染者 耶氏肺孢子菌肺炎 实时荧光定量PCR 六胺银染色 诊断效能 支气管肺泡灌洗液
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转基因大豆DBN8205转化体特异性定量PCR方法的研发和验证
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作者 吴琼 谢香庭 +2 位作者 王磊 牟勇 李进伟 《中国农业科学》 北大核心 2026年第1期29-40,共12页
【目的】转基因大豆DBN8205转化体已获批转基因生物安全证书(生产应用),转育品种即将产业化应用,建立DBN8205转化体特异性定性定量检测方法,为转基因生物安全监管和定量标识制度的实施提供依据。【方法】根据DBN8205转化体的分子特征序... 【目的】转基因大豆DBN8205转化体已获批转基因生物安全证书(生产应用),转育品种即将产业化应用,建立DBN8205转化体特异性定性定量检测方法,为转基因生物安全监管和定量标识制度的实施提供依据。【方法】根据DBN8205转化体的分子特征序列,设计转化体特异性引物和探针。通过比较多个引物探针组合的扩增曲线及Ct值,筛选出最佳引物探针组合。分别在实时荧光定量PCR和微滴数字PCR平台上考察DBN8205转化体特异性PCR方法的特异性、检测限、定量限、动力学范围和定量准确性等技术参数。制定标准方法联合验证方案,邀请多家实验室对实时荧光定量PCR方法进行联合验证,对联合验证数据进行统计分析,考察方法的重复性和重现性。【结果】筛选出最佳引物探针组合DBN8205-QF/QR/QP,扩增产物长120 bp,仅特异性识别DBN8205转化体成分,具有良好的扩增特异性。在实时荧光定量PCR平台上,检测限为10 copies,定量限为40 copies,标准曲线的各项技术参数符合标准要求,在40—8.2×10^(4)copies动力学范围内,模板拷贝数和Ct值间具有良好的线性关系,能够对含量低至0.1%的样品进行准确定量。8家实验室联合验证结果表明,DBN8205转化体特异性实时荧光定量PCR方法具有良好的重复性和重现性。在微滴数字PCR平台上,检测限和定量限与实时荧光定量PCR方法相同,分别为10和40 copies,动力学范围为40—8.0×10^(4)copies,能够对低至0.1%的样品进行准确定量,定量结果比qPCR具有更高的精密度。t检验表明,实时荧光定量PCR和二重微滴数字PCR的定量结果具有良好的一致性。【结论】建立的DBN8205转化体特异性定量PCR方法能够对DBN8205转化体进行身份鉴定,可在实时荧光定量PCR和微滴数字PCR平台上对产品中的DBN8205转化体成分进行精准定量分析。 展开更多
关键词 转基因大豆 DBN8205转化体 实时荧光定量PCR 二重微滴数字PCR 定量
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实时荧光PCR技术快速鉴定金银花和山银花成分的研究
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作者 雷庆 赵中开 金昊嵩 《山东化工》 2026年第3期147-153,237,共8页
为了快速准确地检测金银花和4种山银花成分,试验采用实时荧光PCR方法,分别以金银花、灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬和黄褐毛忍冬的特异性基因为研究对象,设计实时荧光PCR扩增的特异性引物及探针,建立金银花和4种山银花成分的实时荧光... 为了快速准确地检测金银花和4种山银花成分,试验采用实时荧光PCR方法,分别以金银花、灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬和黄褐毛忍冬的特异性基因为研究对象,设计实时荧光PCR扩增的特异性引物及探针,建立金银花和4种山银花成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:该检测方法特异性强、灵敏度高(检出限达到0.1%),可以准确、大批量地开展金银花和山银花的快速鉴别工作。 展开更多
关键词 金银花 山银花 实时荧光PCR 快速鉴别
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日本黄瓜绿斑驳花叶病毒常规和实时荧光RT-PCR检测
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作者 陈红运 叶明辉 +3 位作者 陈青 廖富荣 于子翔 沈建国 《植物检疫》 2026年第1期53-57,共5页
本研究以日本黄瓜绿斑驳花叶病毒(kyuri green mottle mosaic virus,KGMMV)为材料,设计1对常规RT-PCR检测引物KGCPN-F/KGCPN-R和1组引物/探针KGM-F/KGM-R/KGM-P,分析测试了2对已发表KGMMV常规RT-PCR检测引物KGCP-F/KGCP-R和KGMP-F/KGMP... 本研究以日本黄瓜绿斑驳花叶病毒(kyuri green mottle mosaic virus,KGMMV)为材料,设计1对常规RT-PCR检测引物KGCPN-F/KGCPN-R和1组引物/探针KGM-F/KGM-R/KGM-P,分析测试了2对已发表KGMMV常规RT-PCR检测引物KGCP-F/KGCP-R和KGMP-F/KGMP-R,建立了KGMMV的常规和实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,引物KGCP-F/KGCP-R扩增KGMMV时出现预期大小的条带,扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)时出现非常微弱的条带;引物KGCPN-F/KGCPN-R扩增KGMMV时出现预期大小的条带,扩增小西葫芦绿斑驳花叶病毒(zucchini green mottle mosaic virus,ZGMMV)时出现比预期稍大的条带,通过对PCR产物进行序列测定和分析比对可准确鉴定KGMMV。KGCP-F/KGCP-R和KGCPN-F/KGCPN-R的相对灵敏度分别为10^(-6)和10^(-5)稀释度,适用于KGMMV的常规RT-PCR检测。基于引物探针KGM-F/KGM-R/KGM-P建立的KGMMV实时荧光RT-PCR检测方法能特异性检出KGMMV,相对灵敏度达10^(-7)稀释度,分别比2对常规RT-PCR检测引物高10倍和100倍,适用于瓜类种子中KGMMV的快速检测。 展开更多
关键词 日本黄瓜绿斑驳花叶病毒 常规RT-PCR 实时荧光RT-PCR 检测
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食品香菇源性成分荧光PCR检测方法研究
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作者 苏丽娜 李凤新 +2 位作者 吴杰 曾宪东 郑剑 《生物技术进展》 2026年第1期149-156,共8页
香菇具有重要的食药用价值,市场上掺假的情况屡有发生,传统的形态学鉴定方法难以对香菇深加工产品进行鉴定,建立香菇源性成分分子生物学检测方法具有重要意义。根据香菇线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位1(nicotinamide adenine d... 香菇具有重要的食药用价值,市场上掺假的情况屡有发生,传统的形态学鉴定方法难以对香菇深加工产品进行鉴定,建立香菇源性成分分子生物学检测方法具有重要意义。根据香菇线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位1(nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 1, ND1)基因序列设计特异性引物和探针,建立食品中香菇源性成分实时荧光PCR检测方法。结果表明,方法仅对花菇、厚菇、薄菇、野生香菇有扩增,对其他常见的28种食用菌均无交叉反应,方法的检出限分别为100 copies·μL^(-1)和0.05%(质量分数),且具有很好的重复性,实际应用检测准确。该方法特异性好、灵敏度高,稳定且实用,可以满足食品中香菇源性成分的检测需求。 展开更多
关键词 香菇 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位1 实时荧光PCR 源性成分检测
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端粒酶活性检测RQ-TRAP方法学验证及在间充质干细胞检测评价中的应用研究
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作者 张真 喻谢安 +3 位作者 许淳淇 陈宁 秦美蓉 王平 《中国药物警戒》 2026年第2期121-126,共6页
目的验证实时定量端粒酶重复扩增方法(Real-Time Quantitative Telomerase Repeat Amplification Protocol,RQ-TRAP)的方法学性能,包括专属性、准确性、精密度、线性、扩增效率、定量下限(Lower Limit of Quantification,LLOQ),并将其... 目的验证实时定量端粒酶重复扩增方法(Real-Time Quantitative Telomerase Repeat Amplification Protocol,RQ-TRAP)的方法学性能,包括专属性、准确性、精密度、线性、扩增效率、定量下限(Lower Limit of Quantification,LLOQ),并将其应用于人源间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)的端粒酶活性检测评价,以评估hMSCs的增殖潜能、衰老进程及潜在肿瘤转化风险,为再生医学中的细胞疗法提供标准化检测手段。方法采用RQ-TRAP方法对hMSCs进行端粒酶活性检测。hMSCs来源于人脐带,培养于MEM-α培养液中。样品制备包括细胞裂解提取,RQ-TRAP体系使用TRAP Reaction Buffer等试剂,荧光定量聚合酶链式反应仪进行绝对定量检测。方法学验证使用TSR8标准品进行专属性、准确性(回收率)、中间精密度(RSD)、线性(R^(2)和扩增效率)和LLOQ(回收率置信区间)评估。hMSCs检测包括标准曲线拟合和Ct值计算端粒酶活性。结果方法学验证显示专属性良好,无热灭活细胞基质干扰;准确性回收率95%置信区间为91.37%~111.0%(符合75%~125%);中间精密度RSD均<25%;线性R^(2)>0.99,扩增效率104.1%(90%~110%);LLOQ为0.2 TPG Units(回收率置信区间70%~130%)。hMSCs端粒酶活性为1.432 TPG/万个细胞,标准曲线扩增效率102.6%。结论RQ-TRAP方法经验证可靠、灵敏,适用于hMSCs端粒酶活性定量检测,可有效评估细胞衰老和肿瘤风险。该方法填补hMSCs标准化检测空白,支持再生医学安全应用。 展开更多
关键词 端粒酶活性 间充质干细胞 成瘤性检测 荧光定量PCR 方法学验证
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一株还原亚硒酸盐的索诺拉沙漠芽孢杆菌的分离鉴定及特性
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作者 魏诗雅 陈纪新 +6 位作者 李娜娜 赵思洋 朱颖 邹伊晗 吴明缘 赵鑫 王璋倩 《食品研究与开发》 2026年第4期179-187,共9页
近年来,微生物转化技术已成为提高土壤中硒生物利用度的重要手段,尤其是通过微生物将低效价的亚硒酸盐转化为具有更高生物活性的纳米硒。该文从堇叶碎米荠根际土壤中分离鉴定一株高耐硒菌株NL4,探究菌株生长特性、生物特性及硒还原特性... 近年来,微生物转化技术已成为提高土壤中硒生物利用度的重要手段,尤其是通过微生物将低效价的亚硒酸盐转化为具有更高生物活性的纳米硒。该文从堇叶碎米荠根际土壤中分离鉴定一株高耐硒菌株NL4,探究菌株生长特性、生物特性及硒还原特性,并对产物纳米硒进行系统表征;通过检测全局转录调节因子CcpA和CodY转录水平变化,分析碳氮代谢调控网络对亚硒酸钠的响应。结果表明,该菌株为索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis),对多种抗生素敏感,且具有产蛋白酶和淀粉酶的能力。通过不同温度、pH值、NaCl浓度等指标对其生长特性进行评价,发现该菌株在35℃、pH6.0和含1%NaCl的培养条件下生长较好。在此条件下,24 h内还原85.94%亚硒酸钠(2.5 mmol/L)并生成球形纳米颗粒;亚硒酸钠处理使全局转录调节因子CcpA基因表达水平升高而CodY基因表达水平降低,表现为菌株碳代谢受到抑制而氮代谢增强。依据产物的表征结果,确认合成的球形纳米颗粒为纳米硒,其表面包裹有蛋白质和多糖,粒径小具有良好的稳定性。 展开更多
关键词 筛选 索诺拉沙漠芽孢杆菌 亚硒酸钠 纳米硒 生物特性 实时荧光定量聚合酶链式反应
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布鲁氏菌超快速荧光PCR方法建立与临床应用 被引量：2
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作者 徐振娜 吴志鹏 +9 位作者 洪伟彬 管知深 林其明 莫钻兰 叶毅飞 谢海燕 李敏 朱燕秋 李小军 张险朋 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第3期278-283,共6页
目的 建立布鲁氏菌超快速荧光PCR检测方法,应用于临床样品的快速检测。方法 以外源性重组质粒为内参,选取布鲁氏菌重要毒力因子T4SS分泌系统为靶基因设计引物、探针,建立布鲁氏菌超快速荧光PCR检测方法。评价该方法的灵敏度、特异性、... 目的 建立布鲁氏菌超快速荧光PCR检测方法,应用于临床样品的快速检测。方法 以外源性重组质粒为内参,选取布鲁氏菌重要毒力因子T4SS分泌系统为靶基因设计引物、探针,建立布鲁氏菌超快速荧光PCR检测方法。评价该方法的灵敏度、特异性、重复性,绘制标准曲线,与荧光PCR方法检测临床样品比较符合率。结果 该方法检测时间短,10 min即可完成。标准曲线Y=-3.410 7x+38.357,R^(2)=0.998 5,线性关系良好,最低检测限为10 copies/μL。该方法具有良好的特异性,对布鲁氏菌以外的几个临床常见细菌均无特异性扩增。检测3种浓度的阳性质粒,CV值为0.20%~0.91%,说明该方法具有极好的重复性。与荧光PCR方法同时检测140份临床样品,结果完全一致,符合率100%。结论 本研究建立了一种用时短、特异性强、灵敏度高、重复性好布鲁氏菌超快速荧光PCR检测方法,可用于布鲁氏菌临床检测和疫情紧急排查,对布鲁氏菌早期诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 超快速荧光PCR 外源性内参 实时荧光PCR
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鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用 被引量：1
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作者 董志民 王利丽 +3 位作者 田向学 路超 张莉 鄢明华 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第5期987-993,1025,共8页
为快速检测与鉴别鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究根据NCBI数据库中2种病原的16S rRNA基因序列的保守区,分别设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时检测MG... 为快速检测与鉴别鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究根据NCBI数据库中2种病原的16S rRNA基因序列的保守区,分别设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时检测MG和MS的双重TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性和可靠性进行了验证。结果显示,该方法可特异性扩增MG和MS,与21种病原无交叉反应;对MG与MS阳性标准品的检测限分别为5.40×10^(1)、6.60×10^(1)拷贝/μL,敏感性较已知方法提高10~100倍;组内和组间的变异系数均小于1%;与NY/T 553-2015中的单一PCR扩增方法相比,阳性样品、阴性样品及总样品检测符合率均为100.00%;利用该方法检测84份疑似支原体感染的鸡病料样品,结果显示,单一感染MG的病鸡样品阳性率32.14%(27/84)、单一感染MS的样品阳性率22.62%(19/84)、混合感染MG和MS的样品阳性率16.67%(14/84);此外,检测182份健康鸡泄殖腔拭子样品、118份健康鸡鼻拭子样品及74份养鸡场环境样品,结果显示,各类样品中均可检测出支原体阳性样本。结果表明,该方法可适用于多种类型临床样品的检测。综上所述,本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可用于MG和MS感染的临床鉴别检测、流行病学调查及病原的净化。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 荧光定量PCR 鉴别检测
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取食人工饲料和豆蚜的七星瓢虫转录组比较分析 被引量：1
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作者 程英 周宇航 +1 位作者 金剑雪 李凤良 《环境昆虫学报》 北大核心 2025年第2期601-612,共12页
为明确七星瓢虫Coccinella septempunctata取食人工饲料和豆蚜Aphis craccivora的生物特性分子机制和营养代谢通路,利用高通量测序技术分析七星瓢虫4龄幼虫和成虫的相对转录水平。结果显示,从18个样本中共筛选出1 234 640 650条干净序列... 为明确七星瓢虫Coccinella septempunctata取食人工饲料和豆蚜Aphis craccivora的生物特性分子机制和营养代谢通路,利用高通量测序技术分析七星瓢虫4龄幼虫和成虫的相对转录水平。结果显示,从18个样本中共筛选出1 234 640 650条干净序列(clean reads),与参考基因组比对到813 335 465条序列。通过DESeq2软件分析,其中有11 120个差异基因(DEGs)表达水平发生了显著的变化,总共有2 280条DEGs被注释到KEGG通路中。在取食人工饲料的七星瓢虫中,与生物学特性相关的细胞色素P450 (Cytochrome P450)、保幼激素环氧水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)、保幼激素酯酶(Juvenile-hormone esterase, JHE)、保幼激素Ⅲ合成酶(Juvenile hormone-Ⅲ synthase,JHAMT)、多巴脱羧酶(Dopa decarboxylase, DDC)和几丁质酶(Chitinase)大部分DEGs在4龄幼虫、雌雄成虫中下调,精液蛋白基因α-酮戊二酸脱氢酶(2-oxoglutarate dehydrogenase, sucA)和胰岛素样生长因子2 (Insulin-like growth factor 2) DEGs在雌、雄成虫中均上调,脂蛋白(Lipoprotein) DEGs在雌虫中大部分上调,蜕皮诱导蛋白(Ecdysone-induced protein)基因在幼虫中下调。DEGs在KEGG中富集到6个氨基酸、7个脂类代谢、2个淀粉和糖代谢、6个维生素相关代谢通路。其中取食人工饲料的七星瓢虫大部分氨基酸代谢通路基因下调;脂类代谢在成虫中大部分下调,而在幼虫中大部分上调;淀粉和糖代谢在成虫中大部分上调,但在幼虫中大部分下调;维生素在幼虫中大部分下调。qRT-PCR验证证明了转录组测序获得序列质量的可靠性,可作为后续试验的研究基础。这些转录组数据为进一步优化人工饲料提供了参考依据,促进人工饲料配方的改良。 展开更多
关键词 七星瓢虫 转录组测序 差异表达基因 代谢通路 实时荧光定量PCR
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