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艰难梭菌tcdA和tcdB基因绝对定量PCR方法的建立及应用
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作者 古文鹏 贾森泉 +5 位作者 周永明 尹建雯 赵世文 赵晓南 吴媛 伏晓庆 《中国抗生素杂志》 北大核心 2025年第2期137-143,共7页
目的建立基于SYBR染料法的能够精确定量艰难梭菌主要毒素tcdA和tcdB基因表达量的绝对定量PCR方法,并进行应用。方法以CD12038艰难梭菌参考菌株为研究对象,扩增tcdA和tcdB基因的部分片段,然后将二者克隆到pUC57质粒载体中进行测序鉴定。... 目的建立基于SYBR染料法的能够精确定量艰难梭菌主要毒素tcdA和tcdB基因表达量的绝对定量PCR方法,并进行应用。方法以CD12038艰难梭菌参考菌株为研究对象,扩增tcdA和tcdB基因的部分片段,然后将二者克隆到pUC57质粒载体中进行测序鉴定。采用梯度稀释的重组质粒为标准品,SYBR荧光染料法进行qPCR扩增,建立标准曲线。然后在4种主要的产毒性艰难梭菌流行参考菌株中验证菌株培养后tcdA和tcdB基因的拷贝数。结果本研究建立了能够精确定量产毒性艰难梭菌tcdA和tcdB基因拷贝数的绝对定量PCR方法,其中tcdA基因的线性范围为(2.71×10^(2)~2.71×10^(9))拷贝/μL,灵敏性为(324.70±33.42)拷贝/μL,批内变异系数(CV)为0.60%~1.12%,批间CV为0.57%~0.92%。tcdB基因的线性范围为(2.59×10^(2)~2.59×10^(9))拷贝/μL,灵敏性为(539.05±133.28)拷贝/μL,批内CV为0.37%~1.61%,批间CV为0.84%~1.76%。2个基因的溶解曲线均呈现单一峰值,特异性良好。对4种产毒性艰难梭菌参考菌株培养24 h后的tcdA和tcdB基因拷贝数研究结果显示,R20291(ST1/RT027)菌株的tcdA和tcdB基因表达水平最高,而其余3个菌株的表达水平较为相似。结论本研究建立了基于产毒性艰难梭菌tcdA和tcdB基因的绝对定量PCR方法,该方法具有线性范围广、灵敏性高、特异性和可重复性良好等特点,为后续艰难梭菌主要毒素基因的精确定量研究提供了技术支持。 展开更多
关键词 艰难梭菌 tcdA tcdb 绝对定量PCR
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中国艰难梭菌高分离株和欧洲流行高毒株tcdA、tcdB基因转录及其毒素的表达(英文)
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作者 李先平 李文革 +1 位作者 王晶 卢金星 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期1-6,共6页
目的研究和比较中国艰难梭菌A-B+高分离株BJ08和欧洲流行A+B+高毒株(BI/NAP1/027)UK1的tcdA、tcdB转录和毒素表达。方法每隔3h提取艰难梭菌和培养上清,用实时荧光定量PCR的方法测定各个时间段BJ08和UK1菌株tcdA、tcdB基因的表达;用ELIS... 目的研究和比较中国艰难梭菌A-B+高分离株BJ08和欧洲流行A+B+高毒株(BI/NAP1/027)UK1的tcdA、tcdB转录和毒素表达。方法每隔3h提取艰难梭菌和培养上清,用实时荧光定量PCR的方法测定各个时间段BJ08和UK1菌株tcdA、tcdB基因的表达;用ELISA的方法检测BJ08和UK1菌株各个时间段的细胞和培养上清液中A毒素、B毒素的含量。结果 BJ08的生长速率显著大于UK1;BJ08不表达A毒素,但是检测到tcdA基因的转录,tcdA基因表达量显著低于UK1;tcdB的表达以及B毒素在两种菌株的培养上清液中和声波处理的细胞内的差异都不大。结论中国艰难梭菌A-B+高分离株BJ08和欧洲流行A+B+高毒株UK1的B毒素的转录和表达没有明显差异,BJ08菌株在中国有爆发流行的可能。 展开更多
关键词 艰难梭菌 tcdA tcdb
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CRISPR靶向切割毒力因子tcdB基因抑制致病艰难梭菌生长 被引量:1
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作者 张大炜 夏云 +4 位作者 赵靳鑫 陈盈竹 邹家齐 严佳 杨蜜 《国际检验医学杂志》 CAS 2019年第24期3036-3040,共5页
目的应用CRISPR/Cas9系统对艰难梭菌主要毒力因子tcdB基因进行切割,达到特异性抑制致病艰难梭菌生长的效果。方法在线设计针对tcdB的sgRNA,分别将sgRNA与Cas9单独或共同作用于tcdB基因扩增产物,验证体外切割效能;分别将穿膜肽(CPP)-sgRN... 目的应用CRISPR/Cas9系统对艰难梭菌主要毒力因子tcdB基因进行切割,达到特异性抑制致病艰难梭菌生长的效果。方法在线设计针对tcdB的sgRNA,分别将sgRNA与Cas9单独或共同作用于tcdB基因扩增产物,验证体外切割效能;分别将穿膜肽(CPP)-sgRNA或单独的sgRNA与CPP-Cas9单独或共同作用于产毒艰难梭菌,通过监测菌液A值和菌落计数,观察对细菌生长的抑制效果。同样的方法处理肠道其他细菌,验证特异性。结果sgRNA和Cas9共同作用可把tcdB扩增产物有效切割,而单独加入sgRNA或Cas9均无切割作用;单独加入CPP-sgRNA、CPP-Cas9、CPP对细菌生长没有影响;CPP-sgRNA与CPP-Cas9共同作用,无细菌生长;单独sgRNA与CPP-Cas9共同作用,细菌生长轻度受抑。用同样的方法将CPP-sgRNA+CPP-Cas9处理肠道其他细菌后,菌液A值和菌落计数与空白对照无差别。结论建立的针对tcdB的sgRNA与Cas9混合可在体外高效切割tcdB基因,抑制细菌生长;CPP可提高sgRNA转染进入细菌的效率。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 艰难梭菌 tcdb基因 穿膜肽
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重组艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB对人体肠上皮细胞层功能的影响
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作者 张雍容 李杉 +3 位作者 杨忠 王菊芳 冯汉平 王小宁 《华东理工大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期161-166,共6页
利用Transwell小室体外建立人结肠细胞T84上皮细胞层,分析不同质量浓度重组艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB(1 000、100、10ng/mL)对上皮细胞层跨膜电阻(TER)的影响;通过免疫荧光染色分析TcdB对上皮细胞层结构的影响;运用荧光标记葡聚糖作为... 利用Transwell小室体外建立人结肠细胞T84上皮细胞层,分析不同质量浓度重组艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB(1 000、100、10ng/mL)对上皮细胞层跨膜电阻(TER)的影响;通过免疫荧光染色分析TcdB对上皮细胞层结构的影响;运用荧光标记葡聚糖作为指示剂,检测毒素作用后上皮细胞层的旁通路渗透情况;通过细胞毒性分析,检测上皮细胞层功能受损情况下,TcdB的跨膜渗透。结果发现:重组艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB能引起剂量依赖性单层上皮组织跨膜电阻降低和渗透性增加,在24h内质量浓度为1 000、100、10ng/mL的TcdB能导致上皮细胞层分别丧失100%、70%、50%电阻力,同时分别引起30%、20%、10%的葡聚糖渗透;上皮细胞层受损后,大分子毒素通过旁通路的非正常跨膜渗透也增加。共聚焦分析显示上皮细胞层的细胞间紧密连接结构受损。综上所述,艰难梭状芽孢杆菌毒素TcdB介导的体外培养人T84肠上皮细胞层功能损伤主要表现为电生理学功能异常,旁通路渗透性增加,细胞间紧密连接结构破坏。 展开更多
关键词 艰难梭状芽孢杆菌 毒素tcdb 上皮细胞层 跨膜电阻 渗透性
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艰难梭菌毒素A和B双重环介导等温扩增检测方法的建立及验证 被引量:1
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作者 席小燕 林玉兰 +2 位作者 卢金莹 陈惠权 彭凌 《中国生物制品学杂志》 2025年第1期67-72,79,共7页
目的建立快速检测艰难梭菌毒素A(Clostridium difficile toxin A,TcdA)和B(TcdB)的双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,为艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)感染的快速检测和毒素分型提供技术... 目的建立快速检测艰难梭菌毒素A(Clostridium difficile toxin A,TcdA)和B(TcdB)的双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,为艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)感染的快速检测和毒素分型提供技术支持。方法根据TcdA和TcdB基因的保守序列各设计1套LAMP引物,在同一体系内进行双重LAMP扩增,通过对反应体系和反应条件的优化,建立快速检测TcdA和TcdB的LAMP方法,对该方法进行特异性和灵敏度验证,并对LAMP扩增产物进行熔解曲线分析。用建立的方法对18份腹泻患者粪便样本进行检测。结果TcdA和TcdB均能进行较好扩增的双重LAMP反应条件为:Mg2+浓度6.8 mmol/L,dNTPs浓度1.2 mmol/L,扩增温度64℃。扩增结果可采用SYBR GreenⅠ染色完成初步检测,目标基因(菌)显示翠绿色荧光,6种其他常见肠道病原体(大肠埃希菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌、肉毒梭菌)无荧光;双重LAMP体系检测TcdA和TcdB的灵敏度分别为10~0和10~1个质粒/反应,通过分析熔解曲线的特征峰可判断CD菌株所含的确切目标毒素。18份腹泻患者粪便样本中有8份样本初步检测为阳性,经溶解曲线分析,均含TcdA和TcdB两种毒素。结论初步建立了TcdA和TcdB双重LAMP检测方法,该方法具有较好的灵敏度和特异性,可用于CD感染的快速检测,并可实现TcdA与TcdB的同时快速检测。 展开更多
关键词 艰难梭菌毒素A 艰难梭菌毒素B 双重环介导等温扩增技术 毒素分型
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临床分离艰难梭菌毒素携带特征研究 被引量:5
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作者 程颖 卢金星 +2 位作者 鄢盛恺 贾红兵 李文革 《疾病监测》 CAS 2009年第3期193-195,共3页
目的对医院细菌室送检粪便标本中分离出的艰难梭菌,进行毒素基因以及耐药基因的初步分析。方法将细菌室收集到的112份粪便标本,经选择性厌氧培养,谷氨酸脱氢酶(GDH)以及API 20A生化条鉴定后,分离出12株艰难梭菌,分别采用PCR的方法检测t... 目的对医院细菌室送检粪便标本中分离出的艰难梭菌,进行毒素基因以及耐药基因的初步分析。方法将细菌室收集到的112份粪便标本,经选择性厌氧培养,谷氨酸脱氢酶(GDH)以及API 20A生化条鉴定后,分离出12株艰难梭菌,分别采用PCR的方法检测tcdA和tcdB基因、二元毒素基因,克林霉素抗性基因(ermB)。结果12株艰难梭菌中8株为毒素基因阳性,其中tcdA+tcdB+为5株,占62.5%;tcdA-tcdB+为3株,占37.5%;二元毒素基因均为阴性;耐药基因ermB阳性为4株,占50%。结论艰难梭菌tcdA-tcdB+毒株所占比例增加,临床单独检测A毒素易造成漏检;艰难梭菌耐药现象值得关注。 展开更多
关键词 艰难梭菌 tcdA tcdb 二元毒素 ermB
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艰难梭菌引起抗感染免疫的主要致病因子及其基因功能的研究进展 被引量:4
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作者 曹波 李先平 程颖 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期357-360,共4页
艰难梭菌是医院感染性腹泻中最常见的病原菌之一,在过去10年中,由于ribotyping 027型等高毒菌株的出现,全球艰难梭菌感染相关性疾病发病率显著上升,已经成为欧美许多国家法定传染病必报的监测病原。致病艰难梭菌的毒力因子主要包括A毒素... 艰难梭菌是医院感染性腹泻中最常见的病原菌之一,在过去10年中,由于ribotyping 027型等高毒菌株的出现,全球艰难梭菌感染相关性疾病发病率显著上升,已经成为欧美许多国家法定传染病必报的监测病原。致病艰难梭菌的毒力因子主要包括A毒素和B毒素,刺激机体发生免疫应答。除外A、B毒素,少数艰难梭菌还产生二元毒素。本文对近年来艰难梭菌引起机体抗感染免疫的相关致病因子及其基因功能的最新研究进展进行了回顾和总结,并重点探讨了主要致病因子A毒素和B毒素结构功能及基因表达调控特征,包括构建A、B毒素分子模型,致病基因编码区多态性特征,以及负向调控因子tcdC的变异及影响,对未来疫苗靶位点的筛选以及艰难梭菌致病机制中信号转导研究具有指导意义。 展开更多
关键词 艰难梭菌 抗感染免疫 A毒素 B毒素 tcdA tcdb 二元毒素
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艰难梭菌实验室快速鉴定方法检验效能的比较 被引量:7
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作者 李春辉 刘思娣 +2 位作者 唐升宏 段菊屏 吴安华 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2015年第1期98-101,共4页
目的评价3种艰难梭菌实验室鉴定方法的快速性及准确性。方法 2013年6月至2013年11月,收集136名ICU患者共248份标本进行24 h、48 h厌氧培养,并进行鉴定,同时对大便标本提取DNA进行tcd B毒素基因检测。以48 h培养结果为参考标准,评价24小... 目的评价3种艰难梭菌实验室鉴定方法的快速性及准确性。方法 2013年6月至2013年11月,收集136名ICU患者共248份标本进行24 h、48 h厌氧培养,并进行鉴定,同时对大便标本提取DNA进行tcd B毒素基因检测。以48 h培养结果为参考标准,评价24小时培养法和PCR扩增tcd B基因法鉴定艰难梭菌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果 136名ICU发生腹泻的患者中,11名患者共有12份标本48 h培养为艰难梭菌阳性,艰难梭菌感染率为8.09%(11/136),标本阳性率为4.84%(12/248)。24小时培养法及PCR扩增tcd B基因法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为75.00%、100%、100%、98.74%和83.33%、99.15%、83.33%、99.15%。结论提取大便DNA tcd B毒素基因是最快速、灵敏度和特异度均较高的方法;48小时培养法时间相对较长,但稳定可靠,并可以保留菌株进行后续试验;24小时培养法,时间短、简便但会漏诊某些阳性病例。 展开更多
关键词 艰难梭菌 艰难梭菌相关性腹泻 艰难梭菌感染 tcdb 快速诊断
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使用Real-Time PCR粪便中检测艰难梭状芽孢杆菌 被引量:2
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作者 史跃杰 杨玉林 王海颖 《中国卫生检验杂志》 CAS 2008年第4期653-654,共2页
目的:探讨Real-Time PCR对粪便检测艰难梭菌的可行性。方法:以组织培养细胞毒素试验为标准,参考艰难梭菌的毒素A/B基因相应的引物和分子信标探针,对标准菌株和粪便提取的DNA实行Real-Time PCR扩增。结果:Real-Time PCR的敏感度为96.9%;... 目的:探讨Real-Time PCR对粪便检测艰难梭菌的可行性。方法:以组织培养细胞毒素试验为标准,参考艰难梭菌的毒素A/B基因相应的引物和分子信标探针,对标准菌株和粪便提取的DNA实行Real-Time PCR扩增。结果:Real-Time PCR的敏感度为96.9%;特异性为100%;阳性预测值为100%;阴性预测值为98.3%。结论:Real-TimePCR与传统诊断方法相比具有快速、敏感、特异等优点,可以提高艰难梭菌的检测水平。 展开更多
关键词 REAL-TIME PCR 艰难梭状芽孢杆菌 tcdA tcdb
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中国部分地区艰难梭菌PCR-核糖体分型及毒素基因多态性研究 被引量:10
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作者 王晶 李春辉 +6 位作者 杜鹏程 曹波 陈晨 卢金星 李中杰 余宏杰 程颖 《中国感染控制杂志》 CAS 2014年第1期1-7,共7页
目的了解中国部分地区艰难梭菌聚合酶链反应(PCR)-核糖体型别分布及其A、B毒素基因多态性,为建立适宜中国的艰难梭菌分子检测和分子分型技术提供基础数据,同时在基因水平上为艰难梭菌感染导致的复杂临床表现提供依据。方法对中国3个城市... 目的了解中国部分地区艰难梭菌聚合酶链反应(PCR)-核糖体型别分布及其A、B毒素基因多态性,为建立适宜中国的艰难梭菌分子检测和分子分型技术提供基础数据,同时在基因水平上为艰难梭菌感染导致的复杂临床表现提供依据。方法对中国3个城市(北京、广州、济南)分离的64株艰难梭菌临床株进行PCR-核糖体分型,并对不同型别的26株代表菌株的A、B毒素基因进行扩增测序。结果 64株艰难梭菌中,毒素基因型以A+B+型(45株,70.31%)为主,A-B+型19株(29.69%)。共存在9种PCR-核糖体型别,以017型(21株,32.81%)为主要型别,其次为001型(13株,20.31%)、012型(11株,17.19%)。A-B+菌株中,14株(73.68%)是017型,1株是001型。A、B毒素基因呈现一定的多态性,其中有7种A毒素序列型别(TSTA),6种B毒素序列型别(TSTB),8种A、B毒素序列型别组合(TSTG)。结论我国部分地区的艰难梭菌可能以PCR-核糖体017型为主,A、B毒素基因在菌株间存在多态性,且核糖体型别与毒素基因多态性间存在相对应的关联。应进一步扩大菌株数量和范围,探寻适合我国的分子检测和分子分型方法,从而帮助医院更好地预防和控制艰难梭菌感染。 展开更多
关键词 艰难梭菌 艰难梭状芽孢杆菌 假膜性肠炎 核糖体分型 A毒素基因 B毒素基因 抗生素相关腹泻 医院感染
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Occurrence of Toxigenic Clostridium difficile in Louisiana Oysters (<i>Crassostrea virginica</i>) and Environmental Waters 被引量:1
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作者 Naim Montazeri Da Liu Marlene E. Janes 《Food and Nutrition Sciences》 2015年第11期1065-1070,共6页
Clostridium difficile infection (CDI) was generally considered as a hospital-associated disease;however, recent community-acquired CDI has raised the concerns regarding the transmission of the pathogen through environ... Clostridium difficile infection (CDI) was generally considered as a hospital-associated disease;however, recent community-acquired CDI has raised the concerns regarding the transmission of the pathogen through environmental sources. Limited data are available regarding the presence of C. difficile in food and water. In this study, oysters (Crassostrea virginica) and the harvest water collected from the commercial harvesting areas along the Louisiana Gulf Coast as well as the influent and effluent of a municipal treatment plant in New Orleans, LA were analyzed for toxigenic C. difficile. The bacterium was isolated from 47.37% (9/19) of oysters and 37.5% (3/8) of harvest water samples. Toxigenic C. difficile were also detected in all the wastewater influent and effluent samples. All the isolates harbored the gene tcdB encoding the virulence factor toxin B. Further PCR-ribotyping showed that the C. difficile isolated from the oysters and harvest water differed from the wastewater isolates. However, similar ribotypes were found in oysters and the surrounding harvest water. We found that oysters growing in contaminated water could bioaccumulate toxigenic C. difficile and pose a health risks by serving as a vehicle for the transmission of the pathogen to humans. 展开更多
关键词 Clostridium DIFFICILE tcdb Gene Oyster Wastewater Treatment Plant INFLUENT Effluent
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Clostridium difficile Toxin B: Insights into Its Target Genes
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作者 Junyi Hu Yunjie Shan Huan Yang 《Open Journal of Applied Sciences》 2022年第3期368-386,共19页
Clostridium difficile is a grossly Gram-positive anaerobic bacterium that has been a key factor in inducing imbalances in the gut microbiota in recent years, leading to intestinal-associated inflammation. The main pat... Clostridium difficile is a grossly Gram-positive anaerobic bacterium that has been a key factor in inducing imbalances in the gut microbiota in recent years, leading to intestinal-associated inflammation. The main pathogenic toxins of Clostridium difficile are toxin A (TcdA) and toxin B (TcdB). TcdB is the main pathogenic factor of Clostridium difficile infection. This review revealed the pathogenic mechanism of Clostridium difficile toxin B, expounded the impact of Clostridium difficile on the intestinal system, and predicted the genes on which TcdB may act, thereby providing a new therapeutic target for Clostridium difficile infection, offering theoretical basis and new strategies for clinical prevention and control. 展开更多
关键词 Clostridium difficile Infection tcdb Gene Regulation
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Fight or flee,a vital choice for Clostridioides difficile 被引量:1
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作者 Ji Zeng Sshuying Fang +3 位作者 Jinquan Guo Min Dong Guo-Bao Tian Liang Tao 《mLife》 CSCD 2024年第1期14-20,共7页
Clostridioides difficile is a leading cause of healthcare-associated infections,causing billions of economic losses every year.Its symptoms range from mild diarrhea to life-threatening damage to the colon.Transmission... Clostridioides difficile is a leading cause of healthcare-associated infections,causing billions of economic losses every year.Its symptoms range from mild diarrhea to life-threatening damage to the colon.Transmission and recurrence of c.difficile infection(CDl)are mediated by the metabolically dormant spores,while the virulence of C.difficile is mainly due to the two large clostridial toxins,TcdA and TcdB.Producing toxins or forming spores are two different strategies for C.difficile to cope with harsh environmental conditions.It is of great significance to understand the molecular mechanisms for C.difficile to skew to either of the cellular processes.Here,we summarize the current understanding of the regulation and connections between toxin production and sporulation in C.difficile and further discuss the potential solutions for yet-to-be-answered questions. 展开更多
关键词 C.difficile SPORULATION TcdA tcdb toxin production
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