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Tn5转座子插入α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA对香蕉细菌性软腐病菌毒力的影响
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作者 蒋尚伯 孙大元 +5 位作者 沈会芳 蒲小明 刘平平 林壁润 杨祁云 张景欣 《微生物学通报》 北大核心 2025年第5期2107-2122,共16页
【背景】玉米迪克氏菌(Dickeya zeae)可引起作物细菌性软腐病,严重威胁香蕉、水稻等重要作物的生产安全。本研究在香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS1的Tn5突变体库中筛选到4个毒力显著减弱的突变体。【目的】进一步鉴定Tn5转座子插入突变体... 【背景】玉米迪克氏菌(Dickeya zeae)可引起作物细菌性软腐病,严重威胁香蕉、水稻等重要作物的生产安全。本研究在香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS1的Tn5突变体库中筛选到4个毒力显著减弱的突变体。【目的】进一步鉴定Tn5转座子插入突变体的具体基因位点,并明确该基因对细菌毒力的影响。【方法】通过热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,TAIL-PCR)鉴定转座子插入位点;利用同源重组方法构建插入基因的敲除突变体及其互补菌株,并比较它们与野生型在细菌生长、相关代谢产物活性、植物细胞壁降解酶(plant cell wall-degrading enzymes,PCWDEs)分泌、运动性及毒力等方面的差异。【结果】TAIL-PCR鉴定出4个突变体的转座子插入位点均是位于α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,α-KGDH)基因suc A内,该基因编码三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环过程的关键酶组分。基因敲除突变体Δsuc A在细菌生长曲线上受到一定程度的影响,但是其α-KGDH活性完全丧失。基因突变可显著减少PCWDEs的分泌并降低pel B和pel C等基因的转录表达,而不影响细菌的涌动、游动能力。对比野生型,Δsuc A在烟叶上产生的过敏性反应明显减弱,对香蕉幼苗的致病性也显著降低。回补菌株则可将上述细菌表型均恢复至与野生型接近的水平。【结论】本研究利用Tn5转座子插入突变鉴定到可影响细菌毒力的TCA关键酶基因suc A,该基因的突变可减弱重要毒力因子PCWDEs的分泌,但不影响细菌运动性。 展开更多
关键词 香蕉细菌性软腐病菌 Tn5转座子 suca 植物细胞壁降解酶 细菌毒力
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sucA缺失型大肠杆菌菌株的构建与发酵条件优化
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作者 林凡 张震宇 +1 位作者 孙付保 于林 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期830-837,共8页
反式-4-羟脯氨酸在多领域具有重要应用价值。为了进一步提高反式-4-羟脯氨酸的产量,在已构建好的E. coli BL21(DE3)△putA的基础上,敲除基因sucA的同时插入密码子优化后的反式-4-羟化酶基因(hyp),并将构建好的质粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb... 反式-4-羟脯氨酸在多领域具有重要应用价值。为了进一步提高反式-4-羟脯氨酸的产量,在已构建好的E. coli BL21(DE3)△putA的基础上,敲除基因sucA的同时插入密码子优化后的反式-4-羟化酶基因(hyp),并将构建好的质粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb导入该基因敲除菌株中。之后在摇瓶水平上,单因素优化发酵条件与发酵培养基的组分,并通过正交实验进一步确定敲除菌株的培养条件。结果表明:与含有同样质粒的原菌和两种单敲除菌E. coli BL21(DE3)△sucA、E. coli BL21(DE3)△putA相比,E. coli BL21(DE3)△putA△sucA双敲除菌具有最高的全细胞酶活,大约是原菌的2.6倍;在摇瓶水平上,发酵条件优化后,以100 mmol/L的L-脯氨酸为底物进行发酵,12 h后可得到1.08 g/L的羟脯氨酸,是优化前的3.87倍。 展开更多
关键词 反式-4-羟脯氨酸 suca 透明颤菌血红蛋白 基因敲除 重组大肠杆菌 全细胞酶活
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