文摘目的:通过单细胞RNA测序阐明免疫细胞与纤维环细胞相互作用的时空动态特征。方法:实验采用12只8周龄雄性Sprague Dawley大鼠,并随机分为3组:正常对照组(NT)、针刺退变7d组(IDD7)及针刺退变14d组(IDD14),每组三只大鼠的椎间盘组织合并作为一个scRNA-seq样本(即NT/IDD7/IDD14各1个样本,n=3大鼠/组)。椎间盘组织经过混合的多种胶原酶消化后,并未进行流式分选,直接利用BD Rhapsody平台,对3个样本开展了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。通过以下流程解析细胞动态变化:采用Seurat对原始计数矩阵进行质量控制、标准化及批次校正(Harmony算法整合),保留基因表达均值用于后续分析。通过FindVariableFeatures筛选2000个高变基因,经主成分分析(principal component analysis,PCA)降维后,采用Louvain聚类算法(分辨率0.2)对细胞进行分群,并结合SingleR工具进行细胞类型注释,获取各亚群的标志基因。对比正常对照组(NT)、针刺退变7d组(IDD7)及针刺退变14d组(IDD14)间的差异表达基因(筛选阈值:|logFC|>0.5,P<0.05)。使用基于R语言开发的生物信息学软件包ClusterProfiler与enrichR软件分别对差异基因进行GO(gene ontology)生物学过程与KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析(P<0.05,基因数≥2),筛选显著相关通路。基于Monocle3构建伪时间轨迹,将整合数据转换为cell_data_set对象,经UMAP(uniform manifold approximation and projection)降维与Louvain聚类后,利用learn_graph与order_cells函数揭示细胞状态演化路径。运用CellChat与CellPhoneDB分析配体-受体相互作用,计算细胞间通讯概率,可视化关键信号通路(如细胞因子、生长因子)在NT与IDD组间的动态变化。采用免疫荧光技术对CD68(巨噬细胞标记物)、SPP1、CD44等蛋白的共定位表达进行定量分析。结果:单细胞数据鉴定出9个主要细胞群:纤维环细胞(NP)、纤维环细胞(AF)、巨噬细胞(Mφ)、单核细胞、中性粒细胞、T细胞、成纤维细胞、内皮细胞及平滑肌细胞。74个基因持续差异表达,主要与免疫细胞趋化相关。并系统解析了纤维环细胞的时序性分子变化。纤维环细胞存在修复型(Fibro-1/3)与耗竭型(Fibro-2)两极分化,为精准干预提供靶群依据。拟时序T1期可能(对应IDD7d)是应激保护向纤维化转化的关键节点,为阻断不可逆损伤提供治疗窗口期。细胞互作动态演变:纤维环亚群中耗竭型Fibro-2与巨噬细胞的互作数最多,SPP1信号轴由Fibro-2主导发送,Mφ-3为主要接收者,该通路可能驱动纤维环细胞向促纤维化表型转化,提示其可能参与基质破坏和纤维化重塑进程。结论:纤维环细胞可能通过SPP1-CD44信号轴增强与巨噬细胞的相互作用,进而激活炎症反应并加速基质降解。这一发现揭示了椎间盘退变过程中的关键细胞受体-配体对,为IDD的精准干预提供了新的潜在治疗靶点。
