内含肽介导的Split-Cre系统的构建 被引量：1

1

作者 敖艺菲 张琪 +2 位作者 陈昱僖 黄军就 文锦坤 《生物工程学报》 北大核心 2025年第4期1490-1499,共10页

Split-Cre系统是指被拆分为无活性的N端和C端这2个片段的Cre酶在一定条件下重组为有酶活性的全长Cre的基因工程工具。该系统常结合LoxP元件使用,近年来在多基因操纵、多基因活性标记以及神经环路示踪等方面有着重要的应用。为了开发更... Split-Cre系统是指被拆分为无活性的N端和C端这2个片段的Cre酶在一定条件下重组为有酶活性的全长Cre的基因工程工具。该系统常结合LoxP元件使用,近年来在多基因操纵、多基因活性标记以及神经环路示踪等方面有着重要的应用。为了开发更高效的Split-Cre系统,本研究利用海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus,Rma)内含肽对Cre进行拆分,在“红绿灯”报告细胞系中筛选出了能够高效介导Cre酶重组的S102拆分位点,并且通过双腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)将S102 Split-Cre系统递送至小鼠体内,证明了Rma内含肽介导的S102 Split-Cre系统在小鼠体内同样具有高效的活性。本研究为Split-Cre的基础和应用研究提供了可靠的参考。 展开更多

关键词 Cre酶 Split-Cre系统 海洋红嗜热盐菌内含肽 断裂内含肽

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高剪接活性断裂蛋白质内含子的体内切割 被引量：1

2

作者 林瑛 周倩 +1 位作者 荀启静 孟清 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期97-101,共5页

蛋白质内含子介导的断裂(切割)反应被用于蛋白质纯化、连接和环化等,但目前仍存在断裂效率低、断裂反应的不可控、产物复杂等问题。蛋白质内含子的定点突变可导致其N端或C端断裂。其末位氨基酸突变则剪接反应第3步天冬酰胺环化无法进行... 蛋白质内含子介导的断裂(切割)反应被用于蛋白质纯化、连接和环化等,但目前仍存在断裂效率低、断裂反应的不可控、产物复杂等问题。蛋白质内含子的定点突变可导致其N端或C端断裂。其末位氨基酸突变则剪接反应第3步天冬酰胺环化无法进行,发生N端断裂;其首位氨基酸发生突变则剪接反应第一步酰基重排及其后续步骤均无法进行,而天冬酰胺环化仍可进行,发生C端断裂。利用已获得的高剪接活性的S1和S11型断裂蛋白质内含子Ssp GyrB,分别将其参与剪接反应的首位半胱氨酸或末位天冬酰胺突变为丙氨酸,构建能够发生一端断裂的断裂蛋白质内含子。研究结果表明,突变后断裂蛋白质内含子的剪接反应几乎不发生,其断裂活性有不同程度的提高,获得了在大肠杆菌体内具有较高效断裂活性的断裂蛋白质内含子。这将为进一步研究其体外可控性剪接、构建高效的蛋白纯化系统和深入研究蛋白质内含子的剪接机制提供基础。 展开更多

关键词 蛋白质内含子 断裂蛋白质内含子 定点突变

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TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能 被引量：1

3

作者 朱甫祥 宫贤弟 +3 位作者 刘泽隆 杨树德 屈慧鸽 迟晓艳 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1710-1716,共7页

CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(... CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(TMD2)前的Glu838密码子后将其cDNA断裂为N端和C端两部分,与具有蛋白质反式剪接作用的split Ssp DnaB intein编码序列融合,分别插入到载体pEGFP-N1和pEYFP-N1,构建一对真核表达载体pEGFP-NInt和pEYFP-IntC。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),瞬时表达实验用Western blotting观察CFTR蛋白质的连接,并用膜片钳技术记录Cl-通道电流。结果显示,基因共转染细胞呈现完整的CFTR蛋白条带,膜片钳记录到全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术可用于双载体共转移CFTR基因,为CF基因治疗应用双腺相关病毒载体(AAV)转运CFTR基因,克服AAV的容量限制提供了依据。 展开更多

关键词 CFTR Cl-通道 SPLIT SSP DNAB INTEIN 蛋白质反式剪接 双载体基因转移

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基因拆分技术的理论基础及其在限控转基因飘流中的应用

4

作者 董玉凤 王旭静 +1 位作者 唐巧玲 王志兴 《生物技术进展》 2014年第2期85-89,共5页

随着转基因作物种植面积的逐年增长,转基因安全性问题引起越来越多的争论,其中花粉扩散引起的转基因向近缘种飘流的问题是人们关注的焦点问题之一。基因拆分技术为采用生物学措施控制转基因飘流提供了新的思路和途径。基因拆分技术是基... 随着转基因作物种植面积的逐年增长,转基因安全性问题引起越来越多的争论,其中花粉扩散引起的转基因向近缘种飘流的问题是人们关注的焦点问题之一。基因拆分技术为采用生物学措施控制转基因飘流提供了新的思路和途径。基因拆分技术是基于内含肽intein介导的蛋白剪接功能而建立起来的。目前已在拟南芥、烟草、小麦等作物中证明多个基因拆分后能重新组装成有活性的功能蛋白,这为通过基因拆分技术控制转基因飘流提供了理论基础和实验支撑。本文对基因拆分技术的理论基础及其用于限控转基因飘流方面的研究进展进行了综述。 展开更多

关键词 基因拆分 内含肽 基因飘流

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DnaB Split Intein高表达载体及其介导的环肽库构建

5

作者 蔺增曦 王胜兰 +1 位作者 杨秀山 杨克迁 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1924-1930,共7页

以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的... 以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的剪接反应,生成环化的DnaB-N蛋白。将合成的包含随机编码5肽的大小为115 bp的片段插入质粒pEV DnaB-N位置,转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽(含5个随机氨基酸和1个Cys)的包含约103个克隆的表达载体pEV-IS库。随机挑取20个克隆,测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列;挑取其中9个克隆进行表达,结果表明可产生大量的融合蛋白,90%的融合蛋白在16oC表达20 h后发生体内剪接。将在30oC表达3 h的融合蛋白用His柱进行纯化,通过MALDI-TOF质谱检测到了目的环肽分子量。 展开更多

关键词 SPLIT SSP DNAB mini—intein 环肽库 自我剪接

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N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子的构建

6

作者 李佳 孟清 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期30-34,共5页

在体内或体外对目标蛋白进行标记或修饰,是研究蛋白质结构和功能的重要手段之一。目前的蛋白质修饰手段存在很多不足之处,尤其会对蛋白质的结构和功能产生影响。为了避免或降低这些影响,借助断裂蛋白质内含子反式剪接技术进行修饰是一... 在体内或体外对目标蛋白进行标记或修饰,是研究蛋白质结构和功能的重要手段之一。目前的蛋白质修饰手段存在很多不足之处,尤其会对蛋白质的结构和功能产生影响。为了避免或降低这些影响,借助断裂蛋白质内含子反式剪接技术进行修饰是一个有效可行的方法。可是因为天然存在的断裂蛋白质非常少,使该技术的应用受到了限制。因此通过数据库筛选、定点突变、WesternBlot等技术成功获得了2个有活性的体内断裂蛋白质内含子和1个有活性的N端无半胱氨酸的断裂蛋白质内含子。为后续可控的和特异的蛋白N端标记及应用提供了可行的生物学工具。 展开更多

关键词 N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子 蛋白质N端标记 蛋白质剪接

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内含肽在构建亲和纯化系统中的应用 被引量：4

7

作者 王姝婧 陈丙友 +2 位作者 王玉君 冯利利 夏海锋 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1175-1184,共10页

内含肽是前体未成熟蛋白中的一段具有自我剪接功能的多肽链,在蛋白质纯化、蛋白质连接、环肽制备、蛋白标记以及生物传感器等方面广泛应用。本文综述了内含肽应用于蛋白质亲和纯化的发展历程,分别对层析型和非层析型内含肽纯化体系进行... 内含肽是前体未成熟蛋白中的一段具有自我剪接功能的多肽链,在蛋白质纯化、蛋白质连接、环肽制备、蛋白标记以及生物传感器等方面广泛应用。本文综述了内含肽应用于蛋白质亲和纯化的发展历程,分别对层析型和非层析型内含肽纯化体系进行了分析和讨论,并总结了对控制内含肽断裂反应所进行的研究,为进一步改善内含肽介导蛋白质纯化提供依据和线索。 展开更多

关键词 连续型内含肽 断裂内含肽 亲和纯化系统 断裂反应

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断裂蛋白质内含子的剪接机制、起源和进化 被引量：3

8

作者 邵爱云 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期512-521,共10页

蛋白质内含子(intein)是具有自我催化活性的蛋白质.翻译后,通过蛋白质剪接从蛋白质前体中去掉,并以肽键连接两侧蛋白质外显子(extein)形成成熟蛋白质.断裂蛋白质内含子(splitintein)在蛋白质内含子中部区域特定位点发生断裂,形成N端片段... 蛋白质内含子(intein)是具有自我催化活性的蛋白质.翻译后,通过蛋白质剪接从蛋白质前体中去掉,并以肽键连接两侧蛋白质外显子(extein)形成成熟蛋白质.断裂蛋白质内含子(splitintein)在蛋白质内含子中部区域特定位点发生断裂,形成N端片段和C端片段,分别由基因组上相距较远的两个基因编码.现在已知,它仅分布于蓝细菌和古细菌中.断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段通过非共价键(如静电作用)相互识别,重建催化活性中心,介导蛋白质反式剪接.断裂蛋白质内含子的发现进一步深化了人们对基因表达和蛋白质翻译后成熟过程复杂性的认识,而且它在蛋白质工程、蛋白质药物开发和蛋白质结构与功能研究等方面有非常广泛的应用.本文试图综述断裂蛋白质内含子的分布、结构特征和剪接机制,并分析其可能的起源和进化途径. 展开更多

关键词 蛋白质内含子 断裂蛋白质内含子 等位蛋白质内含子 蛋白质反式剪接 起源 进化

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PRP8蛋白质反式剪接系统的建立 被引量：5

9

作者 胡芳 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期158-162,共5页

真菌病原体Cryptococcus neoformans AD血清型剪接体蛋白PRP8蛋白质内含子是目前发现的第2个存在于真核生物体核基因组中的蛋白质内含子.它的宿主基因prp8编码的PRP8蛋白作为剪接体的1个组分,是1个高度保守的mRNA剪接蛋白.将组氨酸标签... 真菌病原体Cryptococcus neoformans AD血清型剪接体蛋白PRP8蛋白质内含子是目前发现的第2个存在于真核生物体核基因组中的蛋白质内含子.它的宿主基因prp8编码的PRP8蛋白作为剪接体的1个组分,是1个高度保守的mRNA剪接蛋白.将组氨酸标签插入克隆自真菌病原体Cryptococcus neoformans AD血清型的PRP8蛋白质内含子中,并将该蛋白质内含子进行人工断裂,获得断裂蛋白质内含子,在大肠杆菌中鉴定其剪接活性.研究结果表明:所获得的改造型蛋白质内含子均表现出高效的剪接活性.利用此Cryptococcus neoformans AD血清型PRP8断裂蛋白质内含子,成功构建了蛋白质反式剪接系统.这一反式剪接系统可用于其他蛋白质的连接与合成,有望成为蛋白质工程中的一种有用工具. 展开更多

关键词 蛋白质内含子 断裂蛋白质内含子 蛋白质反式剪接系统

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基于GEM展示技术内含肽介导的犬α干扰素快速纯化系统的建立 被引量：1

10

作者 仝晴晴 杨利 +5 位作者 乔绪稳 陈瑾 张元鹏 郑其升 牛家强 侯继波 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第3期9-15,共7页

本研究分别构建含有断裂型内含肽(inteins)C端与犬α干扰素融合基因(C*-CaIFN-α)、断裂型内含肽N端与锚钩蛋白(protein anchor,PA)融合基因(NC1A-PA3)的重组表达质粒,利用IPTG诱导表达。通过GEM颗粒(gam-positive baterial enhancermat... 本研究分别构建含有断裂型内含肽(inteins)C端与犬α干扰素融合基因(C*-CaIFN-α)、断裂型内含肽N端与锚钩蛋白(protein anchor,PA)融合基因(NC1A-PA3)的重组表达质粒,利用IPTG诱导表达。通过GEM颗粒(gam-positive baterial enhancermatrixparticles)与PA3之间的特异性结合,将NC1A-PA3蛋白捕获到GEM颗粒上,再利用内含肽的N端与C端的结合,获得GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α。在DTT或EDTA存在情况下,内含肽C末端自我剪切,获得纯化的犬α干扰素重组蛋白CaIFN-α。通过微量细胞病变抑制方法测定CaIFN-α蛋白的活性。结果表明,两种重组蛋白均有可溶形式表达,GEM/inteins纯化系统效果良好;纯化的犬α干扰素CaIFN-α对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的抗病毒活性为3.0×106U/mL。本研究建立的基于GEM展示平台的蛋白纯化系统,将非层析标签与断裂内含肽系统相结合,为快速有效地纯化重组蛋白提供了一种方法。 展开更多

关键词 断裂型内含肽 GEM C末端剪切 纯化

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应用突变的断裂蛋白质内含子标记蛋白质N端 被引量：1

11

作者 戴旭东 李佳 +1 位作者 刘相钦 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期508-515,共8页

蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利... 蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利用新型断裂蛋白质内含子对蛋白质进行N端标记的新方法.在这个方法中,通过简单的重组表达、标记和纯化得到带有荧光基团的小肽,经过蛋白质反式剪接,荧光基团被标记到蛋白质的N端.初步研究结果显示,标记效率可达到12%. 展开更多

关键词 断裂蛋白质内含子 蛋白质剪接 N端标记 荧光基团

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利用ELP-Intein系统在大肠杆菌中生产抗菌肽DLP4 被引量：2

12

作者 姜宇 李秀 林瑛 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期2365-2376,共12页

DLP4 (defensin-like peptide 4)是一种新型昆虫防御素抗菌肽,对革兰氏阳性细菌具有强大的抗菌活性而且不易产生抗药性。本研究利用类弹性蛋白(elastin-like polypeptide, ELP)的相变特性和蛋白质内含子(intein, I)的C端断裂系统,通过... DLP4 (defensin-like peptide 4)是一种新型昆虫防御素抗菌肽,对革兰氏阳性细菌具有强大的抗菌活性而且不易产生抗药性。本研究利用类弹性蛋白(elastin-like polypeptide, ELP)的相变特性和蛋白质内含子(intein, I)的C端断裂系统,通过构建重组表达质粒pET-ELP-I-DLP4,以大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主细胞,诱导表达后的重组蛋白通过简单的离心、pH和温度转变进行纯化得到DLP4。研究中发现,在表达纯化过程中蛋白质内含子发生了C端提前断裂。为了解决这一问题,将其断裂为N端片段(I0;)和C端片段(I0;)后,分别与ELP或DLP4融合,构建了pET-ELP-I0;和pET-ELP-I0;-DLP4两种重组表达质粒。分别在大肠杆菌中诱导表达,将表达后的菌液混合,使蛋白质内含子恢复C端断裂活性,最终得到的DLP4的得率约为1.49 mg/L。抑菌试验证明纯化的DLP4表现出预期活性,这为DLP4在原核系统中的表达纯化提供了有效途径。 展开更多

关键词 抗菌肽 ELP标签 蛋白质内含子 断裂蛋白质内含子 抑菌活性

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断裂内含肽介导的蛋白纯化系统的构建 被引量：1

13

作者 王玉君 王姝婧 +2 位作者 杜夜星 冯利利 夏海锋 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期135-143,共9页

以Npu DnaE(Nostoc punctiforme)内含肽为研究对象,使用分子生物学方法对内含肽的N端结构(IN)和C端结构(IC)进行改造,构建了以IN为亲和配基的亲和层析介质和以IC为自断裂亲和标签的融合蛋白表达体系,形成了由断裂内含肽介导的新型蛋白... 以Npu DnaE(Nostoc punctiforme)内含肽为研究对象,使用分子生物学方法对内含肽的N端结构(IN)和C端结构(IC)进行改造,构建了以IN为亲和配基的亲和层析介质和以IC为自断裂亲和标签的融合蛋白表达体系,形成了由断裂内含肽介导的新型蛋白纯化系统。通过构建3种IN亲和配基片段以及2种IC-GFP融合蛋白片段,研究了空间位阻对融合蛋白断裂速率的影响;通过6种组合的体外断裂及Zn^2+抑制试验,找到了最佳的断裂组合以及新的Zn^2+结合位点。利用N3亲和配基片段C末端的Cys,制备了IN亲和层析介质并对其纯化效果进行了研究,成功获得高纯度GFP蛋白。 展开更多

关键词 断裂内含肽 自我断裂 亲和层析介质 空间位阻 克隆表达 蛋白纯化

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Split Inteins介导的多肽链两端标记

14

作者 张晓玲 戴旭东 +1 位作者 林瑛 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期535-542,共8页

多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面.但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求.本文以Diub(ub... 多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面.但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求.本文以Diub(ubiquitin dimer)蛋白为研究对象,借助S1和S11型2种不同的断裂蛋白质内含子(split inteins)的蛋白质反式剪接,将含有不同荧光基团的两种小肽成功剪接至靶蛋白的两端,最终达到对靶蛋白的末端标记目的. 展开更多

关键词 断裂蛋白质内含子 蛋白质反式剪接 N端和C端标记 荧光基团

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新型T+1断裂蛋白质内含子的构建

15

作者 王瑾 林瑛 +1 位作者 郑言成 孟清 《东华大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期50-54,共5页

首次从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋白质内含子(TerSnf2)构建出两类T+1型断裂蛋白质内含子:Snf-S0和Snf-S1,通过蛋白印迹法测定Snf-S0和Snf-S1介导的蛋白质反式剪接效率分别达到53.5%和33.3%;当这两类断裂蛋白质内含子C端外显子... 首次从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋白质内含子(TerSnf2)构建出两类T+1型断裂蛋白质内含子:Snf-S0和Snf-S1,通过蛋白印迹法测定Snf-S0和Snf-S1介导的蛋白质反式剪接效率分别达到53.5%和33.3%;当这两类断裂蛋白质内含子C端外显子分别为半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)时均具有剪接活性.所获的两类具有剪接活性的T+1型断裂蛋白质内含子具备一定的插入位点通用性,这一特点为蛋白质反式剪接技术在蛋白质工程领域广泛应用提供了新的契机. 展开更多

关键词 断裂蛋白质内含子 蛋白质反式剪接 TER Snf2

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新型断裂内含肽介导的可控性C端断裂(英文)

16

作者 齐兴梅 林瑛 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期956-960,共5页

内含肽介导的蛋白质断裂被广泛地应用于蛋白质纯化、连接和环化.但目前的方法都是用传统的连续的内含肽来介导蛋白质断裂反应,因而往往存在自发性断裂、产率低等问题.本实验选择3个S1型新型断裂内含肽Ter ThyX、Ssp GryB和Rma DnaB来实... 内含肽介导的蛋白质断裂被广泛地应用于蛋白质纯化、连接和环化.但目前的方法都是用传统的连续的内含肽来介导蛋白质断裂反应,因而往往存在自发性断裂、产率低等问题.本实验选择3个S1型新型断裂内含肽Ter ThyX、Ssp GryB和Rma DnaB来实现蛋白质断裂反应的可控性.在可控性C端断裂反应中,S1型断裂内含肽的C端片段(IC)与硫氧还蛋白(T)融合作为前体蛋白,加入化学合成的Ssp DnaB S1型断裂内含肽的N端小肽与二硫苏糖醇(DTT)共同诱导C端断裂反应.结果表明,该小肽可以诱导这3个不同的S1型断裂内含肽的前体蛋白发生C端断裂反应.该方法为利用内含肽C端断裂介导的蛋白质纯化提供了更多的选择,并为内含肽的结构与功能的关系研究提供了有用的线索. 展开更多

关键词 内含肽 断裂内含肽 蛋白质剪接 可控性断裂

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基因工程表达内含肽介导的抗菌肽(MME)及其酰胺化 被引量：1

17

作者 叶若柏 吴珍红 缪晓青 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1265-1270,共6页

【目的】探讨在巯乙基磺酸钠(MESNa)与碳酸氢铵(NH4HCO3)存在下,对在大肠杆菌上表达的重组融合蛋白中内含肽(Intein)用硫醇(DTT)进行自剪切,促使抗菌肽(MME)碳末端实现酰胺化。【方法】构建用大肠杆菌表达内含肽介导的MME重组质粒,通过... 【目的】探讨在巯乙基磺酸钠(MESNa)与碳酸氢铵(NH4HCO3)存在下,对在大肠杆菌上表达的重组融合蛋白中内含肽(Intein)用硫醇(DTT)进行自剪切,促使抗菌肽(MME)碳末端实现酰胺化。【方法】构建用大肠杆菌表达内含肽介导的MME重组质粒,通过表达获得依次由"组氨酸、Sumo标签、MME、内含肽"构成的融合蛋白,用镍柱及透析进行纯化,在MESNa和NH4HCO3存在下,用DTT对内含肽进行自剪切,促使MME碳末端酰胺化,肠激酶切割、纯化,得到碳末端酰胺化的MME。质谱和二级串联质谱配合使用,检测MME及其碳末端酰胺化。【结果】通过PCR,鉴定融合蛋白,其基因片段为837 bp,符合预期。质谱鉴定得MME相对分子量为3057.7与其理论值3057.64一致。二级串联质谱检测得MME碳端碎片的分子量为1214.728,与碳末端酰胺化的MME碳端碎片理论分子量1214.739相符,匹配度为45,表明本研究制备的MME碳末端已被酰胺化,该蛋白为可溶。【结论】用大肠杆菌成功地表达了重组融合蛋白,在MESNa与NH4HCO3存在下,促进了内含肽自剪切,MME碳末端被酰胺化,实现了简单的"一步法"制备。质谱与二级串联质谱配合使用,可灵敏、简单地对碳末端酰胺化多肽进行检测,可作为该项检测方法的一种选择,结果表明,本研究成功地制备了碳末端酰胺化的MME。 展开更多

关键词 抗菌肽 酰胺化 内含肽介导 自剪切

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蛋白质内含子介导蛛丝功能化平台的建立

18

作者 林森珠 陈格飞 孟清 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1704-1714,共11页

为建立高效快捷的蛛丝功能化修饰平台,蛋白质内含子的反式剪接技术被首次应用于重组蛛丝的功能化修饰。在体外通过Ssp Dna B的反式剪接作用,在蛋白质水平上将12 k Da泛素相关修饰蛋白(SUMO)与蛛丝蛋白(W2CT)连接形成功能化蛛丝蛋白SUMOW... 为建立高效快捷的蛛丝功能化修饰平台,蛋白质内含子的反式剪接技术被首次应用于重组蛛丝的功能化修饰。在体外通过Ssp Dna B的反式剪接作用,在蛋白质水平上将12 k Da泛素相关修饰蛋白(SUMO)与蛛丝蛋白(W2CT)连接形成功能化蛛丝蛋白SUMOW2CT。修饰后SUMOW2CT与W2CT均能形成纳米至微米级的丝纤维,但SUMOW2CT自动成丝速度明显下降且产量约为W2CT的一半。与W2CT丝纤维(W)相似,SUMOW2CT丝纤维(UW)不具有超收缩能力和对2%SDS不耐受,但机械性能低于W2CT丝纤维。功能化蛋白SUMOW2CT形成的丝纤维中SUMO蛋白仍保持着正确三维结构,可被SUMO蛋白酶酶切。外源功能化蛋白质虽在一定程度上降低了丝的形成速度和机械性能,但修饰上的功能化蛋白仍保持着生物活性,表明断裂蛋白质内含子介导的蛛丝修饰平台成功建立,也为蛛丝的功能化修饰和应用奠定了坚实的技术基础。 展开更多

关键词 重组蜘蛛丝 断裂蛋白质内含子 功能化修饰 重组葡萄状腺丝蛋白 小分子泛素相关修饰蛋白

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蛋白质内含子在特定氨基酸序列中的剪接

19

作者 张晓 刘相钦 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期686-691,共6页

基因工程技术已经被广泛应用于抗体的生产。但是由于抗体的分子量较大,导致合成抗体较为困难。蛋白质内含子是前体蛋白质中的一段氨基酸序列,能够将自身剪切出来,并将两端的外显子连接形成成熟的蛋白质。将抗体的Fab(antigen-binding fr... 基因工程技术已经被广泛应用于抗体的生产。但是由于抗体的分子量较大,导致合成抗体较为困难。蛋白质内含子是前体蛋白质中的一段氨基酸序列,能够将自身剪切出来,并将两端的外显子连接形成成熟的蛋白质。将抗体的Fab(antigen-binding fragment)和Fc(crystalline fragment)分别与蛋白质内含子(intein)的N端(I_N)和C端(I_C)融合表达,利用蛋白质内含子的剪接功能,可形成完整的抗体分子。KSCDKTH是存在于抗体铰链区(hinge region)的一段氨基酸序列,如果在KSCDKTH序列中筛选到高效剪接的蛋白质内含子,即可通过蛋白质剪接,将抗体分子的Fab和Fc剪接形成完整抗体。本文筛选发现,Ssp Dna X的3种断裂蛋白质内含子(S0,S1,S11)具有在KSCDKTH序列中高效剪接的能力,这一研究结果为抗体的剪接合成提供了可行性。 展开更多

关键词 抗体铰链区 断裂蛋白质内含子 蛋白质剪接

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断裂型内含肽在蛋白生产和生物工程中的应用

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作者 杨帆 Xu Ming-qun +1 位作者 王永 程奕 《生物技术通讯》 CAS 2008年第5期724-727,共4页

蛋白反式剪接是蛋白翻译后修饰的一种特殊机制,这一反应由断裂型内含肽自我催化完成,不需要酶和其他因子参与。与常规顺式的蛋白剪接不同的是,反式剪接是基于断裂型内含肽由N端和C端这两段多肽的高亲和力,精准地构建成一个具有剪接活性... 蛋白反式剪接是蛋白翻译后修饰的一种特殊机制,这一反应由断裂型内含肽自我催化完成,不需要酶和其他因子参与。与常规顺式的蛋白剪接不同的是,反式剪接是基于断裂型内含肽由N端和C端这两段多肽的高亲和力,精准地构建成一个具有剪接活性的内含肽蛋白质。反式剪接已被发展成新的生物技术应用于生产环化蛋白、构建蛋白定点与定时表达的载体和转基因植物,以及改造cDNA文库技术等。 展开更多

关键词 断裂型蛋白内含肽 反式剪接 环化蛋白质 CDNA文库

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