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Sidt2在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用及机制研究
1
作者 熊钱颖 熊超群 《医学理论与实践》 2025年第23期3973-3977,共5页
目的:以ARPE-19细胞和Sidt2剔除小鼠为研究对象,分别在离体水平和在体水平上研究Sidt2在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用。方法:敲降ARPE-19细胞中的Sidt2,通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)选出敲降效率最高的小干扰片段,Western blot... 目的:以ARPE-19细胞和Sidt2剔除小鼠为研究对象,分别在离体水平和在体水平上研究Sidt2在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用。方法:敲降ARPE-19细胞中的Sidt2,通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)选出敲降效率最高的小干扰片段,Western blot检测Sidt2蛋白沉默效率。选取生长状态良好的第3~6代ARPE-19细胞分为对照组(Control)、高糖组(HG)、高糖+阴性对照组(HG+NC)和高糖+Sidt2敲降组(HG+si-Sidt2)。将对照组细胞培养在5.5mmol/L正常葡萄糖浓度中,其余三组培养在25mmol/L高糖浓度下,48h后检测相关指标。通过Western blot检测ARPE-19细胞内Sidt2、IKB、P-IKB、P65、P-JAK蛋白的表达量。免疫荧光化学染色检测对照组、高糖组和高糖+Sidt2敲降组三组细胞紧密连接蛋白ZO-1的表达。对野生型小鼠和Sidt2剔除小鼠眼球进行石蜡包埋、切片、HE染色,观察两组样本视网膜各层形态的改变。结果:siRNA转染组相较于对照组,Sidt2蛋白表达明显下降。与对照组相比,高糖可以诱导ARPE-19细胞Sidt2表达明显增加(P<0.05)。高糖状态可导致ARPE-19细胞IKB、P-IKB、P65、P-JAK蛋白水平均明显升高(P<0.05)。敲低ARPE-19细胞Sidt2表达,可以减少高糖诱导的IKB、P-IKB、P65、P-JAK蛋白的表达。高糖会导致细胞ZO-1表达减少,Sidt2敲降后,高糖环境下ZO-1表达增加。野生型小鼠和Sidt2剔除小鼠眼球视网膜各层形态无统计学差异(P>0.05)。结论:敲低Sidt2虽可抑制高糖诱导的ARPE-19细胞炎症反应,改善高糖环境下紧密连接蛋白的表达;敲低Sidt2虽可引起调节炎症反应相关因子表达的改变,但暂不会引起视网膜形态上的改变。 展开更多
关键词 sidt2 糖尿病视网膜病变 人视网膜色素上皮细胞 炎症
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溶酶体膜蛋白Sidt2对血糖代谢的影响
2
作者 王李卓 章尧 +10 位作者 余翠 熊钱颖 谭凤彪 蒋雪 陆晓华 夏礼斌 陆美琴 陈月平 张斌华 凌烈峰 高家林 《皖南医学院学报》 CAS 2015年第6期518-521,共4页
目的:通过模式动物研究溶酶体膜蛋白Sidt2与糖代谢的关系。方法:利用Lox P-Flox-Lox P系统,通过基因重组及打靶技术获得Sidt2剔除小鼠模型。检测成年小鼠的空腹血糖及葡萄糖耐量,评估Sidt2基因剔除对小鼠糖代谢的影响。同时通过HE染色观... 目的:通过模式动物研究溶酶体膜蛋白Sidt2与糖代谢的关系。方法:利用Lox P-Flox-Lox P系统,通过基因重组及打靶技术获得Sidt2剔除小鼠模型。检测成年小鼠的空腹血糖及葡萄糖耐量,评估Sidt2基因剔除对小鼠糖代谢的影响。同时通过HE染色观察Sidt2-/-小鼠胰岛形态结构改变。结果:通过对Sidt2剔除模型小鼠的Sidt2 mRNA及蛋白水平鉴定,确定Sidt2基因剔除小鼠模型成功构建。对小鼠末梢血糖检测发现,Sidt2-/-成年小鼠表现出空腹血糖增高及糖耐量受损的糖尿病表现。对Sidt2-/-小鼠胰岛形态检测发现,其胰岛出现结构紊乱,胰岛空泡变性及部分细胞出现肥大等病理改变。结论:溶酶体膜蛋白Sidt2与糖代谢密切相关。 展开更多
关键词 溶酶体膜蛋白 sidt2 糖代谢 糖尿病
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Sidt2基因剔除小鼠的肺部形态学改变
3
作者 蒋雪 章尧 +5 位作者 王李卓 王云 夏礼斌 陈月平 王莹 高家林 《皖南医学院学报》 CAS 2016年第4期307-310,共4页
目的:观察Sidt2基因剔除小鼠的肺组织超微结构,探讨Sidt2基因在肺脏形态发育过程中的作用。方法:将利用基因打靶及同源重组技术获得的Sidt2基因全身剔除小鼠和野生型B129品系小鼠合笼交配,鼠尾提取DNA进行基因型鉴定,挑选出子代Sidt2-/... 目的:观察Sidt2基因剔除小鼠的肺组织超微结构,探讨Sidt2基因在肺脏形态发育过程中的作用。方法:将利用基因打靶及同源重组技术获得的Sidt2基因全身剔除小鼠和野生型B129品系小鼠合笼交配,鼠尾提取DNA进行基因型鉴定,挑选出子代Sidt2-/+小鼠,同笼交配,再挑选出子代Sidt2-/-小鼠为实验组,以同窝野生型小鼠为对照,进行DNA、RNA和Western鉴定,并行肺组织光镜和电镜形态学观察。结果:通过DNA、RNA、蛋白质水平验证模型构造成功。光镜下对照鼠肺泡壁光滑,仅有少量粒细胞浸润;模型鼠肺泡间质内毛细血管扩张、充血,多处炎症细胞呈灶状分布。电镜下对照鼠的肺组织形态较规则;模型鼠可见肺泡上皮细胞崩解,毛细血管充血及基底膜增厚。结论:Sidt2基因剔除可影响小鼠肺组织形态,表现为细胞坏死,毛细血管充血及基底膜增厚,大量炎症细胞浸润,造成肺损伤。 展开更多
关键词 溶酶体膜蛋白 sidt2 肺部形态 炎症 肺损伤
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稳定表达人SidT2基因细胞系的建立及其dsRNA转运功能的研究
4
作者 任瑞文 张新军 +3 位作者 唐博恒 张培 洪文艳 刘建伟 《生物技术通讯》 CAS 2013年第4期493-496,共4页
目的:构建稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,探讨SidT2基因过表达与细胞转运双链RNA(dsRNA)能力的关系。方法:根据人SidT2基因序列设计引物,克隆其编码区序列,经双酶切后与pEGFP-N3载体连接,构建其真核表达载体,分别瞬时转染BHK及M... 目的:构建稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,探讨SidT2基因过表达与细胞转运双链RNA(dsRNA)能力的关系。方法:根据人SidT2基因序列设计引物,克隆其编码区序列,经双酶切后与pEGFP-N3载体连接,构建其真核表达载体,分别瞬时转染BHK及MDCK细胞,并使用G418筛选稳定表达细胞系;在此基础上,体外转录合成绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA,以GFP基因为报告基因,进一步分析过表达人SidT2基因对BHK及MDCK细胞转运dsRNA能力的影响。结果:经基因克隆、酶切、连接后,构建了人SidT2基因真核表达载体pEGFP-SidT2;经瞬时转染及G418筛选,获得稳定过表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,实时荧光定量RT-PCR分析表明,其SidT2基因转录水平分别提高71、64.5倍;稳定表达SidT2基因后,在培养液中添加GFP dsRNA,GFP荧光强度较对照细胞分别降低88.1%、73.7%,表明稳定表达SidT2基因的BHK、MDCK细胞转运dsRNA的能力显著增强。结论:构建了稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,SidT2基因过表达可显著提高外源性dsRNA的转运能力。 展开更多
关键词 sidt2基因 真核表达 BHK细胞系 MDCK细胞系 细胞转运 双链RNA
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sidt2基因敲除小鼠对肝脂类物质代谢的影响
5
作者 孟宇 吴波 《通化师范学院学报》 2023年第12期43-46,共4页
目的:使用sidt2基因敲除小鼠模型来研究sidt2在肝脂类物质代谢中的作用.方法:用Cre/LoxP技术制作小鼠模型,采用RT-PCR技术检测sidt2的mRNA表达,蛋白印迹分析其蛋白的组织分布.与野生型小鼠相比,用酶法来分析sidt2-/-小鼠血清脂类物质、... 目的:使用sidt2基因敲除小鼠模型来研究sidt2在肝脂类物质代谢中的作用.方法:用Cre/LoxP技术制作小鼠模型,采用RT-PCR技术检测sidt2的mRNA表达,蛋白印迹分析其蛋白的组织分布.与野生型小鼠相比,用酶法来分析sidt2-/-小鼠血清脂类物质、天冬氨酸氨基转移酶、谷丙转氨酶和血清胆红素等的变化.结果:通过sidt2的基因鉴定,获得基因敲除小鼠,并且发现sidt2-/-小鼠肝功能和脂类物质代谢异常.结论:缺乏溶酶体膜蛋白sidt2会导致肝功能和脂类物质代谢发生异常. 展开更多
关键词 sidt2-/-小鼠 脂类物质代谢 肝功能
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溶酶体膜蛋白Sidt2缺失导致肝脏细胞自噬受损 被引量：1
6
作者 耿梦雅 王李卓 +8 位作者 章尧 裴文俊 漆梦湘 杨梦 许家豪 梁洋洋 吕坤 何春玲 高家林 《南方医科大学学报》 CSCD 北大核心 2021年第8期1207-1213,共7页
目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2缺失后对肝脏自噬的影响。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,对自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12进行蛋白水平检测,同时使用免疫荧光方法对LC3B及P62... 目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2缺失后对肝脏自噬的影响。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,对自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12进行蛋白水平检测,同时使用免疫荧光方法对LC3B及P62进行共定位,检测自噬小体对P62货物蛋白的识别与封存以及自噬溶酶体的降解。对LC3B及LAMP1进行免疫荧光共定位,检测自噬小体与溶酶体融合过程。使用LysoTracker对酸性溶酶体进行示踪。结果成功构建HL7702细胞Sidt2^(+/+)组及Sidt2^(-/-)组,HL7702细胞Sidt2^(-/-)组较Sidt2^(+/+)组相比,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ及P62表达均增多(P<0.01),免疫荧光结果显示LC3B及P62亦明显增多(P<0.001),同时自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12表达减少(P<0.05)。LC3B与P62共定位降低,LC3B与LAMP1共定位降低,酸性溶酶体数量减少(P<0.05)。结论Sidt2基因的缺失导致人肝脏细胞自噬小体对P62货物蛋白的识别和封存障碍,同时酸性溶酶体数量减少、自噬小体与溶酶体融合障碍导致自噬溶酶体途径受阻,最终导致LC3B与P62发生堆积,肝脏细胞自噬受损。 展开更多
关键词 sidt2 自噬小体 溶酶体 融合 货物蛋白
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溶酶体膜蛋白sidt2介导肝脏细胞的凋亡:不通过抑制自噬溶酶体途径
7
作者 许家豪 耿梦雅 +12 位作者 刘海军 裴文俊 顾静 漆梦湘 章尧 吕坤 宋迎迎 刘苗苗 胡鑫 余翠 何春玲 王李卓 高家林 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期637-643,共7页
目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2敲除后在肝脏细胞中调控凋亡的途径。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,检测Sidt2和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白水平,MDC染色观察自噬体形成情况,通过EdU和流式细胞实验观察... 目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2敲除后在肝脏细胞中调控凋亡的途径。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,检测Sidt2和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白水平,MDC染色观察自噬体形成情况,通过EdU和流式细胞实验观察Sidt2对肝脏细胞增殖活性和凋亡的影响,并且使用0、10、25、50、100、200μmol/L的氯喹(CQ)摸索肝脏细胞CQ饱和浓度,检测对其自噬流的影响,以及使用CQ进一步探索影响肝脏细胞的增殖活性其凋亡水平的机制。结果成功构建HL7702细胞Sidt2+/+组及Sidt2-/-组。Sidt2基因缺失可导致肝脏细胞增殖被抑制和凋亡水平的增加,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62在蛋白水平上的表达均增加且自噬体含量增加(P<0.05)。结果显示50μmol/LCQ作用下肝脏细胞自噬达到饱和状态,50μmol/L CQ使Sidt2基因缺失时LC3B和P62的表达均增加(P<0.05),且CQ进一步降低肝脏细胞活性,并促进其凋亡水平(P<0.05)。结论在离体水平上,Sidt2基因剔除后,HL7702细胞可表现自噬通路的异常,并且不通过抑制自噬溶酶体途径介导和调控凋亡。 展开更多
关键词 sidt2 人肝脏细胞 凋亡 自噬 增殖
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利用CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因
8
作者 吕康甲 梁飞腾 +4 位作者 郑慧豪 张杨 徐海平 董莹莹 高家林 《皖南医学院学报》 CAS 2019年第3期214-218,共5页
目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为p... 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为px459-Sidt2并大量扩增。使用NEPA21高效基因转染系统将px459-Sidt2重组质粒电转到Beta-TC-6细胞中,电转染48h后使用嘌呤霉素加压进行阳性细胞筛选。阳性细胞扩增冻存,得到Sidt2基因剔除混合克隆细胞株,提取细胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法检测细胞株中Sidt2的敲除效果。结果:成功构建靶向小鼠Sidt2基因的px459重组质粒px45-Sidt2。使用NEPA21高效基因转染系统电转Beta-TC-6的最佳电转参数为脉冲电压150V,脉冲时间5ms,脉冲间隔50ms,脉冲次数2次,电压衰减10%,电穿孔模式为正方向。与对照组细胞相比,嘌呤霉素加压筛选得到的Beta-TC-6阳性细胞中的Sidt蛋白表达缺失(P<0.05),成功在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统以及电穿孔技术,在相对难转染的小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6成功剔除Sidt2基因。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 电穿孔 sidt2 Beta-TC-6
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小鼠sidt2基因的可变剪接验证
9
作者 刘舒云 李洁 +9 位作者 陈留存 曹国军 李少华 赵强 丁红梅 高亚萍 刘农乐 王芳 杨光 邵宁生 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2008年第5期418-420,423,共4页
目的:验证小鼠基因sidt2中sidt2(l)和sidt2(s)为同一基因经可变剪接所得的结果。方法:对小鼠sidt2基因进行生物信息学分析及基因组PCR,确定其基因组定位情况;通过提取总RNA、RT-PCR,了解sidt2在小鼠多种组织中的表达情况;构建可变剪接... 目的:验证小鼠基因sidt2中sidt2(l)和sidt2(s)为同一基因经可变剪接所得的结果。方法:对小鼠sidt2基因进行生物信息学分析及基因组PCR,确定其基因组定位情况;通过提取总RNA、RT-PCR,了解sidt2在小鼠多种组织中的表达情况;构建可变剪接报告载体,转染小鼠肝癌细胞Hepa1-6,并提取细胞总RNA、RT-PCR,检测其在细胞中的剪接行为,验证该基因存在可变剪接。结果及结论:证实小鼠sidt2存在可变剪接,其两条序列sidt2(l)和sidt2(s)为可变剪接的产物。 展开更多
关键词 sidt2 可变剪接 基因组定位 组织表达谱
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