目的设计并验证能够高效切割Hipp11位点的sgRNA,为在Hipp11位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11位点的sgRNA进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒在体外检测sg...目的设计并验证能够高效切割Hipp11位点的sgRNA,为在Hipp11位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11位点的sgRNA进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒在体外检测sgRNA的活性。选取活性较高的sgRNA体外转录,与Cas9 m RNA一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11位点切割效率,计算出sgRNA的体内活性。结果两个sgRNA的体外活性分别为19.2%和51.7%,使用体外活性高的2号sgRNA显微注射获得8只新生小鼠,其中62.5%(5/8)的小鼠中检测到Hipp11位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR技术在Hipp11位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA体外活性能够预测sgRNA在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA的有效手段。展开更多
文摘目的设计并验证能够高效切割Hipp11位点的sgRNA,为在Hipp11位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11位点的sgRNA进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒在体外检测sgRNA的活性。选取活性较高的sgRNA体外转录,与Cas9 m RNA一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11位点切割效率,计算出sgRNA的体内活性。结果两个sgRNA的体外活性分别为19.2%和51.7%,使用体外活性高的2号sgRNA显微注射获得8只新生小鼠,其中62.5%(5/8)的小鼠中检测到Hipp11位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR技术在Hipp11位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA体外活性能够预测sgRNA在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA的有效手段。
