肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的表达及其对该菌的特异性检测研究 被引量：4

1

作者 侯千禧 顾宣强 +4 位作者 刘家奇 李雅倩 夏芃芃 段强德 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期91-95,共5页

为获得肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白并检测其生物学功能,本研究以肠炎沙门氏菌标准株SE50336为模板,PCR扩增其含分泌信号肽的sef14操纵子基因片段,并克隆至表达载体pBR322中,构建重组质粒pBR322-sef14,将该重组质粒转化至经修饰且不含任... 为获得肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白并检测其生物学功能,本研究以肠炎沙门氏菌标准株SE50336为模板,PCR扩增其含分泌信号肽的sef14操纵子基因片段,并克隆至表达载体pBR322中,构建重组质粒pBR322-sef14,将该重组质粒转化至经修饰且不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000M株中,获得重组菌pBR322-sef14/SE5000M。将重组菌pBR322-sef14/SE5000M与本实验室制备的SefA(SEF14菌毛的主要亚基)单克隆抗体(MAb)凝集;利用透射电镜和免疫电镜观察上述重组菌并通过SDS-PAGE和western blot鉴定,利用该重组菌pBR322-sef14/SE5000M与肠炎沙门氏菌阳性鸡血清及其他菌的阳性鸡血清结合。结果显示,本实验室制备的SefA MAb能够特异性识别该重组菌,并产生明显的肉眼可见的凝集反应。重组菌表达的SEF14菌毛产物大小约为14.3 ku,与菌毛的主要亚基SefA的大小一致,电镜观察到重组菌表面有明显的菌毛结构。在肠炎沙门氏菌特异性靶向检测中,该重组菌表达的菌毛蛋白仅与肠炎沙门氏菌阳性鸡血清反应,能够在2 min内用肉眼观察到清晰的凝集颗粒,而不与鸡白痢、鸡伤寒、鼠伤寒沙门氏菌阳性鸡血清反应。本研究首次克隆了肠炎沙门氏菌sef14操纵子基因并在体外成功表达并进行了功能鉴定,上述研究结果为进一步研究SEF14菌毛及建立特异性诊断技术提供基础。 展开更多

关键词 肠炎沙门氏菌 sef14菌毛 sef14操纵子

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肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位sefA和sefD基因缺失株的致病性研究 被引量：9

2

作者 朱春红 孟霞 +3 位作者 姚丰华 胡艳 束婧婷 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期786-789,共4页

为研究SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌中的致病作用,本实验将SEF14菌毛亚单位编码基因缺失的肠炎沙门氏菌突变株50336△sefA和50336△sefD分别接种6周龄BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡,比较它们与其亲本菌株50336的致病性差异。结果显示,亲本菌株5... 为研究SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌中的致病作用,本实验将SEF14菌毛亚单位编码基因缺失的肠炎沙门氏菌突变株50336△sefA和50336△sefD分别接种6周龄BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡,比较它们与其亲本菌株50336的致病性差异。结果显示,亲本菌株50336以及突变株50336△sefA、50336△sefD对小鼠的半数致死量分别为19.95 cfu、7.94 cfu和7.94 cfu,表明两个突变株对小鼠的致病性显著增强;而且对雏鸡的致病性结果也显示,突变株50336△sefA致病力较强,其感染雏鸡组死亡率为15%,而亲本菌株组死亡率为8.6%;另外50336△sefA和50336△sefD感染组7日龄时平均增重分别为15.38 g和18.39 g,亲本菌株组为19.06 g,对照组为26.43 g。研究结果表明SEF14菌毛亚单位基因缺失对肠炎沙门氏菌的致病性具有增强作用。 展开更多

关键词 肠炎沙门氏菌 sef14菌毛 半数致死量

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肠炎沙门菌SEF14菌毛的抽提、纯化及生物学活性检测 被引量：1

3

作者 陆广富 朱春红 +1 位作者 段小丽 朱国强 《中国家禽》 北大核心 2011年第7期19-22,共4页

试验从肠炎沙门菌国内标准株50336中抽提和纯化SEF14菌毛,并制备SEF14蛋白鼠源高免血清。结果发现,肠炎沙门菌在CFA培养液中,静止培养50h左右,SEF14菌毛表达量相对较多,在机械高速匀浆后,经进一步的透析纯化,得到较纯的SEF14菌毛蛋白,... 试验从肠炎沙门菌国内标准株50336中抽提和纯化SEF14菌毛,并制备SEF14蛋白鼠源高免血清。结果发现,肠炎沙门菌在CFA培养液中,静止培养50h左右,SEF14菌毛表达量相对较多,在机械高速匀浆后,经进一步的透析纯化,得到较纯的SEF14菌毛蛋白,蛋白大小和相关报道一致,约14ku左右。Western-blotting检测发现纯化的重组蛋白rSEFA(体外表达的SEF14菌毛主要亚单位蛋白SEFA)免疫小鼠得到的高免血清能识别标准株肠炎沙门菌SEF14菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA,说明体外抽提的SEF14菌毛蛋白和体外表达的rSEFA蛋白同样具有较好的免疫原性和反应原性。 展开更多

关键词 肠炎沙门菌 sef14菌毛 抽提 纯化

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肠炎沙门氏菌SEF14菌毛单克隆抗体的制备及初步应用 被引量：2

4

作者 段小丽 董立伟 +2 位作者 张江英 杨奕 朱国强 《上海畜牧兽医通讯》 2013年第1期2-6,共5页

肠炎沙门氏菌现已成为全球性食品安全问题的主要病原之一。本试验基于肠炎沙门氏菌特异性SEF14菌毛,应用淋巴细胞杂交瘤技术成功制备了3株单克隆抗体杂交瘤细胞株,Western-blotting检测结果显示3株单克隆抗体均具有良好的特异性。同时,... 肠炎沙门氏菌现已成为全球性食品安全问题的主要病原之一。本试验基于肠炎沙门氏菌特异性SEF14菌毛,应用淋巴细胞杂交瘤技术成功制备了3株单克隆抗体杂交瘤细胞株,Western-blotting检测结果显示3株单克隆抗体均具有良好的特异性。同时,用制备的单抗建立了双抗体夹心间接ELISA方法,利用方阵滴定确定捕获抗体和SEF14蛋白的最佳工作浓度分别为8μg/ml和2μg/ml。用该方法检测100份鸡血清样本,59份为阳性,与肠炎沙门氏菌特异性基因片段sdfI的PCR符合率达93%。本试验建立的方法特异性强、灵敏性高,可用于临床诊断,在肠炎沙门氏菌特异性检测方面具有潜在的应用前景。 展开更多

关键词 肠炎沙门氏菌 sef14菌毛 单克隆抗体 双抗体夹心间接ELISA

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肠炎沙门氏菌SEF14菌毛体外表达条件研究

5

作者 朱春红 段晓丽 +5 位作者 厚华艳 龚建森 张江英 姚丰华 孟霞 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期976-979,共4页

为筛选肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)SEF14菌毛体外表达的最适培养条件,本研究对4种不同培养条件下S.enteritidis SEF14菌毛的体外表达情况进行了比较研究,并通过RT-PCR、透射电镜与免疫电镜观察和SDS-PAGE等方法进行验证。研究表明,其中... 为筛选肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)SEF14菌毛体外表达的最适培养条件,本研究对4种不同培养条件下S.enteritidis SEF14菌毛的体外表达情况进行了比较研究,并通过RT-PCR、透射电镜与免疫电镜观察和SDS-PAGE等方法进行验证。研究表明,其中以TSB肉汤25℃震荡培养24 h后转接20℃继续震荡培养24 h,最后转接粘附因子抗原培养基(CFA)(pH6.0)于37℃静置培养50 h^60 h的SEF14菌毛表达量最高。RT-PCR结果显示在该培养条件下SEF14菌毛主要亚单位蛋白编码基因sefA mRNA表达水平最高,在透射电镜和免疫电镜下均可观察到丰富的SEF14菌毛。SDS-PAGE结果显示,所抽提的菌毛蛋白大小为14.3 ku,与相关报道一致,而且等量菌泥的抽提量最大。 展开更多

关键词 肠炎沙门氏菌 sef14菌毛 表达条件 RT-PCR 电镜观察 匀浆抽提

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肠炎沙门菌sef14基因缺失株生物学功能 被引量：2

6

作者 顾宣强 侯千禧 +4 位作者 刘家奇 李雅倩 夏芃芃 段强德 朱国强 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期71-77,共7页

构建了肠炎沙门菌参考株SE50336的SefA主要亚单位编码基因sefA的缺失株SE50336ΔsefA,进一步探究野生株及SEF14菌毛缺失株的生物学功能。以SE50336为模板,利用λ-red同源重组技术构建sefA缺失株,通过绘制生长曲线、生物被膜测定试验、... 构建了肠炎沙门菌参考株SE50336的SefA主要亚单位编码基因sefA的缺失株SE50336ΔsefA,进一步探究野生株及SEF14菌毛缺失株的生物学功能。以SE50336为模板,利用λ-red同源重组技术构建sefA缺失株,通过绘制生长曲线、生物被膜测定试验、刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基菌落表型试验、RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)、人结肠腺癌上皮细胞(Caco-2)的体外黏附测定来检测和比较2种菌株的生物学特性,并利用野生株和缺失株分别攻毒小鼠,探究SEF14菌毛对肠炎沙门菌致病力的影响。结果显示,野生株及缺失株生长情况无明显差异。与野生株相比,ΔsefA缺失株的生物被膜形成能力有所下降;菌落表型试验中野生株表现出典型的rdar(red,dry and rough)表型,而ΔsefA缺失株表现出saw(smooth and white)表型;RT-qPCR试验中,野生株的生物被膜形成主要关联基因csgA、bcsA、pgaC、fimA的转录量均显著高于ΔsefA缺失株。但缺失株与野生株对于Caco-2上皮细胞的黏附差异不显著(P=0.41)。小鼠体内致病性试验显示,野生株的LD;(10 CFU)显著低于缺失株(17.78 CFU),表明sefA亚单位编码基因缺失株减弱了肠炎沙门菌对BALB/c小鼠的毒力。上述数据和试验结果为进一步研究SEF14菌毛的生物学功能及其致病性提供了基础。 展开更多

关键词 肠炎沙门菌 sef14 ΔsefA缺失株 生物学功能

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肠炎沙门氏菌SEF14菌毛及SefD蛋白的研究进展

7

作者 张丽 《甘肃畜牧兽医》 2017年第1期47-48,50,共3页

SEF14菌毛是血清型肠炎沙门氏菌所特有的一种菌毛。文章不仅综述了SEF14菌毛的分布、功能及组装形成,还综述了目前针对SEF14菌毛上的顶端蛋白Sef D所进行的研究及成果,包括确定了Sef D蛋白的功能、解析了Sef D蛋白的结构及证实了含有Se... SEF14菌毛是血清型肠炎沙门氏菌所特有的一种菌毛。文章不仅综述了SEF14菌毛的分布、功能及组装形成,还综述了目前针对SEF14菌毛上的顶端蛋白Sef D所进行的研究及成果,包括确定了Sef D蛋白的功能、解析了Sef D蛋白的结构及证实了含有Sef D蛋白的疫苗的有效性。最后在此研究基础上还提出了以后关于Sef D蛋白的研究前景及方向。 展开更多

关键词 sef14菌毛 SefD蛋白 功能 结构 疫苗

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SEF14菌毛基因操纵子在肠炎沙门氏菌和D-群沙门氏菌的变异分析 被引量：2

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作者 朱春红 陆广富 +6 位作者 陈雯雯 李慧芳 胡艳 刘学贤 徐步 陈宽维 朱国强 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期276-281,共6页

【目的】本文旨在探索SEF14菌毛特异性表达于D-群沙门氏菌,特别是肠炎沙门氏菌以及都柏林沙门氏菌的原因。【方法】应用PCR扩增以及序列测定检测了18株鸡白痢沙门氏菌,11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌标准株中sefA,sefD和sefR基... 【目的】本文旨在探索SEF14菌毛特异性表达于D-群沙门氏菌,特别是肠炎沙门氏菌以及都柏林沙门氏菌的原因。【方法】应用PCR扩增以及序列测定检测了18株鸡白痢沙门氏菌,11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌标准株中sefA,sefD和sefR基因序列,并分析比对其序列变异。【结果】以11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌染色体DNA为模板能成功扩增sefA,sefD以及sefR基因;从18株鸡白痢沙门氏菌中均能成功扩增sefA基因,但只有分离于1980年之前的7株分离菌能成功扩增sefD和sefR基因,而另11株1980年后分离菌PCR扩增sefD和sefR基因却无任何产物。比对PCR扩增产物测序结果发现,11株肠炎沙门氏菌以及1株都柏林沙门氏菌株中sefA,sefD以及sefR基因序列和已发表的序列(GenBank登录号为L11008,U07129和AF233854)100%同源;7株鸡白痢沙门氏菌sefD基因测序结果表明,在196位点处发生碱基缺失,造成移码突变,提前于氨基酸残基71位点处产生终止密码子。优化菌毛表达条件,体外抽提和纯化菌毛并进一步试验证明:肠炎沙门氏菌以及都柏林沙门氏菌体外能很好表达SEF14菌毛,但鸡白痢沙门氏菌在相同培养条件下却无任何表达迹象。【结论】SEF14菌毛操纵子亚单位基因sefA,sefD以及调节基因sefR在不同沙门氏菌中的变异情况可能是SEF14菌毛局限性表达的原因之一。 展开更多

关键词 肠炎沙门氏菌 鸡白痢沙门氏菌 sef14基因操纵子 变异

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肠炎沙门菌SEF14菌毛与肠上皮细胞IPEC-J2和Caco-2的体外黏附作用研究 被引量：2

9

作者 厚华艳 朱春红 +2 位作者 吕靖 董立伟 朱国强 《畜牧与兽医》 北大核心 2013年第9期12-15,共4页

为研究肠炎沙门菌SEF14菌毛对肠上皮细胞的黏附作用,本试验利用肠炎沙门菌50336株、突变株50336ΔsefA、50336ΔsefD以及互补株50336ΔsefA(pBRA)、50336ΔsefD(pACYCD)与肠上皮细胞系细胞(IPEC-J2和Caco-2)进行了黏附作用。结果显示:... 为研究肠炎沙门菌SEF14菌毛对肠上皮细胞的黏附作用,本试验利用肠炎沙门菌50336株、突变株50336ΔsefA、50336ΔsefD以及互补株50336ΔsefA(pBRA)、50336ΔsefD(pACYCD)与肠上皮细胞系细胞(IPEC-J2和Caco-2)进行了黏附作用。结果显示:上述菌株均能与IPEC-J2、Caco-2细胞进行有效黏附,并且随时间延长黏附数量有所增多,相同时间各菌株与IPEC-J2细胞的黏附数量明显多于Caco-2细胞;但细菌和细胞共感染1和4 h后,肠炎沙门菌野生株、相应的突变株和互补株与IPEC-J2和Caco-2细胞黏附的数量差别很小,未到达显著差异水平(P>0.05)。结果表明:SEF14菌毛并不特异性介导肠炎沙门菌与肠上皮细胞系IPEC-J2和Caco-2的黏附作用,或者不是介导黏附作用的主要因子。 展开更多

关键词 肠炎沙门菌 sef14菌毛 肠上皮细胞 黏附作用

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基于Red同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌突变株方法的比较 被引量：23

10

作者 朱春红 孙晓庆 +1 位作者 何素芬 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期81-84,98,共5页

Red同源重组系统和高效自杀性载体系统都能对革兰氏阴性菌染色体直接进行修饰,本试验利用上述2种系统敲除不同来源肠炎沙门氏菌菌株SEF14菌毛操纵子亚单位sefD或sefA基因,并对构建肠炎沙门氏菌突变株方法进行比较。本研究成功构建了国... Red同源重组系统和高效自杀性载体系统都能对革兰氏阴性菌染色体直接进行修饰,本试验利用上述2种系统敲除不同来源肠炎沙门氏菌菌株SEF14菌毛操纵子亚单位sefD或sefA基因,并对构建肠炎沙门氏菌突变株方法进行比较。本研究成功构建了国际、国内标准株,鸡源和人源国内分离株sefD和sefA缺失株各4株。Red同源重组系统中能将PCR产物一步法直接转化肠炎沙门氏菌,通过同源重组序列发生同源重组交换,但对PCR产物和感受态细胞的质量要求很高,一次重组效率很低,而二次重组过程则相对简单、高效。自杀性载体系统若将构建好的含同源DNA片段的重组质粒转化宿主菌,其一次重组效率高,二次重组也只需蔗糖筛选传代丢失抗性质粒。Red同源重组系统将在染色体中残留FRT位点;而自杀性载体系统在染色体中可不留任何痕迹。所以2个系统都能对不同源肠炎沙门氏菌染色体进行直接修饰,而且易删除抗性选择标志,与传统的高效自杀性载体系统比较,Red同源重组系统更方便快捷,省时省力。 展开更多

关键词 肠炎沙门氏菌 同源重组 sef14菌毛 sefA sefD

暂未订购

肠炎沙门氏菌SEFA基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立 被引量：15

11

作者 朱春红 吴娟 +2 位作者 张伟娟 陆光富 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期44-48,共5页

为了给临床检测肠炎沙门氏菌的感染和血清学调查提供一种切实可行的方法,本研究根据肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子亚单位sefA基因序列设计一对引物,利用PCR技术从国内标准株CMCC(B)50336中扩增sefA基因,并按预定的阅读框插入表达载体pET2... 为了给临床检测肠炎沙门氏菌的感染和血清学调查提供一种切实可行的方法,本研究根据肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子亚单位sefA基因序列设计一对引物,利用PCR技术从国内标准株CMCC(B)50336中扩增sefA基因,并按预定的阅读框插入表达载体pET22b+中,获得重组质粒pET-sefA,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列大小为498bp,与已发表的sefA结构编码序列完全一致。重组质粒pETsefA转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并能获得高效诱导表达,通过对菌体裂解上清液SDS-PAGE和western blot分析鉴定,该重组菌可以表达大小为15.2ku的可溶性重组蛋白rSEFA。纯化的rSEFA免疫小鼠所得高免血清以及标准株CMCC(B)50336感染小鼠后所获阳性血清,均能识别标准株肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA,结果表明明体外表达的rSEFA蛋白有较好的免疫原性和反应原性。而基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性,对肠炎沙门氏菌特异性抗体检测有潜在的应用前景。 展开更多

关键词 肠炎沙门氏菌 sef14菌毛 sefA 间接ELISA

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肠炎沙门氏菌特异性诊断方法的建立 被引量：18

12

作者 蒋颖 刘轶 +1 位作者 郦晓琼 朱国强 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期6-8,12,共4页

用传统的分离鉴定方法从临床采集的12例不同蛋鸡样本中分离到1株肠炎沙门氏菌。为避免传统鉴定技术中可能出现的假阳性等问题,依据SEF 14菌毛是肠炎沙门氏菌的特异性粘附素这一特性,设计编码该粘附素基因中相对保守片段的1对引物,对上... 用传统的分离鉴定方法从临床采集的12例不同蛋鸡样本中分离到1株肠炎沙门氏菌。为避免传统鉴定技术中可能出现的假阳性等问题,依据SEF 14菌毛是肠炎沙门氏菌的特异性粘附素这一特性,设计编码该粘附素基因中相对保守片段的1对引物,对上述可疑菌株进行PCR扩增,以含有编码SEF 14菌毛操纵子全基因的质粒DNA、标准株SD-2染色体DNA作为阳性对照,鸡白痢国内分离株SP染色体DNA作为阴性对照。PCR扩增结果显示分离株出现1条与预期大小498 bp一致的特异性扩增条带,阳性对照也出现相同大小的条带,而阴性对照则未出现。结合传统的细菌学分离鉴定和特定的分子生物学鉴定,将此可疑分离株确定为肠炎沙门氏菌。该方法可快速、准确、敏感地检测肠炎沙门氏菌。 展开更多

关键词 肠炎沙门氏菌 分离鉴定 sef14菌毛 PCR技术

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肠炎沙门菌间接ELISA检测方法的建立 被引量：3

13

作者 康孟佼 朱春红 +4 位作者 蒋颖 姚丰华 吴娟 段小丽 朱国强 《中国家禽》 北大核心 2010年第15期22-25,共4页

本试验建立和优化了重组蛋白rSEFA介导的间接ELISA方法以特异性检测肠炎沙门菌感染血清。确定其抗原最佳包被量为7.5μg/mL,血清最适稀释度1∶100,作用时间为60 min;酶标二抗最适稀释度为1∶4 000,作用时间为60 min;判定标准为OD值≥0.... 本试验建立和优化了重组蛋白rSEFA介导的间接ELISA方法以特异性检测肠炎沙门菌感染血清。确定其抗原最佳包被量为7.5μg/mL,血清最适稀释度1∶100,作用时间为60 min;酶标二抗最适稀释度为1∶4 000,作用时间为60 min;判定标准为OD值≥0.346。基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性,能特异性识别肠炎沙门菌和都柏林沙门菌感染血清,不能识别相近的鸡白痢沙门菌感染血清,此方法与菌体凝集反应同时检测临床血清样品100份,二者阳性率分别为67%和54%,结果符合率为80.6%。这一方法的建立对肠炎沙门菌特异性抗体检测有潜在的应用前景。 展开更多

关键词 肠炎沙门菌 sef14菌毛 sefA 间接ELISA

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