目的克隆人核糖体蛋白S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,...目的克隆人核糖体蛋白S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,PET21a-RPS3a融合表达载体在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中以可溶性蛋白的形式高效表达RPS3a蛋白,超声破碎细胞,通过Ni^(2+)-NTA亲和层析柱初步纯化,再应用50kD超滤膜进一步纯化。用Western Blot印迹实验检测纯化后的蛋白。构建绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的pEGFP-N1-RPS3a表达载体,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察RPS3a重组荧光蛋白在细胞内的分布。结果获得了较高纯度的RPS3a蛋白,亚细胞定位分析表明RPS3a蛋白主要分布于细胞质。结论成功克隆了RPS3a基因并表达纯化了其蛋白,确定其亚细胞分布,为进一步研究RPS3a蛋白的性质和功能奠定了基础。展开更多
文摘目的克隆人核糖体蛋白S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,PET21a-RPS3a融合表达载体在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中以可溶性蛋白的形式高效表达RPS3a蛋白,超声破碎细胞,通过Ni^(2+)-NTA亲和层析柱初步纯化,再应用50kD超滤膜进一步纯化。用Western Blot印迹实验检测纯化后的蛋白。构建绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的pEGFP-N1-RPS3a表达载体,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察RPS3a重组荧光蛋白在细胞内的分布。结果获得了较高纯度的RPS3a蛋白,亚细胞定位分析表明RPS3a蛋白主要分布于细胞质。结论成功克隆了RPS3a基因并表达纯化了其蛋白,确定其亚细胞分布,为进一步研究RPS3a蛋白的性质和功能奠定了基础。
