番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究 被引量：23

1

作者 肖火根 胡晋生 范怀忠 《中国病毒学》 CAS CSCD 2000年第4期367-372,共6页

建立了检测番木瓜环斑病毒 (PRV)的免疫捕捉 PCR (IC PCR)法、ELISA PCR法和巢式 PCR法 ,它们分别能从 10 - 4、10 - 7和 10 - 14 稀释度的番木瓜叶粗汁液 (所含鲜叶组织的量分别 0 .5ug、0 .5ng和 5× 10 - 6ng)中检测出PRV。

关键词 番木瓜环斑病毒 免疫捕捉-pcr法 检测技术

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乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：12

2

作者 高正琴 贺争鸣 +2 位作者 邢瑞昌 卫礼 王吉 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第4期279-282,共4页

目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT ... 目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT nestedPCR ,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒4 0 (SV4 0 )及正常乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞提取核酸进行PCR ,并对2 10份临床样品进行了检测。结果　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞均扩增出10 15bp和6 2 2bp目的基因片段,而PPV、SV4 0及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞均未见特异性扩增条带,2 10份猪组织样品中未检出阳性样品。RT nestedPCR检测的最低限度为10PFU病毒。从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成。结论　本研究建立的RT NestedPCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测。 展开更多

关键词 乙脑病毒 反转录-嵌套式聚合酶链反应 检测

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纳米免疫磁珠联合巢式PCR检测胰腺癌患者外周循环微转移的意义 被引量：2

3

作者 胡亮 周家华 +3 位作者 易永祥 丁海 刘俊卯 赵亮 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期1097-1101,共5页

目的:建立一种检测胰腺癌患者外周血循环微转移的有效方法。方法:用人胰腺癌细胞株PANC-1与正常人外周血单核细胞(PBMC)以不同比例混合,用EpCAM抗体的纳米免疫磁珠对各比例组进行阳性分选,分离富集出肿瘤细胞,用巢式RT-PCR(RT-nest-PCR... 目的:建立一种检测胰腺癌患者外周血循环微转移的有效方法。方法:用人胰腺癌细胞株PANC-1与正常人外周血单核细胞(PBMC)以不同比例混合,用EpCAM抗体的纳米免疫磁珠对各比例组进行阳性分选,分离富集出肿瘤细胞,用巢式RT-PCR(RT-nest-PCR)检测细胞中端粒酶亚催化单位(h-TERT)和c-met的表达,以确定该检测方法的敏感度;用以上纳米免疫磁珠联合RT-nest-PCR方法检测25例胰腺癌患和15例良性病患者PBMC中h-TERT和c-met的表达,并分析两者与胰腺癌患者临床病理因素的关系。结果:纳米免疫磁珠联合RT-nest-PCR法检测h-TERT和c-met的敏感度分别为1个肿瘤细胞/1×107个PBMC和1个肿瘤细胞/1×106个PBMC。良性疾病组h-TERT及c-met基因表达率均为0(0/15),胰腺癌组h-TERT和c-met基因表达率分别为100%(25/25)和80%(20/25),且c-met阳性表达率与肿瘤分期有关(P<0.05)。结论:免疫磁珠联合RT-nest-PCR法检测h-TERT和c-met是发现胰腺癌外周血循环微转移的高敏感度方法。 展开更多

关键词 胰腺肿瘤 微转移 纳米免疫磁珠 巢式聚合酶链式反应 端粒酶亚催化单位 原癌基因蛋白质C-MET

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检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立 被引量：1

4

作者 张锦海 陈幸华 +5 位作者 李波 赵国良 张曦 孔佩艳 彭贤贵 刘林 《重庆医学》 CAS CSCD 2005年第12期1812-1814,共3页

目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR... 目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。 展开更多

关键词 急性髓性白血病 多药耐药基因 多重逆转录聚合酶链反应 半巢式多重聚合酶链式反应

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人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建 被引量：2

5

作者 田梅 刘林林 李修义 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期9-12,共4页

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为... 目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。 展开更多

关键词 PTEN/MMAC1 逆转录聚合酶链反应 巢式pcr法 表达载体 基因 抑制 肿瘤 基因表达

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应用多重巢式RT-PCR检测骨髓增生异常综合征中MLL基因相关的10种融合基因

6

作者 曹婷婷 高丽 +7 位作者 周敏航 郭玥潞 闫真 张松松 徐媛媛 丁一 王莉莉 于力 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期933-936,共4页

本研究探讨应用多重巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨髓增生异常综合征MDS)患者MLL基因相关的融合基因的临床价值。采用多重巢式RT-PCR方法检测了221例MDS患者10种MLL基因相关融合基因(dupMLL、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-AF6、MLL-AF9... 本研究探讨应用多重巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨髓增生异常综合征MDS)患者MLL基因相关的融合基因的临床价值。采用多重巢式RT-PCR方法检测了221例MDS患者10种MLL基因相关融合基因(dupMLL、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-CBP、MLL-AF1P、MLL-AF1Q)。结果表明:在221例MDS患者中检测出以上融合基因者20例(9.05%),以上10种基因的阳性例数及阳性率分别依次为7(3.16%)、2(0.9%)、1(0.45%)、1(0.45%)、2(0.9%)、2(0.9%)、1(0.45%)、2(0.9%)、1(0.45%)、1(10.45%)。结论:多重巢式RT-PCR技术能同时检测MDS患者中的10种融合基因,可作为MDS诊断及疗效判定的重要依据,同时也为微小残留病(MRD)及预后提供相关的重要信息。 展开更多

关键词 骨髓增生异常综合征 MLL基因 多重RT—pcr

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猪粪便中戊肝病毒实时荧光RT-PCR定性检测方法的建立及其分子流行病学特征 被引量：2

7

作者 李延霞 江涛 +5 位作者 李凤琴 彭子欣 王佳慧 李楠 张宏元 张立实 《卫生研究》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期545-551,559,共8页

目的建立以TaqMan探针为基础的戊肝病毒(HEV)实时荧光RT-PCR检测方法和构建系统发育树,对戊肝病毒进行基因分型,检测中国部分省市猪场的猪粪便样本HEV污染水平。方法参照GenBank HEV基因型序列,针对HEV保守区设计引物和探针,优化反应体... 目的建立以TaqMan探针为基础的戊肝病毒(HEV)实时荧光RT-PCR检测方法和构建系统发育树,对戊肝病毒进行基因分型,检测中国部分省市猪场的猪粪便样本HEV污染水平。方法参照GenBank HEV基因型序列,针对HEV保守区设计引物和探针,优化反应体系,建立实时荧光RT-PCR和巢式RT-PCR检测体系。结果建立的HEV实时荧光RT-PCR检测方法的灵敏度为19.9拷贝/μL,扩增效率92.9%~109.1%,与札如病毒(Sa)、诺如病毒(Nov)、甲肝病毒(HAV)均不发生交叉反应。荧光RT-PCR检测猪粪便样本342份,其中HEV阳性样本210份,阳性率61.4%,育肥前阳性率56.6%,育肥后阳性率66.9%,育肥前后样本阳性率差异具有统计学意义(χ~2=24.8,P<0.05);经基因分型鉴定体系测定阳性毒株基因型均为HEV-4型,且存在4b、4d、4h三种基因亚型。结论中国部分省市猪场中HEV感染普遍,基因型均为HEV-4型,各省市猪场感染率和基因亚型存在差异。 展开更多

关键词 戊型肝炎病毒 实时荧光RT-pcr 巢式RT-pcr 猪粪便

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反转录巢式PCR检测FⅧ基因内含子22倒位

8

作者 黄昆 吴润晖 +4 位作者 甄英姿 李刚 吴心怡 李泽坤 陈振萍 《中国小儿血液与肿瘤杂志》 CAS 2020年第6期329-333,共5页

目的建立凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22倒位的反转录巢氏PCR检测技术,与长链PCR进行比较。方法选取45例已在我院确诊为重型血友病A男性患者及3例血友病患者母亲,应用改良的反转录巢氏PCR检测和长链PCR方法检测患者是否存在内含子22倒位,... 目的建立凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22倒位的反转录巢氏PCR检测技术,与长链PCR进行比较。方法选取45例已在我院确诊为重型血友病A男性患者及3例血友病患者母亲,应用改良的反转录巢氏PCR检测和长链PCR方法检测患者是否存在内含子22倒位,对22倒位阴性患者进一步做内含子1倒位和二代基因测序验证。结果长链PCR检测45例患者中,内含子22倒位阳性20例,阴性25例。反转录巢氏PCR结果与长链-PCR一致。两种方法检测均阴性患者经二代测序及内含子1倒位检测,证实均存在FⅧ基因非22倒位的突变,其中4例巢式PCR产物凝胶电泳未见扩增条带判读为阴性的样本,2例为大片段缺失,2例为无义突变。结论反转录巢式PCR与长链-PCR对内含子22倒位的检测结果完全一致,有望作为一种快速准确的内含子22倒位检测方法在血友病基因诊断中予以应用。 展开更多

关键词 反转录巢氏pcr 长链pcr 内含子22倒位 血友病A

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树状DNA杂交技术在HCV检测中的应用 被引量：15

9

作者 赵秀丽 单祥年 +5 位作者 张建琼 李丽 史庭燕 万永奇 鲁晓萱 武景阳 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期27-30,共4页

目的　建立一种敏感性、特异性、重复性较好的 ,适于病原体群体筛查的检验方法。方法　通过RT PCR DDH ,RT nested PCR和HCVRNA DDH 3种方法检测HCV核酸 ,推断RT PCR DDH技术检测病毒核酸的特异性、敏感性和稳定性。结果　 4 7份ELISA检... 目的　建立一种敏感性、特异性、重复性较好的 ,适于病原体群体筛查的检验方法。方法　通过RT PCR DDH ,RT nested PCR和HCVRNA DDH 3种方法检测HCV核酸 ,推断RT PCR DDH技术检测病毒核酸的特异性、敏感性和稳定性。结果　 4 7份ELISA检测HCV抗体阳性血清标本 ,RT nested PCR检出阳性标本 33例 (70 .2 1% ) ,RT PCR DDH检出阳性标本 39例 (82 .98% )。结论　RT PCR DDH技术在逆转录病毒核酸检测的应用中具有较好的特异性、敏感性和稳定性 ,而且成本较低 ,操作安全简便 。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 基因组 3DNA信号放大 树状DNA杂交 逆转录巢式pcr

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湖南省家犬感染狂犬病病毒状况调查研究 被引量：13

10

作者 刘富强 陈立章 +1 位作者 高立冬 张红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期675-679,共5页

为了解湖南省家犬狂犬病病毒(RV)的感染状况,为防制狂犬病提供科学依据。本研究于2005年11月～2008年3月选择在全省18个县(市)收集市售家犬的脑组织标本,采用直接免疫荧光法(DFA)初筛检测RV抗原和套式RT-PCR方法检测RV特异性核酸进行确... 为了解湖南省家犬狂犬病病毒(RV)的感染状况,为防制狂犬病提供科学依据。本研究于2005年11月～2008年3月选择在全省18个县(市)收集市售家犬的脑组织标本,采用直接免疫荧光法(DFA)初筛检测RV抗原和套式RT-PCR方法检测RV特异性核酸进行确证。共检测家犬脑1613份,结果表明家犬RV感染率为4.15%。其中,雄性、雌性家犬RV感染率为4.68%和2.85%(p>0.05);大型、中型家犬RV感染率为4.57%和3.02%(p>0.05);成年犬、幼犬RV感染率为4.95%和1.57%(p<0.01);有、无狂犬疫苗免疫史的家犬RV感染率分别为1.29%、4.63%(p<0.05);春、夏、秋、冬季家犬RV感染率为9.56%、7.53%、2.31%、3.23%(p<0.01)。2005年～2006年、2007年～2008年各监测点家犬RV感染率分别与2006年、2007年人狂犬病发病率呈正相关(p<0.05)。检测结果表明湖南省家犬RV感染率较高(4.15%),存在地区、季节差异,而且家犬RV感染率与人狂犬病发病率呈正相关。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 感染率 直接免疫荧法 套式逆转录聚合酶链反应

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用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒 被引量：4

11

作者 张严峻 卢亦愚 +3 位作者 严菊英 周敏 姚亚萍 魏尔清 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期279-281,共3页

目的　建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法　用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3 和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果　以流感病毒的HA基因为模板... 目的　建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法　用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3 和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果　以流感病毒的HA基因为模板设计的 3对引物能特异性地扩增出 94 2bp、1117bp和 75 1bp的核酸片段 ,它们分别和甲1,甲3 和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0 1TCID50 的样品。结论　多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。 展开更多

关键词 流感病毒 血凝素基因 多重逆转录聚合酶链反应 半巢式多重聚合酶链反应 流行性感冒

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树状DNA杂交技术在戊型肝炎病毒检测中的应用 被引量：5

12

作者 单祥年 施燕峰 +4 位作者 孟继鸿 程险峰 单云峰 史庭燕 郑爱玲 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期16-18,共3页

目的　研究树状DNA杂交 (DDH)技术在戊型肝炎病毒 (HEV)检测中的应用。方法　以逆转录巢式PCR法 (RT nPCR)检测筛选HEV阳性标本 ,逆转录产物进行DDH。研究DDH技术检测HEV病毒的敏感性和通用性。结果　 2 5份HEV阳性标本的逆转录产物DDH... 目的　研究树状DNA杂交 (DDH)技术在戊型肝炎病毒 (HEV)检测中的应用。方法　以逆转录巢式PCR法 (RT nPCR)检测筛选HEV阳性标本 ,逆转录产物进行DDH。研究DDH技术检测HEV病毒的敏感性和通用性。结果　 2 5份HEV阳性标本的逆转录产物DDH检测均显阳性 ,HEV 5个不同基因型和亚型逆转录产物DDH检测也呈阳性。结论　RT 展开更多

关键词 DDH HEV 戊型肝炎病毒 逆转录巢式pcr 阳性标本 DNA杂交 敏感性 pcr) 产物 筛选

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应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒(英文) 被引量：6

13

作者 张寿斌 廖华 +3 位作者 黄呈辉 谭庆瑜 张炜灵 陈侃 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2004年第22期33-37,共5页

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及16... 目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛。特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染。方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测。结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P>0.05)。病例总阳性数64例,阳性率38.8%。结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率。 展开更多

关键词 逆转录聚合酶链反应 肠道病毒 通用引物

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猪瘟病毒3种检测方法的比较 被引量：7

14

作者 张艳英 高桂生 +4 位作者 高光平 史秋梅 张贵贤 田和杰 李秋艳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第3期205-209,共5页

本研究旨在比较3种检测猪瘟病毒方法的优缺点。应用反转录—复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)、荧光抗体法、胶体金免疫层析试纸条3种方法,分别对30份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒进行检测。试验结果显示,RT-nPCR方法检出阳性样品数为11份... 本研究旨在比较3种检测猪瘟病毒方法的优缺点。应用反转录—复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)、荧光抗体法、胶体金免疫层析试纸条3种方法,分别对30份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒进行检测。试验结果显示,RT-nPCR方法检出阳性样品数为11份,荧光抗体法为13份,胶体金免疫层析试纸条为8份;3种方法检测全为阳性8份,全为阴性17份。试验结果表明,荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果,敏感性比较差;胶体金免疫层析试纸条诊断方法最大的优点就是简便快速,且适合基层的应用,该方法的不足之处就是敏感性较低;RT-nPCR检测法具有快速、敏感等优点,但需一定仪器设备及成熟的技术方法。RT-nPCR还能区分待检样品为疫苗毒株(弱毒)还是野毒株感染(强毒),这是其他2种方法所不可比拟的。 展开更多

关键词 猪瘟 荧光抗体法 反转录—复合套式聚合酶链式反应 胶体金免疫层析试纸条

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云南大理某农村猪星状病毒分子流行病学调查 被引量：3

15

作者 刘承波 宿凌云 +5 位作者 邹莉 杨琳娜 董薇 马倩 闫雪兰 冯云 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第6期596-599,606,共5页

目的了解云南大理某农村猪群中星状病毒(astrovirus,AstV)感染情况,为AstV的防控提供理论依据。方法利用逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nested PCR)技术,对云南大理某农村采集的42份猪粪便样品进行PAstV799 bp基因部分片段扩增、克隆,并测... 目的了解云南大理某农村猪群中星状病毒(astrovirus,AstV)感染情况,为AstV的防控提供理论依据。方法利用逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nested PCR)技术,对云南大理某农村采集的42份猪粪便样品进行PAstV799 bp基因部分片段扩增、克隆,并测序;利用NCBI BLAST进行数据库比对,Mega 4.1软件进行序列同源性比较和系统进化树构建。结果 Trizol试剂提取42份猪粪便样品上清总RNA,经RT-nested PCR扩增,5份样品可见799 bp的目的基因片段,阳性率为11.90%;PAstV 799 bp片段同源性分析显示,5个毒株与PAstV-1、2、3、4和5的同源性为46.3%~87.9%,与PAstV-4的同源性最高,为75.5%~87.9%;PAstV 799 bp片段的系统进化分析显示,分离的毒株属于PAstV-4,同源性为80.0%~99.5%。结论云南省PAstV-4流行病学调查将有利于中国AstV的预防及治疗。 展开更多

关键词 猪星状病毒 逆转录巢式聚合酶链反应 流行病学

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博尔纳病毒在宁夏的人和动物感染的检测 被引量：3

16

作者 刘建 马彦 +2 位作者 张颖 王振海 谢鹏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期389-393,共5页

目的对临床VE患者以及其本人接触动物的检测,探讨BDV在宁夏地区的感染状况及感染机制,并分析BDV核酸和转化后的氨基酸序列,构建病毒种系发生的来源。方法应用巢式逆转录酶聚合酶链反应结合荧光定量PCR检测患者及其接触的动物的外周血单... 目的对临床VE患者以及其本人接触动物的检测,探讨BDV在宁夏地区的感染状况及感染机制,并分析BDV核酸和转化后的氨基酸序列,构建病毒种系发生的来源。方法应用巢式逆转录酶聚合酶链反应结合荧光定量PCR检测患者及其接触的动物的外周血单核细胞的p24和p40基因片段。对检测阳性标本进行连接测序,应用MEGA和DnaSP4.0软件对测序结果同国外的标准株HE80、H1766、strainV等进行核酸和氨基酸序列对比分析,并构建病毒基因的系统发生树。结果在60例VE患者及其接触的710绵羊中,PCR检测发现有3例阳性,阳性检出率5%;9头绵羊阳性,阳性检出率为1.27%。基因聚合分析显示人和动物BDV的核酸序列和编码氨基酸序列与德国马源性的HE80株同源性高达100%,重构基因系统发生树可见宁夏VE患者和牛羊BDV核苷酸序列与国外的标准株形成宁夏-德国-日本的混合支系,同时宁夏绵羊BDV序列也形成了一个独立的支系。结论宁夏地区人和牛羊存在BDV的自然感染,并且人的感染存在动物源性,其传染途径很可能是呼吸道的传播可能引起脑炎的非特异性的临床症状,病毒在种系发生中与德国马源性HE80株有极高的同源性,病毒可能由国外引入本土,不排除病毒株变异的可能,人和绵羊之间存在相互传染的可能。 展开更多

关键词 博尔纳病毒 感染 巢式逆转录实时荧光定量pcr

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骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因全序列RACE扩增方法的建立 被引量：2

17

作者 唐博 曹贵方 +1 位作者 杨银凤 王秀梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期151-156,共6页

为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 c... 为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 cDNA的3′末端序列;采用反向嵌套PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列,设计了1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1cDNA的5′末端序列。结果显示,获得了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因的全序列。证实,RACE技术用于防御素基因的扩增是可行的。 展开更多

关键词 Β-防御素 3’RACE 5’RACE 锚定pcr 反向嵌套pcr 骆驼

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两种浓缩方法在水样脊髓灰质病毒检测中的应用 被引量：2

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作者 杨明 沈杨 +2 位作者 许海 王昆鹏 吴明红 《上海大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期465-470,共6页

水样中病毒颗粒的有效浓缩和富集是病毒检测的首要任务.分别应用氯化钠-氯化铝沉淀法和滤膜吸附法,对模拟水样和实际水样的脊髓灰质病毒进行浓缩分离.经过核酸提取后,通过RT-nest-PCR分子生物学技术扩增特异性核酸片段检测病毒,结果发现... 水样中病毒颗粒的有效浓缩和富集是病毒检测的首要任务.分别应用氯化钠-氯化铝沉淀法和滤膜吸附法,对模拟水样和实际水样的脊髓灰质病毒进行浓缩分离.经过核酸提取后,通过RT-nest-PCR分子生物学技术扩增特异性核酸片段检测病毒,结果发现,两种浓缩方法对水样中的脊髓灰质病毒都能有效地回收富集及检测.通过计算,分别检测到污水处理厂进水口中病毒存在所用水样的有效体积,氯化钠-氯化铝沉淀法为3.5 mL,滤膜吸附法为2.1 mL.应用氯化钠-氯化铝沉淀法对另外3个污水处理厂水样的病毒检测发现,进水口和出水口均有脊髓灰质病毒的存在.另外,制备了包含脊髓灰质病毒特异性核酸片段的阳性质粒标准品,为开展水体环境中有害病毒的检测工作奠定研究基础. 展开更多

关键词 氯化钠-氯化铝沉淀法 滤膜吸附法 肠道病毒 逆转录pcr 巢式pcr

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广东省传染性非典型肺炎病例的SARS冠状病毒分离株的分子生物学鉴定 被引量：7

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作者 陈秋霞 黄吉城 +7 位作者 郑夔 周惠琼 郑焕英 鄢心革 黄平 刁丽梅 张万里 陈经雕 《华南预防医学》 2003年第3期26-28,共3页

目的　对广东省部分传染性非典型肺炎 (SARS)病例的SARS冠状病毒分离株进行鉴定 ,并初步建立SARS冠状病毒PCR检测方法。方法　采集临床诊断为SARS病例的咽漱液标本 ,进行多种细胞分离培养 ,对出现病变的细胞分离物采用冠状病毒特异引物... 目的　对广东省部分传染性非典型肺炎 (SARS)病例的SARS冠状病毒分离株进行鉴定 ,并初步建立SARS冠状病毒PCR检测方法。方法　采集临床诊断为SARS病例的咽漱液标本 ,进行多种细胞分离培养 ,对出现病变的细胞分离物采用冠状病毒特异引物通过逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)及巢式聚合酶链反应 (Nested PCR)进行扩增 ,并对部分扩增片段进行序列测定 ,应用DNASTAR软件分析比较。同时采用间接免疫荧光 (IFA)和ELISA法检测上述患者血清中SARS冠状病毒IgG抗体。结果　对 2 1例SARS患者的细胞分离物进行PCR扩增 ,结果均阳性 ,其中 1 2份患者咽漱液标本PCR扩增结果也阳性 ,序列测定及基因分析表明 ,广东省SARS病例的病毒分离株为冠状病毒 ,其基因序列与WHO公布的SARS基因序列一致 ,氨基酸序列与目前已知的冠状病毒同源性为 5 8%～ 76 %。同时对 2 1例患者进行血清学检测 ,其中IFA检测有 9例阳性 ,ELISA检测有 1 2例阳性。结论　从广东省部分SARS病例标本中分离的病毒株是一种新的冠状病毒 ,PCR检测具有早期。 展开更多

关键词 广东 传染性非典型肺炎 病例 SARS 冠状病毒 严重急性呼吸综合征 诊断 分子生物学鉴定

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首次从深圳市登革热患者血清中分离到一株登革4型病毒 被引量：5

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作者 周丽 阳帆 +2 位作者 刘建军 杨洪 张海龙 《中国卫生检验杂志》 CAS 2008年第6期1010-1012,共3页

目的:对深圳市2005年登革热病原体进行分离鉴定。方法:采用酶链免疫吸附试验法和胶体金免疫层析法检测登革热疑似患者血清中的特异性IgM和IgG抗体。用C6/36细胞对早期病例血清进行病毒分离,以MGB荧光PCR方法鉴定。用逆转录-套式PCR方法... 目的:对深圳市2005年登革热病原体进行分离鉴定。方法:采用酶链免疫吸附试验法和胶体金免疫层析法检测登革热疑似患者血清中的特异性IgM和IgG抗体。用C6/36细胞对早期病例血清进行病毒分离,以MGB荧光PCR方法鉴定。用逆转录-套式PCR方法对其进行型别鉴定。结果:从8份标本中成功分离到一株登革病毒,经逆转录-套式PCR方法鉴定为登革4型病毒,将其命名为DEN4-SZ0524。结论:首次从2005年登革热患者血清中分离到一株登革4型病毒,为进一步研究和控制该地区登革热提供了科学依据。 展开更多

关键词 登革热 登革4型病毒 病毒分离 逆转录-套式pcr

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