目的建立一种基于叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)的定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)的方法,以快速检测甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)的感染性。方法将热灭活的HAV样品经PMA处理和曝光,通过RT-qPCR检测体系进行检测,优...目的建立一种基于叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)的定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)的方法,以快速检测甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)的感染性。方法将热灭活的HAV样品经PMA处理和曝光,通过RT-qPCR检测体系进行检测,优化PMA预处理浓度、孵育时间以及光解时间,建立甲肝病毒PMART-qPCR检测方法。以建立的检测方法对感染性病毒与灭活病毒混合样品、不同浓度的灭活病毒以及感染性病毒进行检测,评估其检测病毒感染性的效果。结果PMA-RT-qPCR检测方法的PMA浓度确定为50μmol/L,4℃避光孵育30min,光解30min。对热灭活HAV的RT-qPCR检测结果显示,PMA处理组与未处理组Ct值差异(ΔCt)>3.78;而对活病毒(10~2CCID_(50)/mL~10~7CCID_(50)/mL)的ΔCt值<0.5。该方法可最低分辨9 CCID_(50)的活病毒,在感染性病毒与灭活病毒混合物中检出最低27 CCID_(50)的活病毒。结论本研究建立的PMA-RT-qPCR无细胞培养方法为判断HAV的感染性提供了快速、便捷的检测方法。展开更多
为建立一种快速准确的藏羊巨型住肉孢子虫(Sarcocystis gigantea)的临床检测方法,本研究基于巨型住肉孢子虫SPFH-SG基因,通过缓殖子荧光定量标准曲线的建立,敏感性、重复性、特异性试验验证,成功建立了SYBR Green Ⅰ的荧光定量PCR(qPCR...为建立一种快速准确的藏羊巨型住肉孢子虫(Sarcocystis gigantea)的临床检测方法,本研究基于巨型住肉孢子虫SPFH-SG基因,通过缓殖子荧光定量标准曲线的建立,敏感性、重复性、特异性试验验证,成功建立了SYBR Green Ⅰ的荧光定量PCR(qPCR)检测方法并检测了423份藏羊样本。结果表明,该诊断方法特异性较强、灵敏度较高且重复性好,血液与食道肌样品的检测结果符合率达98.9%,能够准确地进行藏羊巨型住肉孢子虫的生前快速检测和诊断。展开更多
为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特...为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特异性引物和探针,构建质粒标准品pUC57-BPIV3-P、pUC57-BRSV-P、pUC57-IBRV-gI和PVC57-BVDV-5'UTR,并经PCR和测序鉴定正确后等体积比混合作为模板,采用方阵法对引物、探针和各反应条件等的优化,初步建立引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)4种病毒性病原的多重TaqMan qPCR检测方法。结果显示,建立的多重qPCR仅能特异性检测BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV,与引起BRDC其他病原的牛冠状病毒(BCoV)、牛支原体(M-bov)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm)、牛溶血性曼氏杆菌(Mh)均无交叉反应;对1:1:1:1混合的4种质粒标准品的检测限均为10拷贝/μL;组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%;以本研究方法和国家标准检测法对149份临床样品平行检测BVDV,结果显示两种方法的总符合率分别为80.85%,以本研究方法和已有专利中的多重qPCR方法对149份临床样品平行检测BPIV3、BRSV、IBRV,结果显示两种方法的总符合率分别为75.07%、100%和92.83%,临床样品中存在4种病原8种混合感染情况。结果表明,本研究建立的致BRDC的4种病毒多重Taq Man qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV这4种常见牛病毒的鉴别检测和流行病学调查,为养殖场BRDC的防控奠定基础。展开更多
文摘为建立一种快速准确的藏羊巨型住肉孢子虫(Sarcocystis gigantea)的临床检测方法,本研究基于巨型住肉孢子虫SPFH-SG基因,通过缓殖子荧光定量标准曲线的建立,敏感性、重复性、特异性试验验证,成功建立了SYBR Green Ⅰ的荧光定量PCR(qPCR)检测方法并检测了423份藏羊样本。结果表明,该诊断方法特异性较强、灵敏度较高且重复性好,血液与食道肌样品的检测结果符合率达98.9%,能够准确地进行藏羊巨型住肉孢子虫的生前快速检测和诊断。
文摘为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特异性引物和探针,构建质粒标准品pUC57-BPIV3-P、pUC57-BRSV-P、pUC57-IBRV-gI和PVC57-BVDV-5'UTR,并经PCR和测序鉴定正确后等体积比混合作为模板,采用方阵法对引物、探针和各反应条件等的优化,初步建立引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)4种病毒性病原的多重TaqMan qPCR检测方法。结果显示,建立的多重qPCR仅能特异性检测BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV,与引起BRDC其他病原的牛冠状病毒(BCoV)、牛支原体(M-bov)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm)、牛溶血性曼氏杆菌(Mh)均无交叉反应;对1:1:1:1混合的4种质粒标准品的检测限均为10拷贝/μL;组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%;以本研究方法和国家标准检测法对149份临床样品平行检测BVDV,结果显示两种方法的总符合率分别为80.85%,以本研究方法和已有专利中的多重qPCR方法对149份临床样品平行检测BPIV3、BRSV、IBRV,结果显示两种方法的总符合率分别为75.07%、100%和92.83%,临床样品中存在4种病原8种混合感染情况。结果表明,本研究建立的致BRDC的4种病毒多重Taq Man qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV这4种常见牛病毒的鉴别检测和流行病学调查,为养殖场BRDC的防控奠定基础。
文摘目的 基于ICH Q2(R2)和Q14,建立冻干甲型肝炎减毒活疫苗(简称冻甲疫苗)感染性滴度细胞培养-RT-qPCR快速检测方法,并对方法进行优化及验证。方法 采用分析质量源于设计(Analytical Quality by Design,AQbD)理念,通过分析目标概况(Acceptance Test Procedure,ATP)设定、风险识别与实验设计(Design of Experiment,DoE),建立细胞培养-RT-qPCR联合检测平台。以病毒核酸扩增循环阈值(cycle threshold,Ct)为响应指标,优化细胞密度、病毒培养温度和时间等关键参数。验证方法的专属性、线性、中间精密度,确定定量范围,Bland-Altman分析与传统滴度检测方法的一致性。结果 共识别13个主要风险因素,确定方法的最适反应条件为:细胞密度(1~2)×10^(5)个/mL;病毒稀释梯度间距4倍;96孔细胞培养板有边缘效应;病毒吸附温度和时间为37℃吸附60 min,病毒培养温度和时间为35℃培养72 h;PCR无位置效应;变性温度和时间为90℃变性63 s;逆转录温度和时间为60℃逆转录15 min;计算模型为双对数线性模型。该方法具有良好的专属性(灭活病毒对照Ct值> 28)、线性(R2=0.966)及中间精密度[几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)≤9.28%],定量范围覆盖5.0~8.0 lgCCID50/mL。该方法与传统方法检测结果差值的95%一致性界限(95%limits of agree-ment,95%LoA)为-0.06~0.41 lgCCID50/mL。结论 建立的细胞培养-RT-qPCR检测方法将检测周期由传统方法的21~28 d缩短至3 d,且具有定量准确、通量高等优势,为冻甲疫苗工艺过程中及成品甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)滴度检测和批签发效率提升提供了关键技术支持。
