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化脓隐秘杆菌肝素高亲和蛋白的提取、鉴定及其免疫原性分析
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作者 徐登峰 张素辉 +3 位作者 余远迪 杨欢 赵自亮 沈克飞 《中国生物制品学杂志》 2025年第4期413-417,共5页
目的提取化脓隐秘杆菌肝素高亲和蛋白(Trueperella pyogenes heparin high affinity protein,THHAP),经鉴定后,分析其免疫原性,为探讨化脓隐秘杆菌与肝素间的相互作用提供参考。方法用细菌膜蛋白提取试剂盒提取化脓隐秘杆菌表面蛋白,经... 目的提取化脓隐秘杆菌肝素高亲和蛋白(Trueperella pyogenes heparin high affinity protein,THHAP),经鉴定后,分析其免疫原性,为探讨化脓隐秘杆菌与肝素间的相互作用提供参考。方法用细菌膜蛋白提取试剂盒提取化脓隐秘杆菌表面蛋白,经肝素琼脂糖珠吸附、1 mol/L NaCl溶液洗涤、8 mol/L尿素溶液洗脱后,提取THHAP,经SDS-PAGE和液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法鉴定后,进行生物信息学分析。将THHAP免疫15只雌性昆明小鼠,第2次免疫后2周,5只小鼠采集眶前静脉血,分离血清,10只小鼠经腹腔注射9×10^(8)CFU化脓隐秘杆菌,检测免疫保护效果及抗血清溶血抑制活性。结果THHAP形成1条约占蛋白质总含量98%的主带;检测到1767条溶血素(pyolysin,PLO)多肽,占检测到的多肽数的98.06%(1767/1802)。THHAP由1种细胞壁蛋白、11种分泌蛋白、1种脂蛋白、7种膜蛋白、1种细胞质蛋白构成,其中8种蛋白质可能是具有免疫保护性的抗原。用THHAP免疫的小鼠(9/10)能够抵抗化脓隐秘杆菌感染,其抗血清表现出溶血抑制活性。结论从化脓隐秘杆菌表面蛋白中成功提取了THHAP,PLO是其主要成分,能诱导小鼠产生保护性免疫应答。 展开更多
关键词 化脓隐秘杆菌 肝素高亲和蛋白 免疫原性 溶血素
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Carbon Nanotubes Inhibit the Hemolytic Activity of the Pore-Forming Toxin Pyolysin
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作者 Apraku David Donkor Zhengding Su +2 位作者 Himadri S.Mandal Xu Jin Xiaowu(Shirley)Tang 《Nano Research》 SCIE EI CSCD 2009年第7期517-525,共9页
Functionalized carbon nanotubes have already demonstrated great biocompatibility and potential for drug delivery.We have synthesized acid oxidized and non-covalently PEGlyated single-walled carbon nanotubes(SWNTs),whi... Functionalized carbon nanotubes have already demonstrated great biocompatibility and potential for drug delivery.We have synthesized acid oxidized and non-covalently PEGlyated single-walled carbon nanotubes(SWNTs),which were previously prepared for drug delivery purposes,and explored their potential for detoxification in the bloodstream.Our investigations of the binding of SWNTs to a pore-forming toxin pyolysin show that SWNTs prevented toxin-induced pore formation in the cell membrane of human red blood cells.Quantitative hemolysis assay and scanning electron microscopy were used to evaluate the inhibition of hemolytic activity of pyolysin.According to Raman spectroscopy data,human red blood cells,unlike HeLa cells,did not internalize oxidized SWNTs.Molecular modeling and circular dichroism measurements were used to predict the 3-D structure of pyolysin(domain 4)and its interaction with SWNTs.The tryptophan-rich hydrophobic motif in the membrane-binding domain of pyolysin,a common construct in a large family of cholesterol-dependent cytolysins,shows high affinity for SWNTs. 展开更多
关键词 Single-walled carbon nanotubes(SWNT) pore-forming toxin pyolysin hemolytic activity red blood cell protein-nanotube interaction DETOXIFICATION
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牛源化脓隐秘杆菌PLO蛋白的原核截短表达及其溶血活性检测 被引量:12
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作者 周玉龙 高小兵 +5 位作者 范春玲 王密 于红欣 侯喜林 朴范泽 朱战波 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期197-200,共4页
为研究牛源的化脓隐秘杆菌溶血素(PLO)生物学功能,本研究应用PCR方法扩增牛源化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)PLO全基因序列,通过生物信息学方法分析其与猪源A.pyogenes的PLO蛋白差异,并构建了溶血功能区重组表达质粒pQE30-PLO585,在E.coli XL... 为研究牛源的化脓隐秘杆菌溶血素(PLO)生物学功能,本研究应用PCR方法扩增牛源化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)PLO全基因序列,通过生物信息学方法分析其与猪源A.pyogenes的PLO蛋白差异,并构建了溶血功能区重组表达质粒pQE30-PLO585,在E.coli XL1Blue中用IPTG诱导表达。结果表明,扩增到PLO蛋白基因ORF为1 605 bp,编码535个氨基酸,与猪源PLO的核苷酸序列同源性为97.4%,氨基酸同源性为97.2%,在生物学活性功能区没有发生改变。表达的PLO蛋白溶血功能区重组蛋白能够被阳性血清识别,而且具有溶解绵羊红细胞的活性,产生β溶血现象。本研究获得了牛源A.pyogenes截短重组PLO蛋白,并证明PLO具有β溶血功能与较好的抗原性。 展开更多
关键词 牛化脓隐秘杆菌 PLO蛋白 生物学功能
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山羊化脓隐秘杆菌溶血素抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及应用 被引量:5
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作者 徐登峰 张素辉 +4 位作者 余远迪 许国洋 赵扬扬 付利芝 沈克飞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期460-464,共5页
目的建立山羊化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)抗体的间接ELISA检测方法,并进行验证及应用。方法通过E.coli表达系统表达重组溶血素(recombinant pyolysin,r PLO),采用Ni-NTA亲和层析进行纯化。以r PLO作为包被抗原,HRP标记的兔抗山羊... 目的建立山羊化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)抗体的间接ELISA检测方法,并进行验证及应用。方法通过E.coli表达系统表达重组溶血素(recombinant pyolysin,r PLO),采用Ni-NTA亲和层析进行纯化。以r PLO作为包被抗原,HRP标记的兔抗山羊IgG抗体为二抗,建立检测山羊化脓隐秘杆菌PLO抗体的间接ELISA法。采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度(3.5、0.7、0.14和0.05μg/mL)及最佳二抗稀释度(1∶10000、1∶20000、1∶40000),同时验证方法的特异性、灵敏性及精密性。分别采用琼脂糖凝胶扩散试验和优化的间接ELISA法检测15份化脓隐秘杆菌自然感染的山羊血清,计算两者符合率;并采用优化的间接ELISA法检测360份临床山羊血清样本。结果纯化的r PLO相对分子质量约34000,纯度达90%。优化后ELISA法最佳抗原包被浓度为0.14μg/mL,二抗稀释度为1∶40000。优化后的ELISA法对E.coli、链球菌和伪结核棒状杆菌的阳性血清均无交叉反应;可检测出1∶800稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均<10%。两种方法检测15份化脓隐秘杆菌自然感染山羊血清阳性检出率均为100%,符合率为100%;采用优化方法检测360份山羊血清的阳性率为24.1%(87/360)。结论成功建立了用于检测山羊化脓隐秘杆菌PLO抗体的间接ELISA法,该方法具有良好的特异性、灵敏性及精密性。 展开更多
关键词 山羊 化脓隐秘杆菌 溶血素 抗体 ELISA法
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化脓隐秘杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 刘二龙 卢丽 +3 位作者 唐婕 吕英姿 郑高彬 蒋湘 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第5期1093-1097,共5页
本试验旨在建立检测化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,A.pyogenes)特异、灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank公布的化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因高保守序列,设计特异性引物和探针建立检测体系,用于化脓... 本试验旨在建立检测化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,A.pyogenes)特异、灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank公布的化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因高保守序列,设计特异性引物和探针建立检测体系,用于化脓隐秘杆菌的快速检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行检测。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法仅对化脓隐秘杆菌的检测结果为阳性;该方法最低检测DNA浓度为77.6fg,最低检测细菌浓度为63CFU/mL。采用本研究建立的方法检测23份林麝临床病例样品,共鉴定出16株化脓隐秘杆菌,与API Coryne生化鉴定方法的结果相同。本研究为化脓隐秘杆菌的检测提供了一种灵敏、特异、快速的检测方法,其可用于化脓隐秘杆菌的诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 化脓隐秘杆菌 TaqMan实时荧光定量PCR溶血素(PLO)
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化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的原核表达及其溶血活性鉴定 被引量:1
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作者 孟祥莉 母晓宇 +5 位作者 刘晓丹 徐凝 王璞 高明春 张文龙 王君伟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期477-480,共4页
为研究化脓隐秘杆菌致病机制及其病原学诊断方法,本研究克隆了编码化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的plo基因,并构建重组表达质粒pET-plo,转化大肠杆菌Rosetta(D E3)感受态细胞中诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组蛋白约为62 ku,wester... 为研究化脓隐秘杆菌致病机制及其病原学诊断方法,本研究克隆了编码化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的plo基因,并构建重组表达质粒pET-plo,转化大肠杆菌Rosetta(D E3)感受态细胞中诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组蛋白约为62 ku,western blot分析表明表达的重组蛋白可以与鼠抗化脓隐秘杆菌血清发生反应。采用重组蛋白免疫新西兰白兔制备的多克隆抗体效价达到1∶128 000,western blot和琼脂双扩散试验表明制备的多克隆抗体能够与天然PLO蛋白发生反应。溶血试验表明重组蛋白能够溶解红细胞,制备的多克隆抗体能有效中和重组蛋白的溶血活性。 展开更多
关键词 溶血素 原核表达 鉴定 多克隆抗体
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化脓隐秘杆菌溶血素和铁结合蛋白的抗体应答分析 被引量:2
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作者 刘德珍 沈克飞 +2 位作者 付利芝 徐登峰 张素辉 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期1326-1330,共5页
目的对化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)溶血素(pyolysin,PLO)和铁结合蛋白(iron-binding protein,IBP)的抗体应答情况进行分析。方法采用腹腔注射途径建立化脓隐秘杆菌小鼠感染模型,观察不同剂量细菌对小鼠的致死性和注射部位形成... 目的对化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)溶血素(pyolysin,PLO)和铁结合蛋白(iron-binding protein,IBP)的抗体应答情况进行分析。方法采用腹腔注射途径建立化脓隐秘杆菌小鼠感染模型,观察不同剂量细菌对小鼠的致死性和注射部位形成的组织病变。制备化脓隐秘杆菌灭活抗原,采用肌肉注射途径免疫45只雌性昆明小鼠和10只山羊,每只小鼠0.2 mL,每只山羊1 mL,均进行3次免疫,每次间隔2周,第3次免疫后2周采血分离血清。采用ELISA法测定感染小鼠、健康圈养羔羊、化脓隐秘杆菌灭活抗原免疫小鼠和山羊血清中抗PLO和IBP的IgG抗体水平。结果注射部位出现化脓和皮肤坏死的小鼠血清中能检出高水平的抗PLO和IBP抗体;无组织病变小鼠血清中仅能检测到低水平的抗IBP抗体;连续注射无组织病变剂量细菌的小鼠血清能检出抗PLO和IBP抗体。圈养羔羊血清抗PLO抗体阳性率高,而抗体水平低。免疫小鼠和山羊血清中均能检出抗IBP抗体,但部分动物检测不出抗PLO抗体。结论IBP是化脓隐秘杆菌感染和灭活疫苗免疫诱导抗体应答的主要抗原之一,PLO抗体水平具有反映感染所造成的组织损伤与灭活疫苗免疫效果的潜力。 展开更多
关键词 化脓隐秘杆菌 感染 免疫 溶血素 铁结合蛋白 抗体应答
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牛源化脓隐秘杆菌溶血素的重组表达及其间接ELISA检测方法的建立 被引量:1
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作者 赵宇 周思旋 +7 位作者 卢昱希 张涛 唐远江 陶小艳 赵春萍 黄波 武俊达 史开志 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第20期75-80,共6页
为了建立检测牛源化脓隐秘杆菌抗体的间接ELISA检测方法,试验对分离的牛源化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因序列进行分析,截去信号肽与跨膜区域后进行碱基优化,合成PLO基因片段,连接至原核表达载体pET-30a中,转化至Arctic Express(... 为了建立检测牛源化脓隐秘杆菌抗体的间接ELISA检测方法,试验对分离的牛源化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因序列进行分析,截去信号肽与跨膜区域后进行碱基优化,合成PLO基因片段,连接至原核表达载体pET-30a中,转化至Arctic Express(DE3)大肠杆菌感受态后诱导表达并纯化,以纯化后的重组蛋白作为抗原包被96孔板,建立牛源化脓隐秘杆菌PLO抗体间接ELISA检测方法,确定检测方法的临界值、特异性、敏感性、重复性,并用建立的方法对临床血清样本进行检测。结果表明:成功构建了重组原核表达质粒pET30a-PLO,实现了重组蛋白在Arctic Express(DE3)大肠杆菌感受态中的表达,并建立了用于检测牛源化脓隐秘杆菌PLO抗体的间接ELISA检测方法。该检测方法的临界值为0.354,与常见牛细菌阳性血清无交叉反应,阳性血清稀释至320倍检测仍高于临界值;批内、批间检测变异系数均小于5%;对10份已知阳性血清进行检测,阳性检出率为100%,80份临床牛血清的阳性检出率为21.25%(17/80)。说明该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可用于牛源化脓隐秘杆菌感染的快速检测与流行病学调查。 展开更多
关键词 化脓隐秘杆菌 溶血素蛋白 原核表达 间接ELISA 抗体
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