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人巨细胞病毒pp150抗原区的原核表达及初步应用 被引量:3
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作者 李国才 严华 +4 位作者 季明春 申厚凤 陈红菊 焦红梅 万兵 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期169-171,共3页
To make up an engineered E.coli strain for expression of antigenic determinants of pp150 of human cytomegalovirus,the gene encoding the 420-752 amino acid peptides of pp150 was amplified from human cytomegalovirus AD1... To make up an engineered E.coli strain for expression of antigenic determinants of pp150 of human cytomegalovirus,the gene encoding the 420-752 amino acid peptides of pp150 was amplified from human cytomegalovirus AD169 by RT-PCR and cloned into Nde I/BamHⅠ sites in pET30a.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3)and a foreign protein about 35 kD were detected by SDS-PAGE and Western blotting assay.The antiserum prepared by using prokaryotic expressed product as antigen turned to be against pp150 specifically and had low neutralization effect to HCMV. 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 pp150 抗原 原核表达 疫苗 HCMV
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人巨细胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表达与IgM捕获ELISA方法建立和应用 被引量:2
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作者 孙卫国 孙雯娜 +2 位作者 侯江厚 杨秉芬 张灵霞 《现代检验医学杂志》 CAS 2015年第5期1-4,共4页
目的 原核系统内表达并纯化巨细胞病毒pp150-gp52融合蛋白优势抗原表位,建立IgM捕获ELISA方法并应用.方法 通过重叠PCR技术扩增获得巨细胞病毒pp150-gp52优势片段核酸序列,在原核系统内可溶性表达DsbCpp150-gp52融合蛋白并纯化,用Wester... 目的 原核系统内表达并纯化巨细胞病毒pp150-gp52融合蛋白优势抗原表位,建立IgM捕获ELISA方法并应用.方法 通过重叠PCR技术扩增获得巨细胞病毒pp150-gp52优势片段核酸序列,在原核系统内可溶性表达DsbCpp150-gp52融合蛋白并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的特异性和应用价值.结果 纯化获得的融合蛋白DsbC-pp150-gp52经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份临床阳性血清和60份健康人血清.其中以酶标记DsbC-pp150-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率96.7%,阴性检出率100%,初步验证DsbC-pp150-gp52融合肽具有非常好的抗原特异性.结论 融合蛋白DsbC-pp150-gp52在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,获得的高纯度重组融合蛋白具有抗原性和特异性强的特点,采用IgM捕获ELISA的实验方法,可开发检测试剂盒用于风疹病毒的早期检测. 展开更多
关键词 巨细胞病毒 pp150蛋白 gp52蛋白 可溶性表达
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人巨细胞病毒大外膜磷蛋白pp150羧基末端的高效表达及初步应用 被引量:4
3
作者 周铁群 沈月雷 +3 位作者 邱平 王剑锋 戴斌 李德富 《微生物学免疫学进展》 1999年第2期28-31,共4页
以基因工程抗原取代天然抗原用于人巨细胞病毒(HCMV)感染的诊断,具有广阔的前景。为此,分离HCMV大外膜磷蛋白pp150基因ORF3端434bp(编码羧基末端aa943~aa1048)的DNA片段,导入带有高水平... 以基因工程抗原取代天然抗原用于人巨细胞病毒(HCMV)感染的诊断,具有广阔的前景。为此,分离HCMV大外膜磷蛋白pp150基因ORF3端434bp(编码羧基末端aa943~aa1048)的DNA片段,导入带有高水平转录启动子Ptrc和六个串联组氨酸的原核表达载体pTrcHis,在大肠杆菌中得到高效表达,SDSPAGE显示一明显的分子量为156kD的融合蛋白条带,LKB激光扫描占菌体总蛋白的51%以上,并且以可溶性形式存在。表达产物经高效特异性纯化后,ELISA结果表明其能够与HCMVIgM阳性血清呈特异反应,为建立新一代HCMVIgM检测试剂盒打下了基础。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 大外膜磷蛋白 pp150 羧基末端
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人巨细胞病毒pp150基因的原核表达及抗原性分析 被引量:3
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作者 王清 张文卿 于红 《青岛大学医学院学报》 CAS 2003年第1期23-25,28,共4页
①目的 构建人巨细胞病毒 (HCMV) pp15 0的原核高效表达系统 ,制备用于急性、活动性HCMV感染血清学诊断的基因工程抗原。②方法 PCR扩增HCMVpp15 0抗原决定簇 (84 0~ 10 4 8aa)编码基因片段 ,分别插入原核表达载体 pMAL p2、pET 2 8... ①目的 构建人巨细胞病毒 (HCMV) pp15 0的原核高效表达系统 ,制备用于急性、活动性HCMV感染血清学诊断的基因工程抗原。②方法 PCR扩增HCMVpp15 0抗原决定簇 (84 0~ 10 4 8aa)编码基因片段 ,分别插入原核表达载体 pMAL p2、pET 2 8a ,转化宿主菌E .coli.诱导表达 ,经麦芽糖亲和层析树脂纯化 ,以Western Blot及间接ELISA法鉴定其抗原性。③结果 重组表达质粒 pMAL p2 pp15 0可在E .coli.DH5α中有效表达 ,表达产物经SDS PAGE电泳后 ,凝胶成像系统分析显示相对分子质量约为 6 .4万 ,约占菌体蛋白的 10 %。而重组质粒pET 2 8a pp15 0未见明显表达带。Western Blot检测 ,阳性识别率为 80 % (12 / 15 )。用此蛋白包被ELISA板 ,检测正常孕妇血清 ,阳性率为 6 .5 % (17/ 2 6 3)。与本室制备的全病毒抗原ELISA的诊断符合率为 96 %。④结论此重组蛋白具有良好的抗原性 ,进一步完善后可用于HCMV急性和活动性感染的诊断。 展开更多
关键词 巨细胞病毒属 基因 pp150 原核表达 血清诊断
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人巨细胞病毒gp52-pp65-pp150的融合表达及应用 被引量:2
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作者 张乐海 马丽霞 +3 位作者 王世富 姜忠强 彭振居 王素兰 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2011年第1期12-16,共5页
目的克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)特异性强的抗原决定簇基因,制备并纯化重组蛋白,并通过组装成捕获法ELISA试剂盒对其抗原性进行评价。方法提取人巨细胞病毒AD169株的DNA,用PCR扩增HCMV的pp150(UL32)、gp52(UL44)... 目的克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)特异性强的抗原决定簇基因,制备并纯化重组蛋白,并通过组装成捕获法ELISA试剂盒对其抗原性进行评价。方法提取人巨细胞病毒AD169株的DNA,用PCR扩增HCMV的pp150(UL32)、gp52(UL44)、pp65(UL83)基因片段,将3个基因片段串联克隆至原核表达载体pGEX-5x-3进行融合表达和纯化,采用SDS-PAGE电泳法和免疫印迹法(Western blot)对融合基因的克隆及重组蛋白的表达进行鉴定,并组装成捕获法ELISA试剂盒对临床标本进行检测,评价试剂盒的各项性能指标。结果经序列测定各基因片段序列正确,成功构建了HCMV的高效表达融合基因的重组载体gp52-pp65-pp150,表达的融合蛋白经Western blot分析,分子量在50 ku,具有良好的抗原性。将该蛋白组装成捕获法ELISA试剂盒,经232份血清标本的检测,与进口试剂盒相比,本试剂盒的灵敏度为93.91%;特异度为97.43%;粗一致性为96.1%;约登指数为0.901;批内变异系数为12.4%;稳定性良好,37℃保存试剂与4℃保存试剂进行对照试验,变异系数为13%。结论本实验通过基因工程技术的方法有效地获取纯度较高、特异性强的HCMV抗原(gp52-pp65-pp150重组蛋白),该融合蛋白构建的捕获法ELISA试剂与进口试剂盒比对,具有较高的灵敏度和特异性,经初步临床应用,具有进一步开发应用的价值,为不同临床感染阶段的HCMV的检测提供了技术基础。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 gp52-pp65-pp150 免疫球蛋白M 融合基因 原核表达 免疫印迹法
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重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV-IgM
6
作者 王清 王锡波 +3 位作者 徐龙强 于维林 于红 张文卿 《第四军医大学学报》 北大核心 2005年第19期1764-1767,共4页
目的: 探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于免疫滴金技术检测血清中抗HCMV-IgM的诊断价值. 方法: PCR扩增HCMV pp150抗原决定簇(840~1048aa)编码基因片段,插入原核表探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于胶体金免疫... 目的: 探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于免疫滴金技术检测血清中抗HCMV-IgM的诊断价值. 方法: PCR扩增HCMV pp150抗原决定簇(840~1048aa)编码基因片段,插入原核表探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术(CGIDA)检测血清中抗HCMV-IgM的诊断价值. 达载体pMAl-p2,转化宿主菌E.coli,诱导表达及纯化. 重组抗原CGIDA与酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对比检测. 结果: 重组抗原CGIDA与ELISA试剂盒比较,符合率达96.0%;CGIDA检测HCMV-IgM的敏感度为74.2%,特异性为100%. 结论: 重组抗原pp150用于 CGIDA对HCMV的早期诊断,具有较好应用价值. 展开更多
关键词 巨细胞病毒 基因pp150 原核表达 胶体金 免疫斑点法
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人巨细胞病毒pp150-pp65蛋白的表达与应用
7
作者 金玉芬 李艳蕾 +2 位作者 华艳 张晓刚 于庭 《中国实验诊断学》 2012年第12期2193-2196,共4页
目的构建并表达人巨细胞病毒(HCMV)pp150-pp65蛋白,将纯化的重组蛋白制备成胶体金试剂盒对其抗原性进行评价。方法采用PCR方法扩增HCMV pp150-pp65基因片段,连接到原核表达载体pET28a进行表达并纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定... 目的构建并表达人巨细胞病毒(HCMV)pp150-pp65蛋白,将纯化的重组蛋白制备成胶体金试剂盒对其抗原性进行评价。方法采用PCR方法扩增HCMV pp150-pp65基因片段,连接到原核表达载体pET28a进行表达并纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并与北京英诺特生物技术有限公司合作研制出巨细胞IgG/IgM抗体联合检测试剂盒(胶体金法),与进口试剂盒(酶免法)进行临床标本比对试验。结果成功构建了HCMV的高效表达载体pET28a-pp150-pp65,并得到分子量在45kd的高表达蛋白,具有良好的抗原性。将该蛋白制备成胶体金试剂盒,经600份血清标本的检测,与进口CMV-IgG试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为92.7%和83.1%,总的符合率为90.2%;与进口CMV-IgM试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为88.1%和89.2%,总的符合率为88.5%,稳定性良好。结论高效表达纯化的pp150-pp65重组蛋白抗原性强,利用其建立的胶体金试剂盒与国产已上市试剂盒和进口试剂盒比对,不仅具有较高的灵敏度和特异性,而且经初步临床应用,表明该试剂盒能检测不同临床感染阶段的患者,具有较好的市场前景。 展开更多
关键词 巨细胞病毒 pp150-pp65 巨细胞IgG IgM抗体联合检测试剂盒 胶体金法
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人巨细胞病毒重组PP150的原核表达及其酶联免疫吸附试验检测
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作者 王清 孙树红 兰翠霞 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期398-401,共4页
目的探讨人巨细胞病毒重组抗原PP150的原核表达及在酶联免疫吸附试验检测(ELISA)中的应用。方法采用基因工程方法组建含有巨细胞病毒PP150蛋白强抗原决定簇基因的重组抗原克隆,进行诱导表达及纯化,在此基础上,以纯化的重组PP150蛋白作... 目的探讨人巨细胞病毒重组抗原PP150的原核表达及在酶联免疫吸附试验检测(ELISA)中的应用。方法采用基因工程方法组建含有巨细胞病毒PP150蛋白强抗原决定簇基因的重组抗原克隆,进行诱导表达及纯化,在此基础上,以纯化的重组PP150蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包被,作用时间及底物的选择),确定了判定标准,建立了检测HCMVIgM抗体的间接ELISA方法.用此方法检测了266份血清样品,并与DSL公司ELISA试剂盒检测结果相比较。结果重组表达质粒pMAL-P2-PP150可在E.coliDH5a中有效表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后,凝胶成像系统分析显示相对分子质量约为Mr64000,约占菌体蛋白的10%。Western-blot检测,阳性识别率为80.0(%1/215)。用此蛋白包被ELISA板,检测正常孕妇血清,诊断符合率为98.1%,敏感性达88.2%,特异性100%。应用该方法对正常人血清样品检测HCMV-IgM,阳性率为4.1%。结论该重组蛋白具有良好的抗原性,可望替代HCMV感染检测中的全病毒ELISA试剂盒。 展开更多
关键词 巨细胞病毒 基因pp150 原核表达 ELISA
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胶体金免疫斑点法检测人巨细胞病毒pp150抗体 被引量:3
9
作者 吕贯廷 郭晏海 +3 位作者 卢冰 陈蕤 李丁 阎小君 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期358-359,共2页
目的 建立一种简便、快速的检测血清中人巨细胞病毒 (HCMV)抗 pp15 0抗体的胶体金免疫斑点法。 方法 采用Frens法制备胶体金颗粒 ,标记葡萄球菌A蛋白 (SPA) ,将本所利用基因工程技术生产的 pp15 0抗原固定于 0 45 μm孔径的硝酸纤维... 目的 建立一种简便、快速的检测血清中人巨细胞病毒 (HCMV)抗 pp15 0抗体的胶体金免疫斑点法。 方法 采用Frens法制备胶体金颗粒 ,标记葡萄球菌A蛋白 (SPA) ,将本所利用基因工程技术生产的 pp15 0抗原固定于 0 45 μm孔径的硝酸纤维素膜上 ,制成免疫斑点检测装置。血清中抗pp15 0IgG与硝酸纤维素膜上的抗原结合 ,然后滴加胶体金标记的SPA ,在膜上可形成肉眼可见的红色斑点。结果 胶体金免疫斑点法与ELISA试剂盒对比检测了 2 0 0份临床确诊血清标本中抗 pp15 0IgG抗体 ,胶体金法的特异性和敏感性分别为 92 %和 90 %。 结论 胶体金免疫斑点法检测血清中的抗 pp15 0抗体特异性、灵敏度较高 ,简便快速 。 展开更多
关键词 胶体金 免疫斑点法 检测 人巨细胞病毒 pp150抗体
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人巨细胞病毒pp150抗原区基因片段的克隆与表达
10
作者 李国才 季明春 +2 位作者 薛方明 严华 申厚凤 《江苏农学院学报》 CSCD 2003年第4期16-18,22,共4页
为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗,根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物,利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段。序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100%。将此基因片段克... 为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗,根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物,利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段。序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100%。将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35 ku的外源蛋白。表达产物免疫小鼠,所得抗体具有低滴度中和作用。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 ppl50抗原区 基因克隆 基因表达 核酸疫苗 抗原决定簇 原核表达
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人巨细胞病毒PP150蛋白C端多肽与gp52蛋白片段的融合表达 被引量:2
11
作者 李越希 陶开华 +4 位作者 汪兴太 李长贵 周宗安 郁兴明 黄培堂 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期556-559,共4页
目的 将人巨细胞病毒PP1 50蛋白C端多肽与gp52蛋白片段融合 ,构建表达该融合蛋白的工程菌。方法 合成PP1 50蛋白C端 2 5个氨基酸的基因片段 ,并选用细菌偏爱的密码子。用PCR方法扩增gp52蛋白基因片段。将这 2个基因片段分别克隆至同... 目的 将人巨细胞病毒PP1 50蛋白C端多肽与gp52蛋白片段融合 ,构建表达该融合蛋白的工程菌。方法 合成PP1 50蛋白C端 2 5个氨基酸的基因片段 ,并选用细菌偏爱的密码子。用PCR方法扩增gp52蛋白基因片段。将这 2个基因片段分别克隆至同一质粒pET2 8a( + )内的NcoⅠ /BamHⅠ和BamHⅠ /EcoRⅠ位点 ,使两者串联在一起 ,并且翻译框架一致 ,可表达 1个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌 ,用酶切及SDS PAGE等方法筛选表达融合蛋白的工程菌。结果 构建成功了高效表达PP1 50C端多肽与gp52蛋白片段的融合蛋白工程菌 ,表达量为 3 5%左右。初步纯化获得了表达的融合蛋白。结论 初步纯化的融合蛋白能与已知的抗gp52 IgM阳性血清和抗PP1 50 IgM阳性血清反应 ,说明融合蛋白C端的gp52蛋白保持较好的抗原性 ,融合蛋白N端的PP1 50C端多肽也显示有抗原性。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 pp150蛋白 gp52蛋白 融合蛋白 基因表达
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HCMV pp150抗原基因在蚕豆中的遗传转化及鉴定
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作者 严华 李国才 +1 位作者 焦红梅 陈红菊 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1150-1154,共5页
目的研制人巨细胞病毒(HCMV)口服疫苗。方法根据HCMV基质磷蛋白PP150基因序列设计引物,PCR法从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码PP150抗原决定簇区域的基因片段。将Kozak序列插入pp150基因的起始密码子的上游,3′端引入了内质网滞留信... 目的研制人巨细胞病毒(HCMV)口服疫苗。方法根据HCMV基质磷蛋白PP150基因序列设计引物,PCR法从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码PP150抗原决定簇区域的基因片段。将Kozak序列插入pp150基因的起始密码子的上游,3′端引入了内质网滞留信号KDEL序列,将修饰后的基因片段克隆进载体pBI121,构建了带潮霉素(Hyg)选择抗性基因的植物表达载体pCAM- BIA1300/pp150和根癌农杆菌工程菌EHA105;采用叶盘法转化蚕豆,获得了5株抗性植株,通过PCR、Southern blot和RNA dot blot分析鉴定,确认了3株为转基因植株。通过ELISA和Western blot对这3株的蛋白萃取物进行分析,以鉴定其免疫学活性。结果这3株转基因植株表达的PP150蛋白具有免疫原活性。结论这些转基因植株为HCMV口服疫苗的研究提供了条件。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒 pp150 口服疫苗 转基因蚕豆
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巨细胞病毒pp150和gp52融合基因的克隆表达及重组蛋白的抗原性研究 被引量:3
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作者 方毅 司炳银 +1 位作者 祝庆余 张雨 《中华检验医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期365-366,共2页
关键词 pp150蛋白 gp52蛋白 人巨细胞病毒 抗原性研究 克隆表达 融合基因 重组蛋白 聚合酶链反应(PCR) 抗原决定簇 基因片段
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